Summary
Vi præsenterer her, en protokol til at bestemme protease specificitet i rå mus væv ekstrakter bruger MALDI-TOF-massespektrometri.
Abstract
Proteaser har flere biologiske funktioner, herunder protein Aktivering/inaktivering og fødevarer fordøjelse. At identificere protease specificitet er vigtigt for at afsløre protease funktion. Den metode, der foreslås i denne undersøgelse bestemmer protease specificitet ved at måle molekylvægt af unikke substrater ved hjælp af Matrix assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri. Substraterne indeholder iminobiotin, mens webstedet kløvet består af aminosyrer, og spacer består af polyethylen glycol. Kløvet underlaget vil generere en unik Molekylær vægt ved hjælp af en kløvet aminosyre. En af fordelene ved denne metode er at det kan gennemføres i en gryde ved hjælp af rå prøver, og det er også velegnet til vurdering af flere prøver. I denne artikel vil beskrive vi en simpel eksperimentelle metode optimeret med prøver udvundet fra mus lungevæv, herunder væv udvinding, placering af fordøjelsessystemet substrater til prøver, oprensning fordøjelsessygdomme underlag under forskellige pH betingelser , og måling af substrater Molekylær vægt ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri. I Resumé, denne teknik giver mulighed for identifikation af protease specificitet i rå prøver stammer fra væv ekstrakter bruger MALDI-TOF-massespektrometri, som kan let skaleres til flere prøve behandling.
Introduction
Proteaser regulere fysiologiske processer ved holde proteiner, og indledningen af protease aktivitet på bestemte tidspunkter og steder er reguleret1. Det er derfor vigtigt at identificere udtryk og aktivitet af væv, der reguleres lokalt og udvikle en ny metode til at registrere proteaser. Metoden, der foreslås i denne undersøgelse har til formål at identificere protease specificitet i parallel til at afsløre proteaser.
Der er nogle metoder til påvisning af protease specificitet. Metoden azocasein er kendt for sin brug i påvisning af proteaser2 men er begrænset i sin evne til at indhente yderligere oplysninger. Zymography er en anden omfattende protease påvisningsmetode, der kan bruges til at bestemme molekylvægt af proteaser3, men det kan ikke bruges til at undersøge substrat specificitet. Protease specificitet kan bestemmes af spektrometrisk assays, ved hjælp af substrater såsom p-nitroanilide4, og fluorometriske assays, ved hjælp af cumarin substrater5 eller fluorescens resonans energi overføre (FRET) assays6. Disse metoder aktiverer single-specificitet påvisning af substrater indeholdt i en enkelt brønd. I den foreliggende undersøgelse undersøges protease specificiteten af væv ekstrakter under forskellige betingelser, som disse ekstrakter indeholder flere proteaser. Protease aktivitet er reguleret af flere faktorer, herunder pH, coenzymer, prostetiske grupper og ion styrke. For nylig, proteomics-baserede metoder har været anvendt til at identificere protease specificitet; for eksempel, den metode, der er rapporteret af Biniossek mfl. 7 bruger proteomet til at bestemme substrat specificitet selv i rå ekstrakter og giver mulighed for præcis bestemmelse af kavalergang aktivitet af proteaser, der genkender flere aminosyre-sekvenser8. Men denne metode er ikke egnet for analysen af mange prøver. I modsætning hertil vores metode giver samtidig behandling af flere prøver, og brug af Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF) massespektrometri for analysen muliggør hurtig og nem opdagelse af den kløvet substrater.
Dette papir beskriver en metode til at vurdere protease specificitet ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri til at måle molekylvægt af unikke substrater. De molekylære former for kløvet substrater, sammen med deres teoretiske Molekylær vægte, er vist i figur 1 og tabel 1. Tidligere undersøgelser har brugt substrater indeholdende polyglycine spacere og biotin9; men disse substrater er mangelfuldt, fordi polyglycine sekvens kan kløves af enzymer, der anerkender glycin sekvensen. Derudover kan høj affinitet mellem begærlighed og biotin føre til en lav inddrivelsessats. At forbedre disse ulemper, i denne undersøgelse vi syntetiseret et unikt underlag, som var sammensat af polyethylenglycol (PEG), iminobiotin og en aminosyre, der kunne identificere kavalergang websted (figur 1). For at skelne mellem aminosyrer af lignende Molekylær vægte, blev D-Serin tilføjet mellem PIND spacer og aminosyre på webstedet kløvet.
N-terminalen af substratet var mærket med iminobiotin, som muliggør affinitet rensning fra rå prøver. Brug af iminobiotin i stedet for biotin er kritisk. Biotin har en stærk affinitet med begærlighed, hvilket resulterer i lav genfindingsprocent biotin-mærket underlag fra begærlighed harpiks, mens iminobiotin's affinitet for begærlighed kan ændres af pH. Iminobiotin-mærket substrater vil binde sig til begærlighed i betingelserne ovenfor pH 9, mens begærlighed frigiver iminobiotin-mærket substrater i betingelser under pH 4. Derfor blev iminobiotin brugt til affinitet rensning10. I Resumé beskriver vi en detaljeret protokol til påvisning af protease specificitet ved hjælp af unikke substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animalske eksperimentelle protokoller blev godkendt af Nihon farmaceutiske Universitet etiske komité og udføres i overensstemmelse med retningslinjerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af Nihon farmaceutiske Universitet. Protokollen er blevet justeret for væv uddrag stammer fra ICR mus. ICR mus blev købt fra Nippon SLC Ltd (Shizuoka, Japan)
1. forberedelse af Iminobiotin-mærket substrat
Substratet gennemgår fast-fase syntese ved hjælp af 9-fluorenylmethyloxycarbonyl gruppe (Fmoc)-beskyttet aminosyrer som beskrevet under11. Brug tabel 2 at bestemme Fmoc-sammensatte bruges, afhængigt af den ønskede aminosyre og stadium af syntese.
- Skylle 0,2 g af Fmoc-NH-SAL harpiks med 10 mL med N, N-dimethylformamid (DMF) i en syntese kolonne.
- Der tilsættes 5 mL 30% Piperidin i DMF. Rock løsning i 10 min at kløve gruppen Fmoc.
-
Fmoc spaltning med trinitrobenzenesulfonic syre (TNBS) test12: tilføje 10 µL af 1% TNBS i DMF og 10 µL af diisopropylethylamine (DIPEA) til en 10 x 75 mm2 glasrør, så overføre en lille mængde af resin til glas rør. Fmoc-kløvet harpiks bør udvikle en orange farve.
- Gentag trin 1.2-1.3, hvis resultatet er negativt.
- Vask harpiks tre gange med 5 mL DMF.
-
Tilføj 5 mL DMF indeholdende 0,3 mmol af Fmoc-stof, der er anført i tabel 2 (begyndende med stoffet anvendes i fase 1), 0,3 mmol af O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU), 0,3 mmol 1- Hydroxy-1H-benzotriazole, monohydrat (HOBt) og 0,6 mmol af diisopropylethylamine (DIPEA). Rock løsning for 30 min til par den med harpiks.
- Check dette trin med TNBS test. Hvis resultatet er positivt, betyder det reaktionen ikke har tilstrækkeligt udviklet sig og dette skridt skal gentages.
- Vask harpiks tre gange med 5 mL DMF.
- Gentag brudforlængelse reaktion ved at gentage trin 1,2-1,6, skiftende Fmoc-sammensatte bruges i trin 1.5 i tabel 2.
- Der tilsættes 1 mL 2,5% vand, 1% triisopropylsilane (TIS) og 2,5% ethanedithiol (EDT) i trifluoreddikesyre at kløve peptider fra grupperne harpiks og beskyttelse. Rock løsning til 60 min.
- Filtrer, og saml filtratet i et 50 mL reagensglas.
- Tilsættes 40 mL koldt diethyletheren ethanol og butik natten over ved-20 ° C.
- Centrifuge 4.000 x g ved-20 ° C i 30 min. indsamle pellet.
- Bruge en ekssikkator til 3 h til diethyletheren afdampes.
- Der tilsættes 1 mL 50% acetonitril til vand og opløse de rå peptider. Lyophilize løsning for at fjerne trifluoreddikesyre. Gentag dette trin, flere gange.
-
Rense peptider ved hjælp af en C18 patron kolonne.
- Aktivere harpiks i kolonnen C18 patron med 3 mL acetonitril (ACN).
- Reagensglasset med 5 mL 5% ACN, 0,1% TFA i H2O.
- Indlæse de rå syntetiske peptider i kolonnen C18 patron.
- Skylles med 10 mL 5% ACN, 0,1% TFA i H2O.
- Elueres prøver med 3 mL 60% ACN, 0,1% TFA i H2O.
-
Tjek peptider ved at måle deres Molekylær vægt ved hjælp af MALDI-TOF-massespektrometri.
- Der afpipetteres 1 µL af elueringsvæsken på en target plade. Straks tilføje mættede α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) løsning i 50% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre
- Krystallisere blandingen af luft-tørring.
- Erhverve massespektre af prøverne efter instrumentets fabrikant protokol.
- Manuelt indstille MALDI-TOF massespektrometer til en positiv afspejler tilstand.
- Kalibrere massespektrometer ved hjælp af CHCA, bradykinin fragment 1-7 (monoisotopic molekylvægt = 756.3997 Da), og angiotensin II (monoisotopic molekylvægt = 1,045.5423 Da).
- Erhverve massespektre af syntetiske peptider, og derefter evalueres ved at sammenligne den med den teoretiske molekylvægt.
2. forberedelse af væv uddrag
- Bedøver mandlige ICR mus i en isofluran indånding kammer og kontrollere anæstesi dybde via toe knivspids. Aflive mus af cervikal dislokation.
- Brug saks, lave en midterlinjen abdominal snit gennem huden strækker sig op til formet som et sværd proces.
- Skære igennem mellemgulvet og indsamle alle lungevæv. Skære væv i små stykker.
- Vask væv tre gange med iskold 50 mM Tris-bufferet saltvand (pH 7,4).
- Veje væv og overførsel omkring 100 mg af væv til en 12 x 75 mm2 glasrør.
- Der tilsættes 0,3 mL ekstraktionsbuffer (50 mM Tris-buffer, pH 7,4, der indeholder 0,1% poly (oxyethylen) octylphenyl ether).
-
Homogeniseres lunge vævsprøver ved hjælp af en blanding homogeniseringsapparat.
- Cool prøver på is.
- Homogeniseres prøver på 20.000 rpm til 30 s i en blender. Gentag dette trin, indtil prøverne er fuldstændig homogene.
Bemærk: Ikke homogeniseres i mere end 1 minut kontinuerligt, for at undgå en stigning i temperaturen.
- Overføre 1.000 µL af homogenatet til en 1,5 mL rør og centrifugeres i 5 min på 10.000 x g ved 4 ° C.
- Overføre 500 µL af supernatanten til en ny 1,5 mL plastikrør.
- Bruge 10 µL af prøven til bestemmelse af proteinkoncentration, ved hjælp af metoder som bicinchoninic syre (BCA) eller metoden Coomassie strålende blå (CBB).
- For at undgå frysning, tilføje 80% glycerol til prøverne til en slutkoncentration på 50% glycerol.
- Gemme prøver på-80 ° C indtil videre anvendelse.
3. fordøjelse af substrater i Model Protease og væv ekstrakter
-
Tilsæt 10 µL af 0,1 µg/µL af N-tosyl-L-phenylalanin chlormethyl keton (TPCK)-trypsin, 0,1 µg/µL af Staphylococcus aureus V8 protease eller 10 µg/µL af væv uddrag i 890 µL af en fordøjelsen buffer.
- For at tydeliggøre forskellen i protease specificitet afhængigt af pH, bruge buffere, indstillet til pH 3, 5, 7 og 9. Sammensætningen af fordøjelsen buffer er vist i tabel 3.
- Udføre en negativ kontrol bruge inaktive protease i væv ekstrakter, udarbejdet af inkubation i kogende vand (eller opvarmning til 100 ° C) i 10 min.
- Tilsæt 10 µL af iminobiotin-mærket substrater (opløst i dimethylsulfoxid (DMSO), slutkoncentration = 100 pmol/10 µL).
- Der inkuberes i 3 timer ved 37 ° C til at fordøje iminobiotin-mærket substrater.
- Efter inkubationen stop fordøjelsen af substrater med kogende vand (eller ved opvarmning ved 100 ° C) i 10 min.
- Centrifugeres de fordøjede substrater for 5 min på 10.000 x g ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten ind i en ny 1,5 mL rør.
4. rensning af Iminobiotin-mærket substrat
-
Tilsæt 50 µL af 50% streptavidin sepharose perler i 1 M Tris-buffer (pH 9) indeholdende 0,1% poly(oxyethylene) octylphenyl ether.
- Brug pH test papir til at sikre, at løsningen er omkring pH 9. Hvis pH af løsningen er lavt, skal du justere det til omkring pH 9 ved at tilføje 1 M Tris-buffer (pH 9) indeholdende 0,1% poly(oxyethylene) octylphenyl ether. Dette trin er vigtigt, da det indebærer binding af den iminobiotin-mærket substrat til streptavidin.
- Der inkuberes natten over ved 4 ° C med kontinuerlig blide blanding på en rotator hjul til at binde iminobiotin-mærket substrater til streptavidin. Perlerne bør forblive suspenderet i hele inkubation.
- Der centrifugeres i 1 minut ved 10.000 x g ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
-
Vaske perlerne fem gange som følger:
- Tilføje 1.000 µL af en vaskebuffer (50 mM Tris-buffer, pH 9) til perlerne.
- Vask i 10 min. ved 4 ° C med kontinuerlig blide blanding på en rotator hjul. Perlerne bør forblive suspenderet i hele inkubation.
- Der centrifugeres i 1 minut ved 10.000 x g ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
-
Tilføje 100 µL af 0,2% trifluoreddikesyre til perlerne.
- Brug pH test papir til at sikre, at løsningen er under pH 2. Hvis pH af løsningen er høj, Juster pH-værdien til under 2 ved at tilføje 1% trifluoreddikesyre.
- Inkuber i 30 min. ved stuetemperatur med kontinuerlig blide blanding på en rotator hjul.
- Der centrifugeres i 1 minut ved 10.000 x g ved 4 ° C, derefter overføre supernatanten til en ny 1,5 mL tube.
5. prøve forberedelse og Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight massespektrometri (MALDI-TOF-massespektrometri)
Bemærk: Alle løsninger i de følgende trin bør forberedes med højtryksvæskekromatografi (HPLC)-grade eller aminosyre sekventering-grade vand.
- Tilsæt 500 µL af acetonitril på en C18 harpiks til at aktivere den. Fjerne de anvendte acetonitril. Gentag dette trin tre gange.
- Reagensglasset C18 harpiks med 100 µL af 0,1% trifluoreddikesyre. Fjerne elueringsvæsken. Gentag dette trin tre gange.
- For at indlæse prøverne, bind prøverne til harpiks, der ved hjælp af en pipette.
- Vask harpiks med 20 µL af 0,1% trifluoreddikesyre. Gentag dette trin fem gange.
- Elueres prøver med 3 µL af 60% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre. Der afpipetteres elueringsvæsken på en target plade for MALDI-TOF-massespektrometri. Straks tilføje mættede α-cyano-4-hydroxycinnamic syre (CHCA) løsning i 50% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre.
- Krystallisere blandingen af luft-tørring.
-
Erhverve massespektre af prøverne efter instrumentets fabrikant protokol.
- Manuelt indstille MALDI-TOF massespektrometer til en positiv afspejler tilstand.
- Kalibrere massespektrometer ved hjælp af CHCA, bradykinin fragment 1-7 (monoisotopic molekylvægt = 756.3997 Da), og angiotensin II (monoisotopic molekylvægt = 1,045.5423 Da).
- Erhverve massespektre af prøver, betaler meget opmærksom på de massespektre fra 700 til 900 Da for kløvet form af biotin-mærket substrater.
- Identificere de fundne toppe ved hjælp af tabel 1. Påvisning af passende molekylvægt angiver kavalergang på C-terminus af den pågældende aminosyre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluering af metoden til identifikation af protease specificitet af model protease
Effektiviteten af dette system blev evalueret ved hjælp af TPCK-trypsin og V8 protease, hvis underlaget særpræg blev indhentet. TPCK-trypsin og V8 protease blev anslået til at kløve aminosyresekvensen i C-terminalen af Lysin og arginin rester og på carboxy side af asparaginsyre og Glutaminsyre restprodukter, henholdsvis. Tabel 1 viser den teoretiske molekylvægt af substratet og fordøjet fragmenter kløvet af specifikke proteaser. Substrat fordøjelsen ved hjælp af TPCK-trypsin fremstillet kløvet fragmenter, hvoraf to kunne påvises på 839.81 Da og 796.76 Da (figur 2A). Molekylær vægt af disse fragmenter var nøje i overensstemmelse med den teoretiske Molekylær vægt af fragmenter kløvet fra C-terminal af Lysin og arginin, henholdsvis. Derudover konverteres V8 protease forløber substrater til deres kløvet form, med Molekylær vægt af 769.78 Da og 755.62 Da (figur 2B), som matchede den teoretiske m/z af glutaminsyre og aspartinsyre, henholdsvis. Disse resultater viser, at denne metode kan bruges til med held identificere protease specificitet med MALDI-TOF-massespektrometri.
Evaluering af substrat specificitet på forskellige pH niveauer ved hjælp af musen lunge ekstrakter
En af fordelene ved denne teknik var, at et stort antal prøver kan behandles samtidigt. Denne undersøgelse viste, at substrat specificitet ændret ifølge pH niveau (figur 3). I sure betingelser (figur 3B, pH 5) var en kløvet fragment molekylvægt 770.13 Da og 826.66 Da. Disse resultater viste, at lunge væv ekstrakt indeholdt proteaser med evnen til at kløve på C-terminus af glutaminsyre og tryptophan. Som pH niveau gradvist steget, toppene af fragmenter kløvet af glutaminsyre og tryptophan gradvist faldt, mens toppene af fragmenter kløvet af arginin og lysin gradvist øget (figur 3C, D, pH 7 og 9). Disse resultater viste, at lunge-ekstrakt indeholdt to eller flere proteaser, der havde forskellige optimale pH og kavalergang særegenheder.
Figur 1: skema til påvisning af protease specificitet. (A) iminobiotin-mærket substrat for protease specificitet struktur. (B) substraterne havde iminobiotin, en polyethylenglycol spacer og en cleavable aminosyre site. (C) spektre af iminobiotin-mærket substrater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: evaluering af metoden til at bestemme protease specificitet ved hjælp af en renset enzym. (A) spektre for iminobiotin-mærket substrater behandlet med TPCK-trypsin. De 839.81 og 796.76 toppe matchede den teoretiske molekylvægt af fragmenter genereret af kavalergang på den C-terminale side af Lysin og arginin, henholdsvis. (B) spektre for iminobiotin-mærket substrater behandlet med V8 protease. De 769.78 og 755.62 toppe matchede den teoretiske molekylvægt af fragmenter genereret af kavalergang på den C-terminale side af glutaminsyre og aspartinsyre, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: evaluering af metoden til at bestemme protease specificitet ved hjælp af væv ekstrakter. Spektre for iminobiotin-mærket substrater behandlet med en lungevæv uddrag. Disse spectra Vis toppe fås ved (A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7 og (D) pH 9. (E) iminobiotin-mærket substrater inkuberes med væv ekstrakt inaktiveres med varmebehandling til at evaluere uspecifikke fordøjelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| X | Forløber | Kløvet form |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Jeg * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| RASMUSSEN | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa form | ||
Tabel 1: den teoretiske molekylvægt af iminobiotin-mærket substrater og den forventede molekylvægt af protease fragmenter. Stjerner (*) angiver tilsætning af D-Serin mellem polyethylen spacer og den cleavable aminosyre.
| Xaa: Gly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, Leu, Asp, Localisation, Glu, hans, Phe, Arg, Tyr | |||
| Fase | Fmoc-stof | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys, Ile, Asn, Lys, mødte, Trp | |||
| Fase | Fmoc-stof | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tabel 2: Sekventielle liste af reagenser, der anvendes til substrat syntese.
| pH | sammensætning | ||
| 9 | 50 mM Tricine som indeholder 0,1 M NaCl og 10 mM CaCl2 | ||
| 7 | 50 mM Tris-HCl der indeholder 0,1 M NaCl og 10 mM CaCl2 | ||
| 5 | 50 mM natriumacetat der indeholder 0,1 M NaCl og 10 mM CaCl2 | ||
| 3 | 50 mM citronsyre som indeholder 0,1 M NaCl og 10 mM CaCl2 | ||
Tabel 3: Kompositioner af buffer løsninger anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol bruger MALDI-TOF-massespektrometri til at identificere protease specificitet i rå prøver stammer fra væv ekstrakter og kan let skaleres til flere prøve behandling. Især manipuleret vi pH for at forårsage en ændring i substrat specificitet.
Avidin-biotin komplekse (ABC) metode, som har været meget anvendt i biokemi på grund af dets bindende specificitet, blev udnyttet i vores protokol. På grund af det stærke affinitet af ABC er binding af begærlighed at biotin næsten uoprettelige. Affinitet rensning i ABCs er derfor meget ineffektiv. Af denne grund rapportere vi, at genfindingsprocenten for biotin-mærket substrater forventes at være lav. I denne undersøgelse brugte vi kun en lav pH-niveau for eluering; dog kan deglycosylated begærlighed-harpiks13 eller monomere begærlighed-harpiks14 også bruges til at rense biotin-mærket substrater.
Den metode, der foreslås i denne undersøgelse kan justeres til forskellige eksperimentelle systemer og programmer; under hensyntagen til at MALDI-TOF massespektrometer er i stand til at gennemføre kvantitativ analyse. Når substratet specificitet er fastslået, kan det være bedre at udføre kvantificering ved hjælp af spektrometrisk assays, fluorometriske assays eller fluorescens resonans energi overføre (FRET).
Kalibrering af massespektrometri var det vigtigste skridt i denne protokol. I tilfælde hvor substrater med lignende Molekylær vægt registreres, kan nøjagtigheden af resultaterne forbedres ved at tilføje molekylvægt af prækursorer.
Da enzym reaktion er forbedret med tiden, er det muligt at udvide reaktionstiden, hvis enzymet ikke kan påvises. Men at lade reaktionen fortsætte i mere end 24 h resultater i side reaktioner, der skaber uønsket toppe. Derfor er det tilrådeligt at foretage reaktion for op til 18 h eller for at kontrollere test ved hjælp af varme behandlet prøver. Denne procedure kunne bestemme protease specificitet til inden for et par femtomol af trypsin.
Afslutningsvis vil indføre vi en praktisk metode, der bruger iminobiotin-mærket substrater til at evaluere protease specificitet. Denne metode giver mulighed for samtidig behandling af flere prøver og kan bruges til at forenkle protease screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist understøttet af Nihon farmaceutiske Universitet forskning tilskud fra Nihon farmaceutiske Universitet (2016) og MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
