Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以确定蛋白酶特异性的粗鼠组织提取物使用 MALDI 的光谱。
Abstract
蛋白酶具有多种生物学功能, 包括蛋白质活化/失活和食物消化。鉴定蛋白酶特异性对揭示蛋白酶功能具有重要意义。本研究提出的方法通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI) 质谱法测定独特基质的分子量来确定蛋白酶的特异性。基体中含有 iminobiotin, 而劈裂部位由氨基酸组成, 间隔由聚乙二醇组成。被劈裂的基底将产生一个独特的分子量, 使用裂解氨基酸。该方法的优点之一是可以用粗样品在一锅中进行, 也适用于多种样品的评估。在本文中, 我们描述了一个简单的实验方法优化, 从小鼠肺组织提取的样本, 包括组织抽取, 消化基质的放置到样品, 消化基质的纯化在不同的 pH 条件下, 用 MALDI 质谱法测定基质的分子量。总之, 这项技术可以识别的蛋白酶特异性从组织提取物中获得的 MALDI 的质谱, 可以很容易地扩大到多样本处理。
Introduction
蛋白酶通过裂解蛋白质调节生理过程, 并且在特定时间和地点启动蛋白酶活性的调控1。因此, 确定局部调节组织的表达和活性是很重要的, 并开发一种新的检测蛋白酶的方法。本研究提出的方法旨在鉴别蛋白酶的特异性, 同时检测蛋白酶。
有几种检测蛋白酶特异性的方法。azocasein 方法在检测蛋白酶2中是众所周知的, 但在获取进一步信息的能力方面是有限的。酶谱法是另一种综合的蛋白酶检测方法, 可用于测定蛋白酶的分子量3, 但它不能用于检查基底特异性。蛋白酶特异性可以通过光谱分析, 使用 nitroanilide4的基质, 和荧光化验, 使用香豆素基底5或荧光共振能量转移 (烦恼) 化验6。这些方法使单个井中所含基底的单特异性检测得以实现。本研究在不同条件下考察组织提取物的蛋白酶特异性, 因为这些萃取物含有多种蛋白酶。蛋白酶活性受多种因素的制约, 包括 pH 值、辅、假体组和离子强度。近年来, 蛋白质组学方法已被用于鉴定蛋白酶特异性;例如, 由 Biniossek et al报告的方法。7使用蛋白质组来确定基材的特异性, 即使是在粗提取物中, 也可以精确地测定识别多个氨基酸序列8的蛋白酶的裂解活性。但是, 这种方法不适合对大量样品进行分析。相比之下, 我们的方法可以同时处理多个样本, 利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI) 质谱进行样品分析, 便于快速、简便地检测出基质。
本文概述了用 MALDI 质谱法测定蛋白酶特异性的方法, 以测量独特基质的分子量。在图 1和表 1中显示了被切割基底的分子形式以及它们的理论分子权重。以前的研究使用了含有 polyglycine 间隔和生物素9的基质;然而, 这些基质是有缺陷的, 因为 polyglycine 序列可能会由识别甘氨酸序列的酶所切割。此外, 亲和和生物素之间的高度亲和性可能导致回收率低。为了改善这些缺点, 我们在本研究中合成了一种独特的基质, 它由聚乙二醇 (PEG)、iminobiotin 和氨基酸组成, 它可以识别出裂解部位 (图 1)。为了区分相似分子量的氨基酸, 在 PEG 间隔与氨基酸在劈裂部位添加 d-丝氨酸。
该基板的 N 端被标记为 iminobiotin, 这使得从粗样品中进行亲和纯化。使用 iminobiotin 而不是生物素是至关重要的;生物素与亲和有很强的亲和性, 这导致亲和树脂的生物素标记基质的回收率较低, 而 iminobiotin 对亲和的亲和性可以通过 pH 值来改变。在 ph 值为9的条件下, Iminobiotin 标记的基板将绑定到亲和, 而亲和在 4 ph 值以下的条件下释放 Iminobiotin 标记的基底。因此, iminobiotin 用于亲和纯化10。总之, 我们描述了一个详细的协议, 以检测蛋白酶特异性使用独特的基质。
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Protocol
日本制药大学伦理委员会批准了动物实验协议, 并按照日本制药大学实验室动物的护理和使用指导方针进行。该协议已被调整的组织提取物从代表的小鼠。小鼠是从日本的公司购买的。
1. Iminobiotin 标记衬底的制备
基板采用 9-fluorenylmethyloxycarbonyl 基团 (芴甲氧羰基) 保护的氨基酸进行固相合成, 如下11所述。使用表 2确定所用的芴甲氧羰基化合物, 这取决于所需的氨基酸和合成阶段。
- 将0.2 克芴甲氧羰基-NH-萨尔树脂与10毫升 n-, n-甲基酰胺 (DMF) 在合成柱上。
- 在 DMF 中加入5毫升30% 哌啶。岩石的解决方案为10分钟, 以切割 n-芴甲氧羰基基团。
-
检查 n-芴甲氧羰基裂解与硝基苯酸 (TNBS) 测试12: 添加10µL 1% TNBS 在 DMF 和10µL (diisopropylethylamine) 到 10 x 75 毫米2玻璃管, 然后转移到玻璃管的少量树脂。n-芴甲氧羰基裂解树脂应发展为橙色的颜色。
- 如果此结果为负值, 请重复步骤 1.2-1.3。
- 用5毫升的 DMF 洗涤树脂三倍。
-
添加5毫升的 DMF, 其中含有0.3 毫摩尔的芴甲氧羰基化合物, 列于表 2 (从阶段1中使用的化合物开始), 0.3 毫摩尔 (6-氯-1 h benzotriazol-1 基)-n, n, n ', n-'-tetramethyluronium 六氟磷酸盐 (HCTU), 0.3 毫摩尔 1-Hydroxy-1H-benzotriazole, 一水合物 (对 hobt) 和0.6 毫摩尔 diisopropylethylamine (DIPEA)。岩石的解决方案为30分钟与树脂夫妇。
- 使用 TNBS 测试检查此步骤。如果结果是肯定的, 这意味着反应没有足够的进展, 这一步必须重复。
- 用5毫升的 DMF 洗涤树脂三倍。
- 重复步骤 1.2-1.6, 改变在步骤1.5 中使用的芴甲氧羰基化合物, 根据表 2, 重覆伸长反应。
- 在三氟乙酸酸中加入1毫升2.5% 水, 1% triisopropylsilane (TIS) 和 2.5% ethanedithiol (EDT), 以从树脂和保护基团中切割多肽。岩石解决方案为60分钟。
- 过滤, 并收集滤液在一个50毫升管。
- 加入40毫升的冷二乙醇, 并在-20 摄氏度隔夜贮存。
- 离心机 4000 x g 在-20 °c 为30分钟收集颗粒。
- 用干燥 3 h 去除二乙基醚。
- 加入1毫升50% 乙腈水, 溶解粗肽。Lyophilize 去除三氟乙酸酸的溶液。重复此步骤几次。
-
使用 C18 墨盒柱纯化多肽。
- 使用3毫升乙腈 (ACN) 激活 C18 墨盒柱上的树脂。
- 平衡与5毫升 5% ACN, 0.1% TFA 在 H2O。
- 将粗合成肽装入 C18 墨盒柱中。
- 用10毫升 5% ACN, 0.1% TFA 在 H2O 洗涤。
- 洗脱3毫升 60% ACN, 0.1% TFA 在 H 2 O 中的样品.
-
用 MALDI 质谱法测定其分子量, 检查肽的含量。
- 在靶板上用吸管1µL 淋洗。在50% 乙腈中立即加入饱和α氰基-4-肉桂酸 (CHCA) 溶液, 0.1% 三氟乙酸酸
- 空气干燥使混合物结晶。
- 根据仪器制造商的协议获取样品的质谱。
- 手动将 MALDI 质谱仪设置为正反射模式。
- 用 CHCA、缓激肽片段 1-7 (monoisotopic 分子量 = 756.3997 Da) 和血管紧张素 II (monoisotopic 分子量 = 1045.5423 Da) 校准质谱仪。
- 获得合成肽的质谱, 然后通过与理论分子量的比较进行评价。
2. 组织提取物的制备
- 麻醉在异氟醚吸入腔内的雄性小鼠, 并通过脚趾捏检查麻醉深度。弄死颈椎脱位对小鼠进行了实验。
- 使用剪刀, 使中线腹部切口通过皮肤延伸到剑突过程。
- 切开隔膜, 收集所有肺组织。把纸巾切成小块。
- 用冰冷的50毫米三缓冲盐水冲洗组织三次 (pH 7.4)。
- 重量的组织和转移约100毫克的组织到 12 x 75 毫米2玻璃管。
- 加入0.3 毫升的萃取缓冲器 (50 毫米三缓冲器, pH 7.4, 含0.1% 聚 (oxyethylene) 对辛醚)。
-
用混合均质器融汇肺组织样品。
- 把样品放在冰上冷却。
- 融汇的样品在 2万 rpm 三十年代在搅拌机。重复此步骤, 直到样品完全均匀。
注: 不要连续融汇超过1分钟, 以避免温度升高。
- 将匀浆1000µL 到1.5 毫升管和离心机5分钟, 在 1万 x g 处4摄氏度。
- 将上清的500µL 转移到一个新的1.5 毫升塑料管上。
- 使用10µL 的样品, 以确定蛋白质浓度, 使用的方法, 如二辛可宁酸 () 或考马斯灿烂的蓝色 (CBB) 方法。
- 为防止冷冻, 在样品中加入80% 甘油, 最终浓度为50% 甘油。
- 将样品保存在-80 摄氏度, 直到进一步使用。
3. 蛋白酶和组织提取物中基质的消化
-
添加10µL 0.1 µg/µL 的 n-甲苯磺酰基-l-苯丙氨酸氯甲基酮 (TPCK)-胰蛋白酶, 0.1 µg/µL 金黄色葡萄球菌 V8 蛋白酶, 或10µg/µL 的组织提取成890µL 的消化缓冲。
- 为了澄清蛋白酶特异性的差异取决于 ph 值, 使用缓冲调整到 ph 值 3, 5, 7 和9。消化缓冲的组成在表 3中显示。
- 用非活性蛋白酶在组织提取物中进行阴性对照, 在沸水中孵化 (或加热100摄氏度) 进行10分钟。
- 添加10µL 的 iminobiotin 标记基底 (溶解在二甲基亚砜 (亚砜), 最终浓度 = 100 pmol/10 µL)。
- 孵育3小时在37°c 消化 iminobiotin 标记的底物。
- 孵化后, 用沸水停止底物的消化 (或以100摄氏度加热) 10 分钟。
- 在4摄氏度的 1万 x g 处离心消化基质5分钟。
- 将上清液转移到新的1.5 毫升管中。
4. Iminobiotin 标记衬底的纯化
-
添加50µL 50% 链亲和素琼脂糖珠在1米三缓冲 (pH 9) 包含0.1% 聚 (oxyethylene) 对辛醚。
- 使用 ph 值测试纸确保溶液在 ph 值9左右。如果溶液的 ph 值较低, 则通过加入1米的三缓冲 (ph 9) (含0.1% 聚 (oxyethylene) 对辛醚), 将其调整到大约 ph 值9。这一步很重要, 因为它涉及到将 iminobiotin 标记的基板绑定到链亲和素。
- 在4°c 一夜之间孵化, 在旋转轮上连续的温和混合, 将 iminobiotin 标记的基板绑定到链亲和素。在孵化过程中, 珠子应该保持悬浮状态。
- 离心机为1分钟在 1万 x g 在4°c。移除上清。
-
洗涤珠五倍如下:
- 添加1000µL 的洗涤缓冲器 (50 毫米的三缓冲器, pH 9) 的珠子。
- 清洗10分钟在4°c 与连续温和的混合在一个转子车轮上。在孵化过程中, 珠子应该保持悬浮状态。
- 离心机为1分钟在 1万 x g 在4°c 和去除上清。
-
添加100µL 0.2% 三氟乙酸酸的珠子。
- 使用 ph 值测试纸确保溶液低于 pH 值2。如果溶液的 ph 值高, 则通过加入1% 三氟乙酸酸将 ph 值调整到低于2。
- 在室温下孵育30分钟, 在旋转轮上连续温和搅拌。
- 离心机为1分钟在 1万 x g 在4°c, 然后转移上清到一个新的1.5 毫升管子。
5. 样品制备和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 (MALDI 质谱)
注: 以下步骤中的所有解决方案均应采用高效液相色谱 (HPLC) 级或氨基酸序级水来制备。
- 将乙腈500µL 到 C18 树脂上活化。取出二手乙腈。重复此步骤三次。
- 平衡 C18 树脂, 100 µL 0.1% 三氟乙酸酸。删除淋洗。重复此步骤三次。
- 要装载样品, 用吸管将样品与树脂粘合。
- 用20µL 0.1% 三氟乙酸酸清洗树脂。重复此步骤五次。
- 洗脱样品与3µL 60% 乙腈在0.1% 三氟乙酸酸。将淋洗在靶板上进行 MALDI 质谱测定。立即加入饱和α氰基-4-肉桂酸 (CHCA) 溶液在50% 乙腈0.1% 三氟乙酸酸。
- 空气干燥使混合物结晶。
-
根据仪器制造商的协议获取样品的质量谱。
- 手动将 MALDI 质谱仪设置为正反射模式。
- 用 CHCA、缓激肽片段 1-7 (monoisotopic 分子量 = 756.3997 Da) 和血管紧张素 II (monoisotopic 分子量 = 1045.5423 Da) 校准质谱仪。
- 获取样品的质谱, 密切关注质谱从700到 900 Da 为生物素标记基质的劈裂形式。
- 使用表 1标识检测到的峰值。适当分子量的检测表明, 在相关氨基酸的 C 终点处有裂解。
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Representative Results
模型蛋白酶鉴定蛋白酶特异性方法的评价
利用 TPCK 胰蛋白酶和 V8 蛋白酶对该系统的效率进行了评价, 得到了基体的特异性。TPCK-胰蛋白酶和 V8 蛋白酶被估计为在赖氨酸和精氨酸残留物的 C 末端, 以及天门冬氨酸和谷氨酸残留物的羧基端, 分别对氨基酸序列进行劈裂。表 1显示了基板的理论分子量和由特定蛋白酶劈裂的消化片段。基片消化使用 TPCK-胰蛋白酶产生的切割碎片, 其中两个可以检测到 839.81 da 和 796.76 da (图 2A)。这些片段的分子量与赖氨酸和精氨酸 C 末端的片段的理论分子权重密切相关。此外, V8 蛋白酶将前体基质转化为其劈裂形态, 其分子量为 769.78 da 和 755.62 da (图 2B), 分别与谷氨酸和天门冬氨酸的理论 m-/z 相匹配。结果表明, 该方法可用于 MALDI 质谱法成功识别蛋白酶特异性。
用小鼠肺提取物评价不同 pH 值的基质特异性
这种技术的优点之一是可以同时处理大量的样品。这项研究表明, 基底特异性改变了根据 pH 值 (图 3)。在酸性条件下 (图 3B; pH 值为 5), 切割片段的分子量为 770.13 da 和 826.66 da。这些结果表明, 肺组织提取物中含有蛋白酶, 能够在谷氨酸和色氨酸的 C 终点进行劈裂。随着 ph 值的逐渐增加, 谷氨酸和色氨酸裂解的碎屑的峰值逐渐减少, 而精氨酸和赖氨酸的片段峰值逐渐增加 (图 3C、D; pH 值7和 9)。这些结果表明, 肺提取物含有两个或更多的蛋白酶, 具有不同的最佳 pH 值和裂解特异。
图 1: 用于检测蛋白酶特异性的模式.(A) 用于蛋白酶特异性的 iminobiotin 标记基底的结构。(B) 基质有 iminobiotin、聚乙二醇间隔和裂解氨基酸部位。(C) iminobiotin 标记基底的光谱。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 评估使用纯化酶测定蛋白酶特异性的方法.(A) 用 TPCK 胰蛋白酶处理的 iminobiotin 标记基底的光谱。839.81 和796.76 峰分别与赖氨酸和精氨酸的 C 末端侧裂产生的碎片的理论分子量相匹配。(B) 用 V8 蛋白酶处理的 iminobiotin 标记基质的光谱。769.78 和755.62 峰分别与谷氨酸和天门冬氨酸 C 末端侧的裂解产生的碎片的理论分子量相匹配。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 使用组织提取物测定蛋白酶特异性的方法的评价.用肺组织提取物治疗 iminobiotin 标记基底的光谱。这些光谱显示在 (A) ph 值为3、(B) ph 值5、(C) ph 值7和 (D) ph 值9中获得的峰值。(E) iminobiotin 标记的基底与组织提取物进行热处理灭活, 以评估非特异消化。请单击此处查看此图的较大版本.
| X | 前兆 | 切割形式 |
| G | 886.58 | 697.58 |
| 一个 | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C | 1003.57 | 814.57 |
| 我 | 1013.64 | 824.64 |
| 我 | 942.64 | 753.64 |
| N | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| 问 | 957.62 | 768.62 |
| K | 1028.65 | 839.65 |
| 电子邮件 | 958.60 | 769.60 |
| M | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Xaa 形式 | ||
表 1: iminobiotin 标记基质的理论分子量和蛋白酶片段的预期分子量.星号 (*) 表示在聚乙烯间隔和裂解氨基酸之间加入 d-丝氨酸。
| Xaa: 甘, 阿拉巴马州, 爵士, Pro, 瓦尔,, 列伊, Asp, Gln, 谷氨酸, 他, 菲尔, Arg, Tyr | |||
| 阶段 | n-芴甲氧羰基化合物 | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | n-芴甲氧羰基 Xaa-哦 | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: 胱氨酸, 微笑, Asn, 赖氨酸, 会见, 跨国激进党 | |||
| 阶段 | n-芴甲氧羰基化合物 | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | n-芴甲氧羰基 Xaa-哦 | ||
| 3 | n-芴甲氧羰基 D 系列 (tBu)-哦 | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
表 2: 用于基板合成的试剂的顺序列表。
| Ph | 组成 | ||
| 9 | 50毫米 Tricine 含0.1 米氯化钠和10毫米 CaCl2 | ||
| 7 | 50毫米三盐酸盐, 含0.1 米氯化钠和10毫米 CaCl2 | ||
| 5 | 50毫米醋酸钠, 含0.1 米氯化钠和10毫米 CaCl2 | ||
| 3 | 50毫米柠檬酸, 含0.1 米氯化钠和10毫米 CaCl2 | ||
表 3: 使用的缓冲解决方案的组成。
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Discussion
本协议采用 MALDI 质谱法对组织提取物中的粗样品中的蛋白酶特异性进行识别, 并可方便地进行多样本加工。特别是, 我们操纵 pH 值导致基材特异性的改变。
亲和生物素复合物 (ABC) 方法在生物化学中得到了广泛应用, 其结合特异性, 在我们的协议中得到了应用。由于 ABC 的强烈亲和力, 亲和对生物素的约束几乎是不可逆转的。因此, 对 abc 的亲和纯化效率极低。因此, 我们报告说, 生物素标记的基质的回收率是低的。在本研究中, 我们只用低 pH 值洗脱;然而, deglycosylated 亲和树脂13或单体亲和树脂14也可用于纯化生物素标记的基质。
本研究提出的方法可以根据不同的实验系统和应用进行调整;铭记 MALDI 质谱仪无法进行定量分析。一旦确定了基材的特异性, 就可以更好地使用光谱测定法、荧光分析仪或荧光共振能量转移 (烦恼) 进行量化。
质谱的标定是本协议中最重要的一步。如果检测到类似分子量的基底, 则可以通过增加前体的分子质量来改善结果的准确性。
由于酶反应随着时间的推移而增强, 如果酶检测不到, 就有可能延长反应时间。然而, 让反应持续超过 24 h 结果的副作用, 产生不希望的峰值。因此, 最好进行18小时的反应, 或者用热处理样品来控制测试。这一过程可以确定蛋白酶特异性在少数 femtomol 的胰蛋白酶。
最后, 我们引入了一种方便的方法, 使用 iminobiotin 标记的基质来评价蛋白酶特异性。这种方法允许同时处理多个样品, 并可用于简化蛋白酶筛选。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作部分是由日本制药大学的日本制药大学研究补助金 (2016) 和下个 KAKENHI 赠款号 JP17854179 资助的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
