Immunophenotyping av Orthotopic Homograft (Syngeneic) av Murine primære KPC bukspyttkjertelen Ductal Adenocarcinoma av flowcytometri
Summary
Den eksperimentelle prosedyren på immunophenotyping av murine orthotopic PDAC homografts tar sikte på profilering svulst immuno-microenvironment. Tumorer er orthotopically implantert via kirurgi. Svulster 200-600 mm3 størrelse var høstet og avstand for å forberede encellede suspensjoner, etterfulgt av flere immun markør FACS analyse ved hjelp av ulike fluorescently merket antistoffer.
Abstract
Homograft (syngeneic) tumorer er arbeidshesten dagens immuno-onkologi (i/u) prekliniske forskning. Svulst microenvironment (TME), spesielt immun-komponentene, er avgjørende for prognose og prediksjon av behandlingsresultater, spesielt de av immunterapi. TME immun-komponenter består av forskjellige undergrupper av svulst-infiltrere immunceller assessable av multi-farge FACS. Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) er blant de farligste malignances mangler gode behandlingstilbud, dermed et presserende og udekkede medisinske behov. En viktig årsak til den ikke-responsen på ulike behandling (kjemoterapi-, målrettet, I/O) har vært dens rikelig TME, bestående av fibroblaster og leukocytter som beskytte tumorceller fra disse behandlingsformer. Orthotopically implantert PDAC antas å mer nøyaktig gjenerobre TME av menneskelig pancreatic kreft enn konvensjonelle subcutaneous (SC) modeller.
Homograft svulster (KPC) er transplantasjon av musen spontan PDAC stammer fra genmodifiserte KPC-mus (KrasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Det primære svulst vev er skåret i små fragmenter (~ 2 mm3) og transplantert subcutaneously (SC) til syngeneic mottakerne (C57BL/6, 7-9 uker gamle). Homografts ble deretter kirurgisk orthotopically transplantert til bukspyttkjertelen nye C57BL/6 mus, sammen med SC-implantasjon, som nådde svulst mengder 300-1000 mm3 17 dager. Bare svulster på 400-600 mm3 ble høstet per godkjent obduksjon prosedyre og renset for å fjerne tilstøtende ikke-tumor vev. De var dissosiert per protokoll en vev dissociator i én celle suspensjoner, etterfulgt av flekker med angitte paneler med fluorescently-merket antistoffer for ulike markører av ulike immunceller (lymfoide, myelogen og NK, DCs). Farget prøvene ble analysert bruker multi-farge FACS til å bestemme antall immunceller av ulike linjene, samt deres relative andelen i svulster. Immun profiler orthotopic svulster ble sammenlignet med de av SC svulster. De foreløpige dataene har vist betydelig opphøyet infiltrere TILs/TAMs i svulster over bukspyttkjertelen og høyere B-celle infiltrasjon i orthotopic i stedet for SC svulster.
Introduction
Bukspyttkjertelen ductal adenocarcinoma (PDAC) fører til nesten en halv en million dødelighet verden årlig, en av de topp 5 kreft morderne. Det er noen effektive behandlingstilbud og ikke godkjente immunotherapies; Derfor trengte nye behandlinger desperat. Kreft blir stadig mer anerkjent som immunologiske sykdommer, inkludert PDAC, i tillegg til de genetiske sykdommene som kjent i dag. Immunologiske og genetiske faktorer vil trolig avgjøre sykdom prognose samt behandling resultater. Svulster unngå vert immun overvåking og til slutt fremme for å føre til døden. Mange av disse immun prosesser skjer innenfor svulst microenvironment (TME)1,2,3,4 der ulike immunceller samhandle med kreftceller, med hverandre og med andre svulst stromal komponenter, direkte eller indirekte via cytokiner som til slutt bestemmer sykdom utfallet. Derfor er karakteristikk av svulst immun komponentene TME eller svulst immunophenotyping, inkludert subtyping, numeration og lokalisering av ulike linjene av immunceller, avgjørende for å forstå anti-tumor immunitet. Ved PDAC, det har blitt foreslått at forhøyet svulst-infiltrere undertrykkende makrofager (TAM) og B-celler har ført til forebygging av T-celle infiltrasjon og/eller aktivisering og høye nivåer av fibrosis5,6.
Den felles tilnærmingen til undersøker immun TMEs eksperimentelt ville være å bruke surrogat svulst prekliniske dyremodeller, hovedsakelig relevante musen svulst modeller7, spesielt musen syngeneic (homograft) eller genmodifisert musen modeller (GEMM) av kreft, på antatt likheten av mus og menneskelige for svulster og immunitet8,9. Det er forstått i virkeligheten at det er iboende forskjellene mellom de to arter10,11.
Transplantert musen tumorer har betydelig operativ fordeler fremfor spontan svulster7, nemlig synkronisert tumor utvikling, i motsetning til foreldre GEMM spontan tumor utvikling. Homografts av spontane murine svulster anses primære tumorer har aldri vært manipulert i vitroog speiling opprinnelige mus svulst histo- / molekylær patologi7, samt mulig immun profiler. Disse murine homografts anses ofte for å være “en mus versjon av pasient-avledede xenografts (PDXs)”. De derfor har trolig en bedre translatability enn konvensjonelle syngeneic celle linje-avledet musen svulster12. Særlig er mange homografts avledet fra bestemte GEMM der bestemte menneskelig sykdom mekanismer, f.eks kreftfremkallende driveren mutasjoner, er konstruert, og disse homografts må derfor fordeler til sin kliniske relevans. Spesielt utvikle KPC GEMM musen PDAC i 15-20 ukens av alderen, som viser morphologically menneskelig sykdom med hovedsakelig godt – til moderat-differensiert kjertel arkitektur og høyanriket stroma. Denne modellen viser også genetisk funksjoner av menneskelig PDAC, nemlig Kras aktivering mutasjon og P53 tap av funksjon, som oppstår i 90% og 75% av human PDAC, henholdsvis5,6.
Områder av transplantasjon har også blitt foreslått for å spille en rolle i modellen translatability. Bestemt vev omgivelsene, for eksempel et tilsvarende orthotopic miljø, kan være en nisje for bestemte svulstene fremgang, i motsetning til uniform subcutaneous (SC) miljøer for ofte transplantert svulster. Det ville være av spesiell interesse hvis, og/eller, hva forskjell eksisterer mellom to transplantasjon områder, immun-microenvironment og relevansen til menneskelig kreft, f.eks. ved PDAC.
En av de viktigste aspektene av immun profilering, eller immunophenotyping, er å bestemme svulst-infiltrere immunceller av ulike linjene, tallene, relative andelen i svulster, samt aktivisering stater og steder. Dette inkluderer svulst-infiltratrating lymphoctyes (TILs, både T- og B-), tumor-infiltrere makrofager (TAMs), tumor-infiltrere naturlige drepe celler (NKs) og svulst-resident dendrittiske celler3,13,14 , 15 , 16 , 17og den subcellular lokaliseringen av visse celler18,19,20, etc. Fluorescens aktivert celle sortering (FACS) eller flow cytometri er en enkeltcelle registreringsteknologien som vanligvis brukes til å måle de spesifikke parameterne i en celle. Multi-farge flyt cytometri måler flere indikatorer på en enkelt celle3,4,21 , og er den mest brukte metoden for å bestemme tallene og relative andelen av forskjellige undergrupper av immunceller, inkludert de i svulster.
Denne rapporten beskriver fremgangsmåter for profilering svulst-infiltrere immunceller: 1) implantering av orthotopic PDAC musen svulst homografts, sammen med SC implantasjon; 2) tumor vev harvest og enkelt celle forberedelse via svulst avstandtagen; 3) flyt cytometri analyse av alle cellene stammer fra svulster som grunnlinjen; 4) sammenligning av planlagte profiler av begge transplantasjon tilnærminger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om studier med SC svulster er mer gjennomført, kan orthotopically implantert svulster modeller potensielt være mer relevant for prekliniske farmakologi studier (spesielt I/O undersøkelser) å gi forbedret translatability. Denne rapporten tar sikte på å hjelpe interesserte lesere/publikum å visualisere direkte teknisk prosedyrer som kan brukes i deres respektive forskning. Våre protokoller viser at orthotopic implantering av PDAC kan føre til effektiv tumor vekst, ligner på SC implantasjon. Våre observasjon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Jody Barbeau – for kritisk lesing og redigering av manuskriptet, og takke Ralph Manuel utforme kunstverk. Forfatterne vil også gjerne takke Crown Bioscience onkologi Immuno-onkologi biomarkør team og onkologi I Vivo team, for deres store teknisk innsats.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
