Summary
Здесь мы представляем протокол определить специфику протеазы в сырой мыши ткани экстрактов с помощью MALDI-TOF спектрометрии.
Abstract
Протеаз имеют несколько биологических функций, включая активации/дезактивации и продовольствия переваривания белка. Выявление специфики протеазы имеет важное значение для выявления протеазы функции. Метод, предложенный в настоящем исследовании определяет специфику протеазы, измеряя молекулярная масса уникальных субстратов с помощью матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии. Субстраты содержат иминобиотин, а рассеченного сайт состоит из аминокислот и разделитель состоит из полиэтиленгликоля. Расколотые субстрат будет генерировать уникальный молекулярный вес с помощью рассеченного аминокислоты. Одним из достоинств данного метода является, что он может осуществляться в одном горшке с использованием сырой образцов, и он подходит также для оценки нескольких образцов. В этой статье мы опишем простой экспериментальный метод, оптимизированные с образцами, извлеченные из мыши легочной ткани, включая добычу ткани, размещение пищеварительной субстратов в образцы, очищение пищеварительной субстратов в условиях различных рН и измерение субстратов молекулярный вес с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Таким образом эта техника позволяет для выявления специфики протеазы в сырой образцов, полученных из тканей экстрактов с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF, который легко может быть расширена для обработки нескольких образцов.
Introduction
Протеаз регулировать физиологические процессы раскалыванием белков, и начало деятельности протеазы в определенное время и местах регулируется1. Поэтому важно определить выражение и активность тканей, которые регулируются на местном уровне и разработать новый метод для обнаружения протеаз. Предлагаемый метод в это исследование направлено на выявление специфики протеазы параллельно для обнаружения протеаз.
Есть несколько методов для обнаружения протеазы специфичности. Метод azocasein well-known для его использования в обнаружении протеаз2 , но ограничены в своей способности для получения дополнительной информации. Зимография является еще одним методом обнаружения всеобъемлющей протеазы, который может использоваться для определения молекулярная масса протеаз3, но он не может использоваться для изучения субстратная специфичность. Специфика протеазы может определяться спектрометрический анализы, используя субстратов, например4p-nitroanilide и флуориметрический анализов, используя кумарин субстратах5 или анализов флуоресценции передачи энергии резонанса (ЛАДА)6. Эти методы позволяют сингл специфичность обнаружения субстратов, содержащихся в одной скважине. В настоящем исследовании специфика протеазы ткани экстрактов рассматривается в различных условиях, как эти экстракты содержат несколько протеаз. Протеазы деятельность регулируется рядом факторов, включая рН, коферменты, протезно групп и ионная сила. Недавно на основе протеомики методы были использованы для выявления специфики протеазы; например метод сообщает Biniossek и др. 7 использует протеома для определения субстратная специфичность даже в сырой экстрактов и позволяет точное определение расщепления активности протеаз, которые признают несколько аминокислотных последовательностей8. Однако этот метод не подходит для анализа многочисленных образцов. В противоположность этому, наш метод позволяет одновременной обработки нескольких образцов, а также использование Matrix-Assisted лазерной десорбции/ионизации время полета (MALDI-TOF) масс-спектрометрии для анализа проб облегчает быстрое и простое обнаружение рассеченного субстраты.
Этот документ описывает метод для оценки специфика протеаз с помощью масс-спектрометрия MALDI-TOF для измерения молекулярной массой уникальных субстратов. Молекулярные формы рассеченного субстратов, а также их теоретической молекулярным весом, показаны на рисунке 1 и в таблице 1. Предыдущие исследования использовали субстраты, содержащие polyglycine прокладки и биотин9; Однако эти субстраты ошибочны, потому что polyglycine последовательности может быть расщепляется ферментами, которые признают глицин последовательности. Кроме того высокое сродство между авидином и биотина может привести к низкой восстановления курса. Чтобы улучшить эти недостатки, в этом исследовании мы синтезированных уникальный субстрат, который состоит из полиэтиленгликоля (PEG), иминобиотин и аминокислоты, которые могли бы идентифицировать расщепления сайта (рис. 1). Чтобы различать аминокислоты подобными молекулярными весами проникли, D-Серина был добавлен между PEG распорку и аминокислот на объекте рассеченного.
N-терминальный субстрата было названо с иминобиотин, который позволяет очищение сродства от сырой образцов. Использование иминобиотин вместо биотин является критически важным; биотин имеет сильное сродство с авидин, что приводит к низкой восстановления ставок биотин меченых субстратов из авидин смолы, в то время как иминобиотин в сродство для авидин может быть изменено, рН. Иминобиотин меченых субстратов будет привязан к авидин в условиях выше pH 9, в то время как авидин выпускает иминобиотин меченых субстратов в условиях ниже рН 4. Таким образом иминобиотин был использован для очищения сродства10. В целом мы описываем подробный протокол для выявления специфики протеазы, с использованием уникальных субстратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животных экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом фармацевтического университета Нихон этики и осуществляется в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных фармацевтического университета Нихон. Протокол был скорректирован для ткани экстракты, полученные от мышей МГП. МГП мышей были приобретены от Nippon SLC Ltd. (Сидзуока, Япония)
1. подготовка субстрата иминобиотин меченых
Субстрат проходит Твердофазный синтез с использованием 9-fluorenylmethyloxycarbonyl группы (Fmoc)-защищенные аминокислоты, как описано ниже11. Таблица 2 использование для определения Fmoc соединения используются в зависимости от желаемого amino acid и этап синтеза.
- Ополосните 0.2 g с 10 мл n, N-Диметилформамид (DMF) в столбце синтез Fmoc-NH-Сал смолы.
- Добавьте 5 мл 30% пиперидина в DMF. Рок-решение для 10 мин до прилепится группе Fmoc.
-
Проверьте Fmoc расщепления с trinitrobenzenesulfonic кислотой (ТНБ) тест12: добавить 10 мкл 1% ТНБ в DMF и 10 мкл diisopropylethylamine (DIPEA) 10 x 75 мм2 стеклянные трубки, а затем передачи небольшое количество смолы стекло трубки. Fmoc расщепляется смолы следует разработать оранжевый цвет.
- Повторите шаги 1.2-1.3, если этот результат является отрицательным.
- Вымойте смолы три раза с 5 мл ДМФ.
-
Добавьте 5 мл ДМФ, содержащие 0,3 ммоль комплекса Fmoc, перечисленные в таблице 2 (начиная с соединения, используемые на этапе 1), 0,3 ммоль Гексафторофосфат O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 ммоль 1- Гидрокси-1H-Бензотриазол, моногидрат (HOBt) и 0,6 ммоль diisopropylethylamine (DIPEA). Рок-решение для 30 минут, чтобы пара его с смолы.
- Проверьте этот шаг с ТНБ теста. Если результат положительный, это означает, что реакция не продвинулась достаточно и необходимо повторить этот шаг.
- Вымойте смолы три раза с 5 мл ДМФ.
- Повторите удлинение реакции, повторив шаги 1.2-1.6, изменив Fmoc соединения, используемые на шаге 1.5 согласно таблице 2.
- Добавить 1 мл 2,5% воды, 1% triisopropylsilane (TIS) и 2,5% ethanedithiol (EDT) в trifluoroacetic кислоты, чтобы расщеплять пептидов из смолы и защиты групп. Рок решение для 60 мин.
- Фильтр и сбора фильтрата в 50-мл.
- Добавить 40 мл холодного диэтиловый этанола и хранить всю ночь при-20 ° C.
- 4000 x g центрифуги при-20 ° C на 30 мин собирать гранулы.
- Чтобы удалить диэтиловый эфир используйте эксикатор для 3 h.
- Добавить 1 мл 50% Ацетонитрил в воде и распустить сырой пептиды. Lyophilize решение для удаления trifluoroacetic кислоты. Повторите это действие несколько раз.
-
Очищайте пептиды, с помощью столбца картридж C18.
- Активируйте смолы в столбце картридж C18, используя 3 мл Ацетонитрил (АКС).
- Сбалансировать с 5 мл 5% ACN, 0.1% TFA H2O.
- Загрузите сырой синтетических пептидов в столбце картридж C18.
- Вымойте с 10 мл 5% ACN, 0.1% TFA H2O.
- Элюировать образцы с 3 мл 60% ACN, 0.1% TFA H2O.
-
Проверьте пептидов, измеряя их молекулярный вес с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.
- Пипетка 1 мкл элюента на целевой тарелку. Сразу же добавьте насыщенный α-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) раствор в ацетонитриле 50% в trifluoroacetic кислота 0,1%
- Кристаллизуются смесь по воздушной сушки.
- Приобрести массового спектры образцов согласно протоколу производителя прибора.
- Вручную установите MALDI-TOF масс-спектрометр для позитивного отражают режим.
- Калибровка с помощью CHCA масс-спектрометр, Брадикинин фрагмент 1-7 (monoisotopic молекулярный вес = 756.3997 да) и ангиотензин II (monoisotopic молекулярный вес = 1,045.5423 да).
- Приобрести массового спектры синтетических пептидов и затем оценить, сравнив ее с теоретической молекулярной массой.
2. подготовка ткани экстрактов
- Анестезировать мышей-самцов ICR в камере ингаляции изофлюрановая и проверки глубины анестезии через мыс пинча. Усыпить мышей от шейки матки дислокации.
- С помощью ножниц, сделайте срединной брюшной разрез через кожу, расширение до мечевидного отростка.
- Вырезать через диафрагму и собирать все легочной ткани. Нарежьте на мелкие кусочки ткани.
- Вымойте ткань три раза с ледяной 50 мм трис амортизированное saline (рН 7,4).
- Вес ткани и передачи около 100 мг тканей в стеклянную трубку2 12 x 75 мм.
- Добавление 0,3 мл извлечения буфера (50 мм трис буфер, рН 7,4, содержащий 0.1% поли (oxyethylene) octylphenyl эфира).
-
Однородный образцов ткани легких, с помощью смешивания гомогенизатора.
- Прохладный образцы на льду.
- Однородности выборок на 20000 об/мин за 30 s в блендере. Повторите этот шаг до тех пор, пока образцы полностью однородной.
Примечание: Не однородный для более чем 1 минута непрерывно, с тем чтобы избежать увеличения температуры.
- Передачи 1000 мкл огневки до 1,5 мл трубки и центрифуги для 5 мин на 10000 x g при 4 ° C.
- Передать новые пластиковые трубы 1,5 мл 500 мкл супернатант.
- Используйте 10 мкл пример для определения концентрации белка, используя такие методы, как bicinchoninic кислоты (BCA) или метод Кумасси блестящий синий (НБР).
- Для предотвращения замерзания, добавьте глицерин 80% образцов для конечной концентрации 50% глицерина.
- Хранение образцов-80 ° C до дальнейшего использования.
3. пищеварение субстратов в модель протеазы и экстракты ткани
-
10 мкл 0,1 мкг/мкл N-tosyl-L-фенилаланин хлорметил кетон (TPCK)-трипсин, 0,1 мкг/мкл Staphylococcus aureus V8 протеазы или 10 мкг/мкл ткани экстрактов в 890 мкл буфера пищеварение.
- Чтобы уточнить разницу в протеазы специфику в зависимости от рН, используйте буферы скорректирована с рН 3, 5, 7 и 9. В состав пищеварение буфера это показано в таблице 3.
- Осуществляют отрицательный контроль с помощью неактивные протеазы в ткани экстракты, подготовленный инкубации в кипящей воде (или Отопление при 100 ° C) для 10 мин.
- 10 мкл иминобиотин меченых субстратов (растворяют в диметилсульфоксида (ДМСО), конечная концентрация = 100 пмоль/10 мкл).
- Инкубируйте 3 часа при 37 ° C переваривать иминобиотин меченых субстратов.
- После инкубации остановите пищеварение субстратов с кипящей водой (или нагрева при 100 ° C) для 10 мин.
- Центрифуга переваривается субстраты для 5 мин на 10000 x g при 4 ° C.
- Перенесите супернатант в новой 1,5 мл трубки.
4. Очистка иминобиотин меченых субстрата
-
50 мкл 50% стрептавидина sepharose бисера в 1 М трис буфере (рН 9) содержащий 0,1% оксиетален octylphenyl эфира.
- Использование тел тестовой бумаги для обеспечения того, чтобы решение вокруг рН 9. При низком РН раствора, скорректировать его до приблизительно pH 9, добавляя 1 М трис буфере (рН 9) содержащий 0,1% оксиетален octylphenyl эфира. Этот шаг имеет важное значение, как это предполагает привязку иминобиотин меченых субстрата для стрептавидина.
- Инкубируйте на ночь при 4 ° C с непрерывной нежный смешивания на колесе ротатор для привязки иминобиотин меченых субстратов стрептавидина. Бисер должен оставаться приостановленной на протяжении всего инкубационного.
- Центрифуги для 1 мин на 10000 x g при 4 ° C. Удалите супернатант.
-
Вымойте бисер пять раз следующим образом:
- Добавьте 1000 мкл буфера мытья (50 мм трис буфер, рН 9) бисер.
- Мыть за 10 мин при 4 ° C с непрерывной нежный смешивания на колесе ротатора. Бисер должен оставаться приостановленной на протяжении всего инкубационного.
- Центрифуга для 1 мин на 10000 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
-
Добавьте 100 мкл 0,2% trifluoroacetic кислоты в бисер.
- Используйте тел тестовой бумаги для обеспечения того, чтобы решение ниже рН 2. Если рН раствора является высоким, скорректировать рН ниже 2 путем добавления кислоты 1% trifluoroacetic.
- Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре с непрерывной нежный смешивания на колесе ротатора.
- Центрифуга для 1 мин на 10000 x g при 4 ° C, затем передать супернатант новой 1,5 мл трубки.
5. Образец подготовки и при содействии матрицы лазерной десорбции/ионизации время полета масс-спектрометрия (MALDI-TOF масс-спектрометрия)
Примечание: Все решения в следующие шаги должны быть подготовлены с высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)-класс или аминокислоты последовательности класс воды.
- Пипетка 500 мкл Ацетонитрил на C18 смолы, чтобы активировать его. Удаление Ацетонитрил используется. Повторите этот шаг три раза.
- Сбалансировать C18 смолы с 100 мкл trifluoroacetic кислоты 0,1%. Удаление элюента. Повторите этот шаг три раза.
- Чтобы загрузить образцы, связать образцы смолы с помощью пипетки.
- Вымойте смолы с 20 мкл trifluoroacetic кислоты 0,1%. Повторите этот шаг пять раз.
- Элюировать образцы с 3 мкл 60% Ацетонитрил в 0,1% trifluoroacetic кислоты. Пипетка элюента на целевой пластина для MALDI-TOF масс-спектрометрии. Сразу же добавьте насыщенный раствор α-циано-4-Гидроксикоричная кислоты (CHCA) в 50% Ацетонитрил в 0,1% trifluoroacetic кислоты.
- Кристаллизуются смесь по воздушной сушки.
-
Приобрести массового спектры образцов согласно протоколу производителя прибора.
- Вручную установите MALDI-TOF масс-спектрометр для позитивного отражают режим.
- Калибровка с помощью CHCA масс-спектрометр, Брадикинин фрагмент 1-7 (monoisotopic молекулярный вес = 756.3997 да) и ангиотензин II (monoisotopic молекулярный вес = 1,045.5423 да).
- Приобрести массового спектры образцов, уделяя пристальное внимание массового спектров от 700 до 900 да рассеченного формы биотин меченых субстратов.
- Идентифицировать обнаруженных пики, с использованием таблицы 1. Выявление соответствующих молекулярной массы указывает расщепления в C-terminus соответствующих аминокислот.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Оценка метода для выявления специфики протеазы, модель протеазы
Эффективность этой системы была оценена с помощью TPCK-трипсина и V8 протеазы, чьи особенности субстрата были получены. TPCK-трипсина и V8 протеазы оценкам прилепится аминокислотной последовательности на C-терминала остатков лизина и аргинина и на стороне карбоксильную аспарагиновой кислоты и остатков глутаминовой кислоты, соответственно. Таблица 1 показывает теоретический молекулярный вес подложки и переваривается фрагменты ферментами конкретных протеаз. Субстрат пищеварение, с помощью TPCK-трипсин производится рассеченного фрагменты, два из которых могут быть обнаружены на 839.81 да и 796.76 Да (рис. 2A). Молекулярным весом этих фрагментов, тесно согласуются с теоретической молекулярных масс фрагментов, расщепляется с C-терминала лизина и аргинина, соответственно. Кроме того V8 протеазы прекурсоров субстратов преобразуется их рассеченного форме, с молекулярной массой 769.78 да и 755.62 Да (рис. 2B), который соответствует теоретическим m/z глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно. Эти результаты показывают, что этот метод может использоваться для успешно выявить специфику протеаз с MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Извлекает оценки субстратная специфичность в различных рН, с помощью мыши легких
Одним из преимуществ этой методики была, что большое количество образцов могут обрабатываться одновременно. Это исследование продемонстрировало, что субстратная специфичность изменены согласно уровень pH (рис. 3). В кислых условиях (рисунок 3B; рН 5) молекулярная масса рассеченного фрагмента был 770.13 да и 826.66 да. Эти результаты указали, что экстракт тканей легких содержится протеаз с способностью расщеплять в C-terminus глутаминовой кислоты и триптофана. Как уровень pH постепенно увеличивается, пики фрагменты ферментами глутаминовой кислоты и триптофана, постепенно сократилось, тогда как вершины фрагментов, расщепляется, лизина и аргинина постепенно увеличились (рис. 3C, D, pH 7 и 9). Эти результаты показали, что легких экстракт содержит два или более протеаз, которые имели различные оптимальный рН и расщепление особенностей.
Рисунок 1: схема для выявления специфики протеазы. (A) структура иминобиотин меченых субстрат для специфики протеазы. (B) субстратов имел иминобиотин, полиэтиленгликоль распорку и горные аминокислоты сайта. (C) спектры иминобиотин меченых субстратов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: оценки метода, чтобы определить специфику протеазы, с использованием очищенных ферментных. (A) спектры для иминобиотин меченых субстратов относились с TPCK-трипсина. Вершины 839.81 и 796.76 соответствуют теоретической низкомолекулярных фрагментов, порожденных расщепление на C-терминала стороне лизина и аргинина, соответственно. (B) спектры для иминобиотин меченых субстратов относиться с V8 протеазы. Вершины 769.78 и 755.62 соответствуют теоретической низкомолекулярных фрагментов, порожденных расщепление на C-терминала стороне глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Оценка метода для определения, специфика протеазы, используя ткани извлекает. Экстракт спектры для иминобиотин меченых субстратов, относились с легочной ткани. Эти спектры показывают пиков, полученные при рН 3 (A), (B) рН 5, рН 7 (C) и (D) рН 9. (E) иминобиотин меченых субстратов инкубировали с экстрактом ткани, инактивированная с термической обработки для оценки неспецифической пищеварение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| X | Предшественник | Расколотые формы |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Я * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| М * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa формы | ||
Таблица 1: теоретическая молекулярная масса иминобиотин меченых субстратов и ожидаемых низкомолекулярных фрагментов протеазы. Звездочками (*) указывают добавлением D-Серина между полиэтилена распорку и горные аминокислоты.
| XAA: Gly, Ала, Ser, Pro, Валь, Чет, леи, Asp, Gln, Glu, его, Phe, Arg, Tyr | |||
| Этап | Fmoc комбикорма | ||
| 1 | Fmoc мини PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc мини PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc мини PEG3-OH | ||
| 5 | Иминобиотин | ||
| XAA: Cys, Иль, Asn, Lys, встретились, ГТО | |||
| Этап | Fmoc комбикорма | ||
| 1 | Fmoc мини PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc мини PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc мини PEG3-OH | ||
| 6 | Иминобиотин | ||
Таблица 2: Последовательный список реагентов, используемых для синтеза субстрата.
| pH | состав | ||
| 9 | 50 мм Трицин, содержащие 0,1 М NaCl и 10 мм CaCl2 | ||
| 7 | 50 мм трис-HCl, содержащие 0,1 М NaCl и 10 мм CaCl2 | ||
| 5 | Ацетат натрия 50 мм, содержащие 0,1 М NaCl и 10 мм CaCl2 | ||
| 3 | лимонная кислота 50 мм, содержащие 0,1 М NaCl и 10 мм CaCl2 | ||
Таблица 3: Композиции используемых решений буфера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол использует MALDI-TOF масс-спектрометрии для выявления специфики протеазы в сырой образцов, полученных из тканей экстрактов и легко могут быть расширены для обработки нескольких образцов. В частности мы манипулировать рН, чтобы вызвать изменения в субстратная специфичность.
Авидин Биотин комплекс (ABC) метод, который широко используется в биохимии из-за своей специфичности привязки, был использован в нашем протокол. Из-за сильной схожести ABC связывание авидин биотина практически необратимый характер. Поэтому весьма неэффективно, очищение сродства для Азбука. По этой причине мы сообщаем, что ставки возмещения для биотин меченых субстратов, как ожидается, будет низким. В этом исследовании мы только использовали уровень низкий рН для элюции; Однако deglycosylated авидин смолы13 или14 мономерных авидин смола может также использоваться для очистки биотин меченых субстратов.
Метод, предложенный в этом исследовании может быть скорректирована для различных экспериментальных систем и приложений; принимая во внимание, что не в состоянии проводить количественный анализ MALDI-TOF масс-спектрометр. После того, как было установлено, субстратная специфичность, она может быть лучше для количественной оценки с использованием спектрометрический анализы, флуориметрический анализов или флуоресценции передачи энергии резонанса (лад).
Калибровка масс-спектрометрии был наиболее важным шагом в этом протоколе. В тех случаях, когда выявляются субстратов с подобными молекулярными весами проникли точность результатов может улучшить, добавив молекулярный вес прекурсоров.
Поскольку реакции Энзим усиливается с течением времени, можно продлить время реакции, если не может быть обнаружен фермент. Однако давая реакции продолжаться в течение более чем 24 h приводит побочных реакций, которые генерируют нежелательных пиков. Таким образом желательно осуществлять реакции до 18 h или для контроля, тестирования с использованием тепла обрабатывают образцы. Эта процедура может определить специфику протеазы для в течение нескольких femtomol трипсина.
В заключение мы представляем удобный метод, который использует иминобиотин меченых субстратов для оценки специфика протеазы. Этот метод позволяет для одновременной обработки нескольких образцов и могут быть использованы для упрощения проверки протеазы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа частично поддержали Нихон фармацевтического университета исследовательский грант от фармацевтического университета Нихон (2016) и JP17854179 номер гранта KAKENHI МПКСНТ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
