Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.
Abstract
Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.
Introduction
Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado1. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.
Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases2 mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases3, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide4e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina5 ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. 7 usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos8clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.
Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina9; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.
O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade10. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.
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Protocol
Protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de ética da Universidade Nihon farmacêutico e realizados em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório da Universidade Nihon farmacêutico. O protocolo foi ajustado para extratos de tecido derivados de camundongos ICR. Camundongos ICR foram comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japão)
1. preparação do substrato Iminobiotin-etiquetado
O substrato sofre a fase sólida síntese usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegido aminoácidos, conforme descrito abaixo de11. Use a tabela 2 para determinar o Fmoc-composto usado, dependendo do aminoácido desejado e fase de síntese.
- Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL com 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) em uma coluna de síntese.
- Adicione 5 mL de piperidina de 30% em DMF. A solução por 10 min cravar o Fmoc-grupo de rock.
-
Confira Fmoc clivagem com o ácido trinitrobenzenesulfonic (neutrófilos) teste12: adicionar 10 µ l de 1% neutrófilos em DMF e 10 µ l de diisopropylethylamine (DIPEA) para um tubo de vidro de2 10 x 75 mm e, em seguida, transferir uma pequena quantidade de resina para o vidro do tubo. A resina de Fmoc-clivada deve desenvolver uma cor laranja.
- Repita os passos 1,2-1,3 se este resultado é negativo.
- Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.
-
Adicionar 5 mL de DMF contendo 0,3 mmol do Fmoc-composto listado na tabela 2 (começando com o composto usado na etapa 1), 0,3 mmol de Hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxilado-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt) e 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). Agitar a solução durante 30 min acoplar com a resina.
- Verifique este passo com o teste de neutrófilos. Se o resultado for positivo, isso significa que a reação não tem progredido suficientemente e este passo deve ser repetido.
- Lave a resina três vezes com 5 mL de DMF.
- Repeti a reação de alongamento, repetindo as etapas 1.2-1.6, mudando o Fmoc-composto usado na etapa 1.5 de acordo com a tabela 2.
- Adicionar 1 mL de água de 2,5%, 1% triisopropylsilane (TIS) e 2,5% Etanoditiol (EDT) em ácido trifluoroacético para clivar peptídeos dos grupos resina e proteção. Agitar a solução durante 60 min.
- Filtrar e recolher o filtrado em um tubo de 50 mL.
- Adicionar 40 mL de álcool etílico frio e loja durante a noite a-20 ° C.
- Centrífuga 4.000 x g a-20 ° C durante 30 min. coletar o sedimento.
- Use um dessecador para 3h para remover o éter etílico.
- Adicione 1 mL de acetonitrilo 50% de água e dissolver os peptídeos brutos. Lyophilize a solução para remover o ácido trifluoroacético. Repita este passo várias vezes.
-
Purifica os peptídeos usando uma coluna de cartucho C18.
- Ative a resina na coluna C18 cartucho usando 3 mL de acetonitrila (ACN).
- Equilibrar com 5 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H2O.
- Carrega os peptídeos sintéticos brutos na coluna C18 do cartucho.
- Lavar com 10 mL de 5% do Grupo ACN, 0,1% TFA em H2O.
- Eluir as amostras com 3 mL de 60% ACN, 0,1% TFA em H2O.
-
Verifique os peptídeos medindo seu peso molecular usando espectrometria de massa MALDI-TOF.
- Pipete 1 µ l de eluente numa placa de destino. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%
- Cristalizar a mistura por secagem ao ar.
- Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante instrumento.
- Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.
- Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).
- Adquirir os espectros de massa de peptídeos sintéticos e em seguida avaliar, comparando-o com o peso molecular teórico.
2. preparação dos extratos de tecido
- Anestesiar os ratos masculinos ICR em uma câmara de inalação de isoflurano e verificar a profundidade de anestesia através de pitada de dedo do pé. Eutanásia em ratos por deslocamento cervical.
- Usando a tesoura, faça uma incisão abdominal através da pele, estendendo até o processo xifoide.
- Corte através do diafragma e recolher todo o tecido pulmonar. Corte o tecido em pequenos pedaços.
- Lave o tecido três vezes com gelada 50 mM Tris salino (pH 7,4).
- Pese os tecidos e a transferência de cerca de 100 mg de tecidos para um tubo de vidro 12 x 75 mm2 .
- Adicione 0,3 mL de tampão de extração (Tris-tampão, pH 7,4, contendo 0,1% de éter de octilfenil poli (oxietileno) de 50 mM).
-
Homogeneizar as amostras de tecido de pulmão usando um misturando homogenizador.
- Fixe as amostras no gelo.
- Homogeneizar as amostras a 20.000 rpm para 30 s em um liquidificador. Repita este passo até que as amostras são completamente homogêneas.
Nota: Não homogeneizar durante mais de 1 minuto continuamente, a fim de evitar um aumento de temperatura.
- Transferência de 1.000 µ l do homogeneizado para um tubo de 1,5 mL e centrifugar durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.
- Transferi 500 µ l do sobrenadante para um novo tubo de plástico de 1,5 mL.
- Use 10 µ l da amostra para determinar a concentração de proteína, usando métodos como o bicinchoninic ácido (BCA) ou o método de Coomassie brilhante azul (CBB).
- Para evitar o congelamento, adicione glicerol 80% para as amostras para uma concentração final de glicerol a 50%.
- Armazene as amostras a-80 ° C até utilização posterior.
3. digestão de substratos no modelo Protease e extratos de tecido
-
Adicionar 10 µ l de 0,1 µ g / µ l de cetona de clorometil N-Tosil-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 µ g / µ l de protease de Staphylococcus aureus V8 ou 10 µ g / µ l dos extratos de tecido em 890 µ l de um buffer de digestão.
- Para esclarecer a diferença na especificidade da protease dependendo do pH, use buffers ajustados ao pH 3, 5, 7 e 9. A composição do buffer digestão é mostrada na tabela 3.
- Efectue um controlo negativo usando protease inactiva em extratos de tecido, preparados pela incubação em água fervente (ou aquecimento a 100 ° C) por 10 min.
- Adicionar 10 µ l de substratos iminobiotin-rotulado (dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO), concentração final = 100 µ l de pmol/10).
- Incube durante 3 horas a 37 ° C para digerir substratos iminobiotin-rotulados.
- Após a incubação, pare a digestão de substratos com água a ferver (ou por aquecimento a 100 ° C) por 10 min.
- Centrifugue os substratos digeridos durante 5 min à 10.000 x g a 4 ° C.
- Transferi o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
4. purificação do substrato Iminobiotin-etiquetado
-
Adicione 50 µ l de grânulos de sepharose streptavidin 50% em 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter.
- Use papel de teste de pH para garantir que a solução é em torno de pH 9. Se o pH da solução é baixo, ajustá-lo para aproximadamente pH 9, adicionando 1 M-tampão Tris (pH 9) contendo 0,1% poly(oxyethylene) octilfenil éter. Esta etapa é importante, já que envolve a ligação do substrato iminobiotin-rotulado de estreptavidina.
- Incube durante uma noite a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator para ligar os substratos iminobiotin-rotulado o streptavidin. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.
- Centrífuga para 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Remova o sobrenadante.
-
Lave os grânulos cinco vezes como segue:
- Adicione 1.000 µ l de um tampão de lavagem (50 mM Tris-tampão, pH 9) para as contas.
- Lavagem por 10 min a 4 ° C, com uma mistura suave contínua em uma roda de rotator. Os grânulos devem permanecer suspensos durante a incubação.
- Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e remover o sobrenadante.
-
Adicione 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,2% para os grânulos.
- Use papel de teste de pH para garantir que a solução está abaixo de pH 2. Se o pH da solução é alto, ajuste o pH para abaixo de 2 adicionando ácido trifluoroacético de 1%.
- Incube durante 30 min à temperatura ambiente com mistura suave contínua em uma roda de rotator.
- Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C e, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL.
5. preparação e espectrometria de massa (espectrometria de massa MALDI-TOF) tempo-de-voo de dessorção/ionização Matrix-Assisted Laser da amostra
Nota: Todas as soluções nas etapas a seguir devem ser preparadas com a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)-água de sequenciamento-grau grau ou aminoácido.
- Pipete 500 µ l de acetonitrilo para uma resina C18 para ativá-lo. Remova o acetonitrilo usado. Repita este passo 3 vezes.
- Equilibrar a resina C18 com 100 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Remova o eluente. Repita este passo 3 vezes.
- Para carregar as amostras, vincule as amostras para a resina com uma pipeta.
- Lave a resina com 20 µ l de ácido trifluoroacético de 0,1%. Repita essa etapa cinco vezes.
- Eluir as amostras com 3 µ l de acetonitrilo 60% em ácido trifluoroacético de 0,1%. Pipete o eluente numa placa de destino por espectrometria de massa MALDI-TOF. Adicione imediatamente a solução ácida (CHCA) α-cyano-4-hidroxicinâmicos saturada em 50% acetonitrila em ácido trifluoroacético de 0,1%.
- Cristalizar a mistura por secagem ao ar.
-
Aquisição de espectros de massa das amostras de acordo com o protocolo do fabricante do instrumento.
- Definir manualmente o espectrômetro de massa MALDI-TOF para um positivo refletir de modo.
- Calibrar o espectrômetro de massa usando CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotópico = Da 756.3997) e da angiotensina II (peso molecular de monoisotópico = Da 1,045.5423).
- Adquira os espectros de massa das amostras, prestando atenção aos espectros de massa de 700 a 900 para a forma clivada de substratos biotina-rotulados.
- Identifica os picos detectados usando a tabela 1. Deteção do peso molecular adequado indica clivagem no C-terminal do aminoácido relevante.
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Representative Results
Avaliação do método para a identificação da especificidade de protease por protease modelo
A eficiência deste sistema foi avaliada usando TPCK-tripsina e protease V8, cujas especificidades do substrato foram obtidas. TPCK-tripsina e protease V8 foram estimados para clivar a sequência de aminoácidos no C-terminal dos resíduos lisina e arginina e no lado de carboxila do ácido aspártico e ácido glutâmico resíduos, respectivamente. A tabela 1 mostra o peso molecular teórico do substrato e digerido fragmentos clivados por proteases específicas. Digestão de substrato usando TPCK-tripsina produzidos fragmentos clivados, dois dos quais poderiam ser detectado no Da 839.81 e Da 796.76 (Figura 2A). Os pesos moleculares destes fragmentos foram estreitamente alinhado com os teóricos pesos moleculares dos fragmentos clivados do C-terminal da lisina e arginina, respectivamente. Além disso, a protease V8 convertido substratos precursor em sua forma clivada, com pesos moleculares Da 769.78 e Da 755.62 (Figura 2B), o que corresponde a m/z teórica de ácido glutâmico e ácido aspártico, respectivamente. Estes resultados indicam que esse método pode ser usado para identificar com sucesso a especificidade de protease com espectrometria de massa MALDI-TOF.
Avaliação da especificidade de substrato em níveis de pH diferente usando o pulmão do rato extrai
Uma das vantagens desta técnica foi que um grande número de amostras pode ser processado simultaneamente. Este estudo demonstrou que a especificidade do substrato alterado de acordo com o nível de pH (Figura 3). Em condições ácidas (Figura 3B; pH 5), o peso molecular de um fragmento clivado foi Da 770.13 e Da 826.66. Estes resultados indicaram que o extrato de tecido de pulmão continha proteases com a capacidade de decompor no C-terminal do ácido glutâmico e triptofano. Como o nível de pH aumentado gradualmente, os picos de fragmentos clivados por ácido glutâmico e triptofano gradualmente diminuída, Considerando que os picos de fragmentos clivados por arginina e lisina gradualmente aumentaram (Figura 3C, D; pH 7 e 9). Estes resultados indicaram que o extrato de pulmão continha dois ou mais proteases que tinham especificidades diferentes de pH e decote ideais.
Figura 1: esquema para a deteção de especificidade protease. (A) estrutura do substrato iminobiotin-etiquetados para a especificidade de protease. (B) os substratos tinham iminobiotin, um espaçador de polietileno glicol e um aminoácido cleavable site. (C) os espectros de substratos iminobiotin-rotulados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: avaliação do método para determinar a especificidade de protease usando uma enzima purificada. (A) os espectros para iminobiotin-rotulado de substratos tratadocom com TPCK-tripsina. Os picos de 796.76 e 839.81 correspondem o peso molecular teórico de fragmentos gerados pela clivagem do lado do C-terminal da lisina e arginina, respectivamente. (B) os espectros para iminobiotin-rotulado de substratos tratadocom com V8 protease. Os picos de 769.78 e 755.62 correspondem o peso molecular teórico de fragmentos gerados pela clivagem no lado C-terminal do ácido glutâmico e ácido aspártico, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: avaliação do método para determinar a especificidade de protease usando tecido extrai. Extrair os espectros para iminobiotin-rotulado de substratos tratados com um tecido de pulmão. Estes espectros mostram picos obtidos em (A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7 e pH (D) 9. (E) a iminobiotin-rotulado substratos incubadas com o extrato de tecido inativado com tratamento térmico para avaliar a digestão não-específica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| X | Precursor | Forma clivada |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Eu * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: Formulário D-Ser-Xaa | ||
Tabela 1: O peso molecular teórico de substratos iminobiotin-rotulados e o peso molecular esperado de fragmentos de protease. Asteriscos (*) indicam a adição de D-serina entre o espaçador de polietileno e o aminoácido cleavable.
| Xaa: Gly, Ala EMISSAO SERIE, Pro, Val, Thr, Leu, Asp, Gln, Glu, sua, Phe, Arg, Tyr | |||
| Estágio | Fmoc-composto | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys, Ile, Asn, Lys, conhecido, Trp | |||
| Estágio | Fmoc-composto | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tabela 2: Lista sequencial dos reagentes usados para a síntese de substrato.
| pH | composição | ||
| 9 | 50mm Tricine contendo 0.1 M de NaCl e CaCl2 de 10 mM | ||
| 7 | 50 mM Tris-HCl contendo 0.1 M de NaCl e CaCl2 de 10 mM | ||
| 5 | acetato de sódio 50 mM, contendo 0,1 M NaCl e 10 mM CaCl2 | ||
| 3 | ácido cítrico 50 mM, contendo 0,1 M NaCl e 10 mM CaCl2 | ||
Tabela 3: Composições das soluções tampão usadas.
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Discussion
Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.
O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a forte afinidade do ABC, a vinculação de avidina a biotina é quase irreversível. Purificação da afinidade para ABCs, portanto, é altamente ineficiente. Por este motivo, informamos que a taxa de recuperação para substratos de biotina-etiquetado é esperada para ser baixo. Neste estudo, usamos apenas um nível de pH baixo para a eluição; no entanto, deglycosylated avidina-resina13 ou monomérica avidina-resina14 também pode ser usado para purificar a biotina-rotulado de substratos.
O método proposto neste estudo pode ser ajustado para diferentes sistemas experimentais e aplicações; tendo em conta que o espectrômetro de massa MALDI-TOF é incapaz de realizar a análise quantitativa. Uma vez que a especificidade de substrato foi determinada, talvez seja melhor realizar a quantificação utilizando espectrometria de ensaios, ensaios fluorométrica ou fluorescência ressonância energia transferência (FRET).
A calibração de espectrometria de massa foi o passo mais importante no presente protocolo. Em casos onde os substratos com peso moleculares similares são detectados, a precisão dos resultados pode ser melhorada adicionando-se o peso molecular dos precursores.
Uma vez que a reacção enzimática é reforçada com o tempo, é possível estender o tempo de reação, se a enzima não pode ser detectada. No entanto, deixando a reação continuar por mais de 24 h resulta em reações colaterais que geram picos indesejáveis. Portanto, é aconselhável realizar a reação para até 18 h ou controlar o teste usando calor tratadas amostras. Este procedimento poderia determinar a especificidade de protease para dentro de alguns femtomol de tripsina.
Em conclusão, apresentamos um método conveniente que usa iminobiotin-rotulado de substratos para avaliar a especificidade de protease. Esse método permite o processamento simultâneo de várias amostras e pode ser usado para simplificar a seleção de protease.
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Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo Nihon farmacêutica Universidade bolsa de pesquisa da Universidade de Nihon farmacêutico (2016) e o MEXT KAKENHI Grant número JP17854179.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
