Summary
Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.
Abstract
Proteasen zijn verschillende biologische functies, met inbegrip van eiwit activeren/inactiveren en voedsel spijsvertering. Identificeren van protease specificiteit is belangrijk voor het openbaren van protease-functie. De methode voorgesteld in deze studie bepaalt protease specificiteit door het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten met behulp van de Matrix-bijgewoonde Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Time-of-Flight (MALDI-TOF). De substraten bevatten iminobiotin, terwijl de gekloofd site uit aminozuren bestaat en de spacer uit polyethyleen glycol bestaat. Het gekloofd substraat genereert een unieke molecuulgewicht met behulp van een gekloofd aminozuur. Een van de verdiensten van deze methode is dat het kan worden uitgevoerd in een pot met behulp van de ruwe monsters, en het is ook geschikt voor de beoordeling van meerdere monsters. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige experimentele methode geoptimaliseerd met monsters muis longweefsel, met inbegrip van weefsel extractie, plaatsing van spijsvertering substraten in monsters, zuivering van spijsvertering substraten onder verschillende pH-omstandigheden is onttrokken. , en de meting van de substraten molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF. Kortom, deze techniek maakt het mogelijk voor de identificatie van protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel met behulp van MALDI-TOF massa spectrometrie, die gemakkelijk kan worden opgeschaald voor meerdere monster verwerking.
Introduction
Proteasen reguleren fysiologische processen door het splijten van eiwitten, en de inleiding van protease-activiteit op bepaalde tijdstippen en locaties is gereglementeerde1. Het is daarom belangrijk om te identificeren van de expressie en de activiteit van weefsels die lokaal worden geregeld, en een nieuwe methode voor het detecteren van proteasen te ontwikkelen. De methode voorgesteld deze studie wil identificeren protease specificiteit parallel aan het opsporen van proteasen.
Er zijn enkele methoden voor het opsporen van protease specificiteit. De azocasein methode is bekend om het gebruik ervan in de opsporing van proteasen2 maar is beperkt in zijn vermogen om verdere informatie te verkrijgen. Zymography is een andere uitgebreide protease-detectiemethode die kan worden gebruikt om te bepalen van het molecuulgewicht van proteasen3, maar het kan niet worden gebruikt voor het onderzoeken van substraat specificiteit. Protease specificiteit kan worden bepaald door spectrometrische assays, gebruik van substraten zoals p-nitroanilide4, en fluorimetrische vitrotests, met behulp van cumarine substraten5 of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) testen6. Deze methoden inschakelen single-specificiteit detectie van substraten die zijn opgenomen in een enkele goed. In de huidige studie, wordt de protease-specificiteit van extracten van weefsel onderzocht onder verschillende omstandigheden, zoals deze extracten meerdere proteasen bevatten. Protease-activiteit wordt geregeld door verschillende factoren, inclusief pH, coënzymen en prosthetic groepen ion sterkte. Onlangs, proteomics gebaseerde methoden zijn gebruikt voor het identificeren van protease specificiteit; bijvoorbeeld de methode gerapporteerd door Biniossek et al. 7 de Proteoom gebruikt om te bepalen van substraat specificiteit zelfs in grove extracten en nauwkeurige bepaling van de activiteit van de splitsing van proteasen die meerdere aminozuur sequenties8 herkentstaat. Deze methode is echter niet geschikt voor de analyse van de talloze voorbeelden. Daarentegen onze methode maakt de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters, en het gebruik van de Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor analyse van monster vergemakkelijkt een snelle en gemakkelijke opsporing van de gekloofd substraten.
Dit document schetst een methode om te evalueren van protease specificiteit met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF voor het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten. De moleculaire vormen van gekloofd substraten, samen met hun theoretische molecuulgewichten, worden weergegeven in Figuur 1 en tabel 1. Eerdere studies hebben gebruik gemaakt van substraten met polyglycine spacers en biotine9; echter zijn deze substraten gebrekkig omdat de volgorde van de polyglycine kan worden cleaved door enzymen die de glycine-volgorde herkent. Daarnaast is de hoge affiniteit tussen avidin en biotine kan leiden tot een lage opbrengst. Om op deze nadelen, in deze studie we gesynthetiseerd een uniek substraat, die bestond van polyethyleenglycol (PEG), iminobiotin en een aminozuur dat de breukzijde (Figuur 1 identificeren kon). Om te discrimineren tussen aminozuren gelijkaardige molecuulgewichten, werd D-serine toegevoegd tussen de pin spacer en het aminozuur op de gekloofd site.
De N-terminal van het substraat werd aangeduid met iminobiotin, waarmee de zuivering van de affiniteit van ruwe monsters. Het gebruik van iminobiotin in plaats van Biotine is van cruciaal belang; Biotine heeft een sterke affiniteit met avidin, wat in terugwinning van de lage tarieven van biotine-geëtiketteerden substraten uit avidin hars, resulteert terwijl iminobiotin de affiniteit voor avidin kan worden gewijzigd door pH. Iminobiotin-geëtiketteerden substraten zal binden aan de avidin in omstandigheden boven pH 9, terwijl avidin releases iminobiotin-geëtiketteerden substraten in voorwaarden hieronder pH 4. Daarom werd iminobiotin gebruikt voor affiniteit zuivering10. In samenvatting beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opsporen van protease specificiteit met behulp van unieke substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Nihon farmaceutische Universiteit de ethische Commissie en uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de Nihon farmaceutische Universiteit. Het protocol is aangepast voor weefsel extracten afgeleid van ICR muizen. ICR muizen werden gekocht van Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japan)
1. bereiding van het substraat Iminobiotin-label
Het substraat ondergaat solid-phase-synthese 9-fluorenylmethyloxycarbonyl groep (Fmoc)-beschermd aminozuren zoals hieronder11beschreven. Tabel 2 gebruiken om te bepalen van de Fmoc-verbinding gebruikt, afhankelijk van de gewenste aminozuur en fase van synthese.
- Swill 0.2 g Fmoc-NH-SAL hars met 10 mL N, N-dimethylformamide (DMF) in een synthese-kolom.
- Voeg 5 mL van 30% piperidine in DMF. Rock de oplossing voor 10 min te klieven van de Fmoc-groep.
-
Controleer Fmoc met het trinitrobenzenesulfonic zuur (TNBS) splijten test12: Voeg 10 µL van 1% TNBS in DMF en 10 µL van diisopropylethylamine (DIPEA) naar een 10 x 75 mm2 glazen buis en een kleine hoeveelheid hars overdracht aan het glas tube. De Fmoc-gekloofd hars moet ontwikkelen een oranje kleur.
- Herhaal stap 1.2-1.3 als dit resultaat negatief is.
- Wassen van de hars driemaal met 5 mL DMF.
-
Voeg toe 5 mL DMF met 0.3 mmol van de Fmoc-samengestelde vermeld in tabel 2 (te beginnen met de stof gebruikt in fase 1), 0.3 mmol van O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorfosfaat (HCTU), 0.3 mmol van 1- Hydroxy-1H-benzotriazole monohydraat (HOBt) en 0,6 mmol van diisopropylethylamine (DIPEA). De oplossing voor 30 min aan het echtpaar met de hars rock.
- Controleer deze stap met de TNBS test. Als het resultaat positief is, betekent dit de reactie niet voldoende vooruitgang geboekt en deze stap moet worden herhaald.
- Wassen van de hars driemaal met 5 mL DMF.
- Herhaal de rek reactie door stappen te herhalen 1.2-1.6, wijzigen van de Fmoc-compound gebruikt in stap 1.5 volgens tabel 2.
- Voeg 1 mL 2,5% water, 1% triisopropylsilane (TIS), en 2,5% ethanedithiol (EDT) in trifluorazijnzuur te klieven van peptiden uit de groepen hars en bescherming. Rock de oplossing voor 60 min.
- Filteren, en Vang filtraat op in een 50 mL-buis.
- Voeg 40 mL koude diethyl ethanol en winkel 's nachts bij-20 ° C.
- Centrifuge 4000 x g bij-20 ° C gedurende 30 minuten verzamelen de pellet.
- Gebruik een exsiccator gedurende 3 uur te verwijderen van de diethylether.
- Voeg 1 mL acetonitril 50% aan water en los van de ruwe peptiden. Lyophilize de oplossing Schakel trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap meerdere keren.
-
Zuiveren de peptiden een C18 cartridge kolom gebruiken.
- Activeer de hars in de C18 cartridge kolom met behulp van 3 mL acetonitril (ACN).
- Equilibreer met 5 mL 5% ACN, 0,1% TFA in H2O.
- De ruwe synthetische peptiden in de kolom C18 cartridge laden.
- Wassen met 10 mL 5% ACN, 0,1% TFA in H2O.
- Elueer de monsters met 3 mL 60% ACN, 0,1% TFA in H2O.
-
Controleer de peptiden door het meten van hun molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF.
- Pipetteer 1 µL van eluens op een doel-plaat. Onmiddellijk toevoegen verzadigde α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur
- Kristalliseren het mengsel door droging.
- Verwerven van massaspectra van monsters volgens protocol van de fabrikant van het instrument.
- Handmatig in te stellen de MALDI-TOF massa spectrometer op een positieve wijze weerspiegelen.
- Kalibreren van de massaspectrometer met behulp van CHCA, bradykinine fragment 1-7 (exacte moleculaire gewicht = 756.3997 Da), en angiotensine II (exacte moleculaire gewicht = 1,045.5423 Da).
- Verwerven van de massaspectra van synthetische peptides, en dan beoordelen door het te vergelijken met de theoretische molecuulgewicht.
2. bereiding van extracten van weefsel
- Anesthetize mannelijke ICR muizen in een zaal van Isofluraan inademing en controleer of anesthesie diepte via teen snuifje. De muizen door cervicale dislocatie euthanaseren.
- Met behulp van schaar, maken een middellijn abdominale incisie via de huid uit te breiden tot de xiphoid process.
- Het middenrif doorsnijden en het verzamelen van alle longweefsel. Het weefsel wordt in kleine stukjes gesneden.
- Het wassen van het weefsel driemaal met ijskoude 50 mM Tris-gebufferde zoutoplossing (pH 7.4).
- Weeg de weefsels en de overdracht ongeveer 100 mg van weefsels aan een 12 x 75 mm2 glazen buis.
- Voeg 0.3 mL van de extractie-buffer (50 mM Tris-buffer, pH 7.4, met 0,1% poly (oxyethylene) octylphenyl ether).
-
Meng het Long weefselmonsters met behulp van een mengen homogenizer.
- Koel de monsters op ijs.
- Meng de monsters op 20.000 rpm voor 30 s in een blender. Herhaal deze stap totdat de monsters volledig homogeen zijn.
Opmerking: Het niet meng gedurende meer dan 1 minuut continu, om te voorkomen dat een stijging van de temperatuur.
- 1.000 µL van het homogenaat overbrengen in een tube 1,5 mL en Centrifugeer gedurende 5 min bij 10.000 x g bij 4 ° C.
- 500 µL van het supernatans overbrengen in een nieuwe 1,5 mL plastic buis.
- Gebruik 10 µL van het monster te bepalen eiwitconcentratie, met methoden, zoals de bicinchoninic zuur (BCA) of de methode Coomassie briljant blauw (CBB).
- Om te voorkomen dat bevriezing, 80% glycerol aan de monsters voor een eindconcentratie van 50% glycerol te toevoegen.
- Het bewaren van de monsters bij-80 ° C tot verder gebruik.
3. vertering van substraten in Model Protease en weefsel extracten
-
Voeg 10 µL van 0,1 µg/µL van N-tosyl-L-fenylalanine chloormethyl keton (TPCK)-trypsine, 0,1 µg/µL van Staphylococcus aureus V8 protease of 10 µg/µL van weefsel extracten in 890 µL van een buffer van de spijsvertering.
- Gebruiken om te verduidelijken het verschil in protease specificiteit afhankelijk van de pH, buffers aangepast aan de pH 3, 5, 7 en 9. De samenstelling van de spijsvertering-buffer wordt weergegeven in tabel 3.
- Verrichten van een negatieve controle met behulp van inactieve protease in weefsel extracten, bereid door incubatie in kokend water (of verwarming bij 100 ° C) gedurende 10 minuten.
- Voeg 10 µL van iminobiotin-label substraten (ontbonden in dimethylsulfoxide (DMSO), eindconcentratie = 100 pmol/10 µL).
- Incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C te verteren iminobiotin-geëtiketteerden substraten.
- Na incubatie, stoppen met de vertering van substraten met kokend water (of door verwarming bij 100 ° C) gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer het verteerd substraten voor 5 min bij 10.000 x g bij 4 ° C.
- Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe 1,5 mL-buis.
4. zuivering van het Iminobiotin-label substraat
-
Voeg 50 µL van 50% streptavidine sepharose kralen in 1 M Tris-buffer (pH 9) met 0,1% poly(oxyethyleen) octylphenyl ether.
- PH test papier gebruiken om ervoor te zorgen dat de oplossing ongeveer pH 9 is. Als de pH van de oplossing laag is, deze aanpassen aan ongeveer pH 9 door toevoeging van 1 M Tris-buffer (pH 9) met 0,1% poly(oxyethyleen) octylphenyl ether. Deze stap is belangrijk, als het gaat om de binding van het iminobiotin-label substraat naar daar.
- Na een nacht bebroeden bij 4 ° C met continue Zacht mengen op een rotator wiel de iminobiotin-geëtiketteerden substraten binden aan de streptavidine. De kralen moeten blijven geschorst tijdens de incubatie.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
-
Wassen de kralen vijfmaal als volgt:
- Voeg 1.000 µL van een wash-buffer (50 mM Tris-buffer, pH 9) aan de kralen.
- Wassen gedurende 10 minuten bij 4 ° C met continue Zacht mengen op een rotator-wiel. De kralen moeten blijven geschorst tijdens de incubatie.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende substantie.
-
Voeg 100 µL van 0,2% trifluorazijnzuur aan de kralen.
- PH test papier gebruiken om ervoor te zorgen dat de oplossing lager dan pH 2 is. Als de pH van de oplossing hoog is, breng de pH op hieronder 2 door toevoeging van 1% trifluorazijnzuur.
- Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met continue Zacht mengen op een rotator-wiel.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 10.000 x g bij 4 ° C, dan het supernatans naar een nieuwe 1,5 mL-buis.
5. voorbereiding en Laser Matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie Time-of-Flight massaspectrometrie (MALDI-TOF massa spectrometrie) proeven
Opmerking: Alle oplossingen in de volgende stappen moeten worden bereid met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC)-rang of aminozuur sequencing-grade water.
- Pipetteer 500 µL van acetonitril op een C18-hars om het te activeren. Verwijder de gebruikte acetonitril. Herhaal deze stap drie keer.
- Equilibreer de C18-hars met 100 µL van 0,1% trifluorazijnzuur. Verwijder de elutievloeistof. Herhaal deze stap drie keer.
- Voor het laden van de monsters, de monsters aan de hars met behulp van een precisiepipet te binden.
- Wassen van de hars met 20 µL van 0,1% trifluorazijnzuur. Herhaal deze stap vijf keer.
- Elueer de monsters met 3 µL van 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur. Pipetteer het eluent op een doel-plaat voor MALDI-TOF massa spectrometrie. Onmiddellijk vergroten met verzadigde α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA) oplossing in 50% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur.
- Kristalliseren het mengsel door droging.
-
Verwerven van massaspectra van monsters volgens protocol van de fabrikant van het instrument.
- Handmatig in te stellen de MALDI-TOF massa spectrometer op een positieve wijze weerspiegelen.
- Kalibreren van de massaspectrometer met behulp van CHCA, bradykinine fragment 1-7 (exacte moleculaire gewicht = 756.3997 Da), en angiotensine II (exacte moleculaire gewicht = 1,045.5423 Da).
- Het verwerven van de massaspectra van monsters, veel aandacht aan de massaspectra van 700 tot 900 Da voor het gekloofd formulier van de substraten Biotine-label.
- Het identificeren van de gedetecteerde pieken met behulp van tabel 1. Opsporing van de desbetreffende moleculair gewicht geeft aan decollete in de C-terminus van de relevante aminozuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van de methode voor de identificatie van protease specificiteit door model protease
De efficiëntie van dit systeem werd geëvalueerd aan de hand van TPCK-trypsine en V8 protease, waarvan substraat specifieke kenmerken werden verkregen. TPCK-trypsine en V8 protease werden geschat op het klieven van het aminozuur-reeks in de C-terminal van de lysine en arginine residuen, en aan de zijkant van de carboxy het asparaginezuur en glutaminezuur residuen, respectievelijk. Tabel 1 toont de theoretische molecuulgewicht van het substraat en verteerd fragmenten gekloofd door specifieke proteasen. Substraat spijsvertering met behulp van TPCK-trypsine geproduceerd gekloofd fragmenten, waarvan er twee kon worden opgespoord op 839.81 Da en 796.76 Da (figuur 2A). Molecuulgewicht van deze fragmenten waren nauw in overeenstemming met de theoretische molecuulgewicht van de fragmenten gekloofd vanaf de C-terminal van lysine en arginine, respectievelijk. Bovendien, omgezet de V8 protease in voorloper substraten hun gekloofd vorm, met een molecuulgewicht van 769.78 Da en 755.62 Da (figuur 2B), die respectievelijk de theoretische m/z van glutaminezuur en asparaginezuur, gematched. Deze resultaten wijzen erop dat deze methode kan worden gebruikt om het succesvol identificeren protease specificiteit met MALDI-TOF massa spectrometrie.
Evaluatie van substraat specificiteit op verschillende pH niveaus met behulp van de muis Long extracten
Een van de voordelen van deze techniek was dat een groot aantal monsters tegelijk kan worden verwerkt. Deze studie aangetoond dat substraat specificiteit gewijzigd volgens pH-niveau (Figuur 3). In zure omstandigheden (figuur 3B; pH 5) was het molecuulgewicht van een gekloofd fragment 770.13 Da 826.66 Da. Deze resultaten aangegeven dat het Long weefsel extract proteasen met de mogelijkheid bevatte om het klieven in het C-terminus van glutaminezuur en tryptofaan. Als het pH-niveau geleidelijk verhoogd, de pieken van fragmenten gekloofd door glutaminezuur en tryptofaan geleidelijk gedaald, terwijl pieken van fragmenten gekloofd door arginine en lysine geleidelijk toegenomen (Figuur 3C, D, pH 7 en 9). Deze resultaten aangegeven dat het extract van de Long bevat twee of meer proteasen die had verschillende optimale pH en decolleté specificiteit.
Figuur 1: Schema voor het opsporen van protease specificiteit. (A) de structuur van iminobiotin-label substraat voor protease specificiteit. (B) de substraten had iminobiotin, een spacer Polyethyleenglycol, en een cleavable amino acid-website. (C) de spectra van iminobiotin-label substraten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: evaluatie van de methode om te bepalen van protease specificiteit met behulp van een gezuiverde enzym. (A) de spectra voor iminobiotin-geëtiketteerden substraten met TPCK-trypsine behandeld. De 839.81 en 796.76 toppen gematched de theoretische molecuulgewicht van fragmenten die worden gegenereerd door splitsing aan de zijkant van de C-terminal van lysine en arginine, respectievelijk. (B) de spectra voor iminobiotin-geëtiketteerden substraten behandeld met V8 protease. De 769.78 en 755.62 toppen gematched de theoretische molecuulgewicht van fragmenten die worden gegenereerd door splitsing aan de zijkant van de C-terminal van glutaminezuur en asparaginezuur, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: evaluatie van de methode om te bepalen protease specificiteit met behulp van weefsel extracten. De spectra voor iminobiotin-geëtiketteerden substraten die worden behandeld met een longweefsel uitpakken. Deze spectra tonen pieken verkregen op (A) pH 3, (B) pH 5, (C) pH 7 en pH 9 van de (D). (E) de iminobiotin-geëtiketteerden substraten geïncubeerd met het extract van de weefsel geïnactiveerd met thermische behandeling te evalueren van niet-specifieke spijsvertering. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| X | Voorloper | Gekloofd formulier |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| Ik * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: D-Ser-Xaa formulier | ||
Tabel 1: de theoretische molecuulgewicht van iminobiotin-label substraten en de verwachte molecuulgewicht van protease fragmenten. Sterretjes (*) geven toevoeging van D-serine tussen de polyethyleen spacer en het cleavable aminozuur.
| Xaa: Glycine, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, Leu, Asp, Gln, Glu, zijn, Phe, Arg, Tyr | |||
| Stadium | Fmoc-compound | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| Xaa: Cys Ile, Asn, Lys, voldaan, Trp | |||
| Stadium | Fmoc-compound | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tabel 2: Lijst met opeenvolgende voor substraat synthese gebruikte reagentia.
| pH | samenstelling | ||
| 9 | 50 mM Tricine met 0,1 M NaCl en 10 mM CaCl2 | ||
| 7 | 50 mM Tris-HCl met 0,1 M NaCl en 10 mM CaCl2 | ||
| 5 | 50 mM Natriumacetaat met 0,1 M NaCl en 10 mM CaCl2 | ||
| 3 | 50 mM citroenzuur met 0,1 M NaCl en 10 mM CaCl2 | ||
Tabel 3: Composities van de bufferoplossingen gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol gebruikt van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF om te identificeren protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel en gemakkelijk voor meerdere monster verwerking kan worden opgeschaald. In het bijzonder, we gemanipuleerd pH om te veroorzaken een verandering in de specificiteit van het substraat.
De avidin-Biotine complexe (ABC) methode, die wijd verbeid in de biochemie vanwege haar bindende specificiteit gebruikt is, werd gebruikt in ons protocol. Als gevolg van de sterke affiniteit van ABC is de binding van avidin aan biotine bijna onomkeerbaar. Affiniteit zuivering voor ABC is daarom zeer inefficiënt. Om deze reden rapporteren we dat de terugvinding voor Biotine-geëtiketteerden substraten verwachting laag. In deze studie gebruikten we alleen een lage pH-waarde voor de elutie; Nochtans, deglycosylated avidin-hars13 of14 van de monomeer avidin-hars kan ook worden gebruikt voor het zuiveren van biotine-geëtiketteerden substraten.
De methode voorgesteld in deze studie kan worden aangepast voor verschillende experimentele systemen en toepassingen; indachtig het feit dat de MALDI-TOF massa spectrometer is niet in staat kwantitatieve analyse uit te voeren. Zodra substraat specificiteit heeft vastgesteld, is het wellicht beter om het uitvoeren van kwantificering met behulp van spectrometrische testen, fluorimetrische analyses of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET).
De kalibratie van massaspectrometrie was de belangrijkste stap in dit protocol. In gevallen waar substraten met gelijkaardige molecuulgewichten worden gedetecteerd, kan de nauwkeurigheid van de resultaten worden verbeterd door het toevoegen van het molecuulgewicht van de precursoren.
Aangezien de enzym-reactie is verbeterd met de tijd, is het mogelijk uit te breiden van de reactie tijd als het enzym kan niet zitten speurder. Echter, de reactie blijven gedurende meer dan 24 uur laten resulteert in kant reacties die ongewenste pieken genereren. Daarom is het raadzaam om de reactie voor maximaal 18 h uitvoeren of om te bepalen van tests met hitte behandeld monsters. Deze procedure zou kunnen bepalen de specificiteit van de protease aan binnen een paar femtomol van trypsine.
Kortom, introduceren we een handige methode die gebruikmaakt van iminobiotin-label substraten te evalueren protease specificiteit. Deze methode zorgt voor de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters en kan worden gebruikt voor het vereenvoudigen van protease screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Nihon farmaceutische Universiteit onderzoek subsidie van Nihon farmaceutische Universiteit (2016) en de MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
