Summary
Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.
Abstract
Las proteasas tienen varias funciones biológicas, incluyendo digestión de comida y la activación/inactivación de proteínas. Identificar la especificidad de la proteasa es importante para revelar la función de la proteasa. El método propuesto en este estudio determina la especificidad de la proteasa midiendo el peso molecular de sustratos únicos mediante desorción/ionización del Laser asistida por matriz de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Los sustratos contienen iminobiotin, mientras que el sitio hendido consiste en aminoácidos, y consiste en el separador de glicol de polietileno. El sustrato exfoliado generará un único peso molecular utilizando un aminoácido exfoliado. Uno de los méritos de este método es que se puede llevar a cabo en una maceta utilizando muestras de crudo, y también es adecuado para evaluar las muestras múltiples. En este artículo, describimos un método experimental sencillo optimizado con muestras extraídas de tejido de pulmón de ratón, incluyendo extracción de tejido, colocación de sustratos digestivos en muestras, depuración de digestivos sustratos bajo condiciones de pH diferentes y la medición del peso molecular de los sustratos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En Resumen, esta técnica permite la identificación de la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, que puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples.
Introduction
Proteasas regulan procesos fisiológicos por unirse a las proteínas, y el inicio de la actividad de la proteasa en momentos concretos y lugares es regulada1. Por lo tanto es importante identificar la expresión y actividad de los tejidos que están reguladas localmente y para desarrollar un nuevo método para detectar las proteasas. El método propuesto en este estudio tiene como objetivo identificar la especificidad de la proteasa en paralelo a la detección de las proteasas.
Existen algunos métodos para detectar la especificidad de la proteasa. El método de azocasein es bien sabido para su uso en la detección de las proteasas2 pero está limitado en su capacidad para obtener más información. Zymography es otro método de detección integral de proteasa que puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteasas3, pero no puede utilizarse para examinar la especificidad de sustrato. Especificidad de la proteasa puede determinarse por análisis espectrométricos, utilizando sustratos como la p-nitroanilida4y los análisis fluorométrico, usando cumarina sustratos5 o de ensayos de transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET)6. Estos métodos permiten detección única especificidad de sustratos contenidos en un solo pozo. En el presente estudio, la especificidad de la proteasa de extractos de tejido se examina bajo diversas condiciones, ya que estos extractos contienen proteasas múltiples. Actividad de las proteasas es regulada por varios factores, incluyendo fuerza del ion, pH, coenzimas y grupos prostéticos. Recientemente, se han utilizado métodos basados en proteómica para identificar la especificidad de la proteasa; por ejemplo, el método reportado por Biniossek et al. 7 el proteoma se utiliza para determinar la especificidad de sustrato incluso en extractos crudos y permite la determinación exacta de la actividad de la hendidura de las proteasas que reconocen múltiples secuencias de aminoácidos8. Sin embargo, este método no es adecuado para el análisis de numerosas muestras. En cambio, nuestro método permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras y el uso de mediante desorción/ionización del Laser (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo espectrometría de masas para el análisis de la muestra facilita la detección rápida y fácil de la hendida sustratos.
Este documento describe un método para evaluar la especificidad de la proteasa utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF para medir el peso molecular de sustratos únicos. Las formas moleculares de sustratos troceados, junto con su peso molecular teórico, se muestran en la figura 1 y tabla 1. Estudios previos han utilizado substratos que contienen separadores de polyglycine y biotina9; sin embargo, estos sustratos son defectuosas porque la secuencia de polyglycine puede ser troceada por enzimas que reconocen la secuencia de la glicina. Además, la alta afinidad entre la avidina y la biotina puede conducir a una tasa de recuperación bajo. Para mejorar estos inconvenientes, en este estudio que sintetizaron un sustrato único, que fue compuesto de polietilenglicol (PEG), iminobiotin y un aminoácido que puede identificar el sitio de la hendidura (figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso molecular similar, D-serina fue agregado entre el espaciador PEG y el aminoácido en el sitio exfoliado.
El N-terminal del sustrato fue etiquetado con iminobiotin, que permite la purificación de la afinidad de muestras de crudo. El uso de iminobiotin en lugar de biotina es crítico; la biotina tiene una fuerte afinidad con la avidina, que se traduce en las tasas de baja recuperación de sustratos marcados con biotina de la resina de la avidina, mientras que la afinidad de iminobiotin de avidina puede ser alterado por pH. Sustratos marcados Iminobiotin se unirán a avidina en condiciones por encima de pH 9, mientras que la avidina libera sustratos marcados con iminobiotin en condiciones por debajo de pH 4. Por lo tanto, iminobiotin fue utilizado para la purificación de afinidad10. En Resumen, se describe un protocolo detallado para detectar la especificidad de proteasa utilizando sustratos únicos.
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Protocol
Protocolos experimentales animales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Nihon en industria farmacéutica y a cabo conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Nihon Pharmaceutical. El protocolo ha sido ajustado para los extractos de tejidos derivados de ratones ICR. Ratones ICR fueron comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japón)
1. preparación del sustrato marcado con Iminobiotin
El sustrato pasa por síntesis en fase sólida usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegidas aminoácidos como se describe a continuación11. Utilizar tabla 2 para determinar el Fmoc-compuesto utilizado, dependiendo de la etapa de síntesis y aminoácido deseado.
- Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL con 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) en una columna de síntesis.
- Añadir 5 mL de piperidina de 30% en DMF. Roca de la solución durante 10 minutos a unirse el grupo Fmoc.
-
Compruebe Fmoc escote con el ácido Trinitrobencenosulfónico (TNBS) prueba12: Añadir 10 μl de 1% tubo de TNBS en DMF y 10 μl de diisopropylethylamine (DIPEA) a un tubo de vidrio 10 x 75 mm2 , entonces la transferencia de una pequeña cantidad de resina del cristal. La resina de Fmoc-hendido debe desarrollar un color naranja.
- Repita los pasos 1.3 1.2 Si este resultado es negativo.
- Lavar la resina tres veces con 5 mL de DMF.
-
Añada 5 mL de DMF conteniendo 0,3 mmol de Fmoc-compuestos enumerados en la tabla 2 (comenzando con el compuesto usado en la etapa 1), 0,3 mmol de hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (TOHB) y 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). La solución por 30 min acoplar con la resina de la roca.
- Compruebe este paso con la prueba TNBS. Si el resultado es positivo, significa que la reacción no ha progresado lo suficiente y este paso debe repetirse.
- Lavar la resina tres veces con 5 mL de DMF.
- Repita la reacción de elongación repitiendo los pasos 1.2-1.6, cambiando el Fmoc-compuesto utilizado en el paso 1.5 según tabla 2.
- Añadir 1 mL de agua de 2.5%, 1% Triisopropilsilano (TIS) y 2.5% Etanoditiol (EDT) de ácido trifluoroacético para unirse a péptidos de los grupos de resina y protección. Roca la solución de 60 minutos.
- Filtrar y recoger el filtrado en un tubo de 50 mL.
- Añadir 40 mL de etanol frío dietílico y tienda durante la noche a-20 ° C.
- Centrifugar a 4.000 x g a-20 ° C para 30 minutos recoger el diábolo.
- Utilice un desecador durante 3 horas para eliminar el éter dietílico.
- Añadir 1 mL de acetonitrilo 50% agua y disolver los péptidos crudos. Liofilizar la solución para eliminar el ácido trifluoroacético. Repita este paso varias veces.
-
Purificar los péptidos usando una columna de cartucho C18.
- Activar la resina en la columna de cartucho de C18 con 3 mL de acetonitrilo (ACN).
- Equilibrar con 5 mL de 5% ACN, 0.1% TFA en H2O.
- Cargar el crudo péptidos sintéticos en la columna de cartucho C18.
- Lavar con 10 mL de 5% ACN, 0.1% TFA en H2O.
- Eluir las muestras con 3 mL de 60% ACN, 0.1% TFA en H2O.
-
Compruebe los péptidos mediante la medición de su peso molecular mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.
- Pipeta 1 μl del eluyente en un plato blanco. Inmediatamente añadir saturado solución de (CHCA) ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético
- Cristalizar la mezcla por secado al aire.
- Adquisición de espectros de masas de las muestras según protocolo del fabricante del instrumento.
- Configurar manualmente el espectrómetro de masas MALDI-TOF para un positivo reflejan el modo.
- Calibrar el espectrómetro de masas con CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotopic = Da 756.3997) y angiotensina II (peso molecular de monoisotopic = Da 1,045.5423).
- Adquisición de los espectros de masas de péptidos sintéticos y entonces evaluar comparando con el peso molecular teórico.
2. preparación de extractos de tejido
- Anestesiar ratones ICR machos en una cámara de inhalación isoflurane y verificar la profundidad de la anestesia mediante pellizco del dedo del pie. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical.
- Con unas tijeras, hacer una incisión abdominal de línea media a través de la piel que se extiende hasta el proceso del xiphoid.
- Corte a través del diafragma y recoger todo el tejido pulmonar. Cortar el tejido en trozos pequeños.
- Lavar el tejido tres veces con solución salina tamponada con Tris de helado 50 mM (pH 7,4).
- Peso de los tejidos y el traslado de aproximadamente 100 mg de los tejidos a un tubo de vidrio 12 x 75 mm2 .
- Agregar 0,3 mL de la solución de extracción (50 mM Tris-buffer, pH 7.4, que contiene éter de Octylpheny de poli (oxyethylene) 0.1%).
-
Homogeneizar las muestras de tejido pulmonar utilizando un homogeneizador de la mezcla.
- Enfriar las muestras en hielo.
- Homogeneizar las muestras a 20.000 rpm durante 30 s en licuadora. Repita este paso hasta que las muestras son totalmente homogéneas.
Nota: No homogeneizar durante más de 1 minuto de forma continua, para evitar un aumento de temperatura.
- Transferencia 1.000 μl del homogeneizado en un tubo de 1.5 mL y centrifugar durante 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
- Transferir 500 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de plástico de 1,5 mL.
- Utilice 10 μl de la muestra para determinar la concentración de proteína, utilizando métodos como el bicinchoninic ácido (BCA) o el método de Coomassie brillante azul (CBB).
- Para evitar la congelación, añadir glicerol al 80% de las muestras para una concentración final de glicerol al 50%.
- Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso posterior.
3. digestión de los sustratos en modelo proteasa y extractos de tejido
-
Añadir 10 μl de 0,1 μg/μl de cetona de clorometil N-tosyl-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 μg/μl de proteasa de Staphylococcus aureus V8 o 10 μg/μl de extractos de tejido en 890 μl de un buffer de digestión.
- Para aclarar la diferencia en la especificidad de la proteasa dependiendo del pH, use tampones ajustados a pH 3, 5, 7 y 9. La composición del buffer de digestión se muestra en la tabla 3.
- Llevar a cabo un control negativo con proteasa inactiva en los extractos de tejido, preparados por la incubación en agua hirviendo (o calentamiento a 100 ° C) durante 10 minutos.
- Añadir 10 μl de sustratos marcados iminobiotin (disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO), concentración final = 100 pmol/10 μl).
- Incubar durante 3 horas a 37 ° C para digerir sustratos marcados iminobiotin.
- Después de la incubación, detener la digestión de los sustratos con agua hirviendo (o por calentamiento a 100 ° C) durante 10 minutos.
- Centrifugue los sustratos digeridos por 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.
- Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.
4. purificación del substrato marcado con Iminobiotin
-
Añadir 50 μl de estreptavidina 50% sepharose granos que contiene 0.1% poly(oxyethylene) Octylpheny éter de 1 M Tris-buffer (pH 9).
- Utilice papel de prueba pH para asegurar que la solución es alrededor de pH 9. Si el pH de la solución es bajo, ajustar a pH aproximadamente 9 añadiendo que contiene 0.1% poly(oxyethylene) Octylpheny éter de 1 M Tris-buffer (pH 9). Este paso es importante, ya que implica la Unión del sustrato a estreptavidina marcada con iminobiotin.
- Incubar durante una noche a 4 ° C con mezcla suave continuo en una rueda de rotor para enlazar los sustratos marcados con iminobiotin a la estreptavidina. Los granos deben permanecer suspendidos a lo largo de la incubación.
- Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
-
Lavar los granos cinco veces como sigue:
- Añadir 1.000 μl de un buffer de lavado (50 mM Tris-buffer, pH 9) a los granos.
- Lavado durante 10 min a 4 ° C con mezcla suave continuo en una rueda de rotor. Los granos deben permanecer suspendidos a lo largo de la incubación.
- Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
-
Añada 100 μl del 0.2% de ácido trifluoroacético para los granos.
- Utilice papel de prueba pH para asegurar que la solución está por debajo de pH 2. Si el pH de la solución es alto, ajustar el pH a continuación 2 agregando 1% de ácido trifluoroacético.
- Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una rueda de rotor.
- Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C, y luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.
5. muestra preparación y desorción láser asistida por matriz/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF espectrometría de masa)
Nota: Todas las soluciones en los siguientes pasos deben ser preparadas con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)-grado o aminoácido secuencia-grade del agua.
- Pipetear 500 μl de acetonitrilo en una resina C18 para activarlo. Retire el acetonitrilo utilizado. Repita este paso tres veces.
- Equilibre la resina C18 con 100 μl de 0,1% de ácido trifluoroacético. Retire el eluyente. Repita este paso tres veces.
- Para cargar las muestras, las muestras se unen a la resina con ayuda de una pipeta.
- Lavar la resina con 20 μl de 0,1% de ácido trifluoroacético. Repita este paso cinco veces.
- Eluir las muestras con 3 μl de 60% de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético. Pipeta el eluyente en un plato blanco para espectrometría de masas MALDI-TOF. Añada inmediatamente saturado solución de (CHCA) ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético.
- Cristalizar la mezcla por secado al aire.
-
Adquisición de espectros de masas de las muestras según protocolo del fabricante del instrumento.
- Configurar manualmente el espectrómetro de masas MALDI-TOF para un positivo reflejan el modo.
- Calibrar el espectrómetro de masas con CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotopic = Da 756.3997) y angiotensina II (peso molecular de monoisotopic = Da 1,045.5423).
- Adquisición de los espectros de masas de las muestras, prestando mucha atención a los espectros de masas de 700 a 900 Da para la forma hendida de los substratos marcados con biotina.
- Identificar los picos detectados utilizando la tabla 1. Detección del peso molecular apropiado indica escote en el C-terminal del aminoácido correspondiente.
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Representative Results
Evaluación del método para la identificación de la especificidad de la proteasa por proteasa de modelo
Se evaluó la eficacia de este sistema utilizando TPCK-tripsina y proteasa V8, cuyas especificidades de sustrato se obtuvieron. Se estimaron TPCK-tripsina y proteasa V8 hender la secuencia de aminoácidos en el c-terminal de los residuos de lisina y arginina y en el lado carboxilo del ácido aspártico y residuos de ácido glutámico, respectivamente. Tabla 1 muestra el peso molecular teórico del sustrato y digerida por proteasas específicas de fragmentos. Digestión del substrato usando tripsina TPCK produce fragmentos exfoliados, dos de los cuales se pudieran detectar en 839.81 Da y Da 796.76 (figura 2A). Los pesos moleculares de estos fragmentos fueron estrechamente conforme a los teóricos pesos moleculares de los fragmentos divididos desde el C-terminal de lisina y arginina, respectivamente. Además, la proteasa V8 convierte sustratos precursores en su forma hendida, con pesos moleculares de 769.78 Da y Da 755.62 (figura 2B), que el teórico m/z de ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Estos resultados indican que este método podría utilizarse para identificar con éxito la especificidad de la proteasa con espectrometría de masas MALDI-TOF.
Extractos de la evaluación de la especificidad de sustrato en los niveles de pH diferentes con pulmón de ratón
Una de las ventajas de esta técnica fue que un gran número de muestras puede procesarse simultáneamente. Este estudio demostró que la especificidad de sustrato cambiado según el pH (figura 3). En condiciones ácidas (figura 3B; pH 5), el peso molecular de un fragmento exfoliado era Da 770.13 y Da 826.66. Estos resultados indicaron que el extracto de tejido del pulmón contiene proteasas con capacidad para unirse en el C-terminal del ácido glutámico y el triptófano. Como el nivel de pH gradualmente aumentado, los picos de fragmentos por el ácido glutámico y triptófano gradualmente disminuidas, mientras que picos de fragmentos troceados por la arginina y la lisina gradualmente aumentaron (figura 3C, D, pH 7 y 9). Estos resultados indicaron que el extracto de pulmón contiene dos o más proteasas que tenía diferentes especificidades óptimas de pH y escote.
Figura 1: esquema para la detección de especificidad proteasa. (A) la estructura del sustrato marcado con iminobiotin de especificidad de la proteasa. (B) los sustratos tenían iminobiotin, un espaciador de polietileno glicol y un sitio escindibles del aminoácido. (C) los espectros de sustratos marcados iminobiotin. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: evaluación del método para determinar la especificidad de la proteasa con una enzima purificada. (A) los espectros de sustratos marcados con iminobiotin trataron con tripsina de TPCK. Los picos 839.81 y 796.76 emparejado el peso molecular teórico de los fragmentos generados por clivaje en el lado c-terminal de lisina y arginina, respectivamente. (B) los espectros de sustratos marcados iminobiotin tratan con proteasa V8. Los picos 769.78 y 755.62 emparejado el peso molecular teórico de los fragmentos generados por clivaje en el lado de la terminal C del ácido glutámico y ácido aspártico, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: evaluación del método para determinar la especificidad de proteasa utilizando extractos. Los espectros de sustratos marcados con iminobiotin tratados con un tejido pulmonar del extracto. Estos espectros muestran picos obtenidos en (A) pH 3, pH (B) 5, (C) pH 7 y pH (D) 9. (E) el iminobiotin marcado con sustratos incuban con el extracto de tejido inactivado con tratamiento térmico para evaluar digestión inespecífica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| X | Precursor | Forma hendida |
| G | 886.58 | 697.58 |
| A | 900.60 | 711.60 |
| S | 916.59 | 727.59 |
| P | 926.61 | 737.61 |
| V | 928.63 | 739.63 |
| T | 930.61 | 741.61 |
| C * | 1003.57 | 814.57 |
| I * | 1013.64 | 824.64 |
| L | 942.64 | 753.64 |
| N * | 1014.60 | 825.60 |
| D | 944.59 | 755.59 |
| Q | 957.62 | 768.62 |
| K * | 1028.65 | 839.65 |
| E | 958.60 | 769.60 |
| M * | 1031.60 | 842.60 |
| H | 966.62 | 777.62 |
| F | 976.63 | 787.63 |
| R | 985.66 | 796.66 |
| Y | 992.62 | 803.62 |
| W * | 1015.64 | 826.64 |
| *: Forma D Ser de Xaa | ||
Tabla 1: el peso molecular teórico de sustratos marcados con iminobiotin y el peso molecular esperado de fragmentos proteasa. Los asteriscos (*) indican además de D-serina entre el espaciador de polietileno y el aminoácido escindibles.
| XAA: Gly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, Leu, Asp, Gln, Glu, su, Phe, Arg, Tyr | |||
| Etapa | Fmoc-compuesto | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Iminobiotin | ||
| XAA: Cys, Ile, Asn, Lys, Met, Trp | |||
| Etapa | Fmoc-compuesto | ||
| 1 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 2 | Fmoc-Xaa-OH | ||
| 3 | Fmoc-D-Ser (tBu)-OH | ||
| 4 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 5 | Fmoc-mini-PEG3-OH | ||
| 6 | Iminobiotin | ||
Tabla 2: Lista secuencial de los reactivos utilizados para la síntesis del sustrato.
| pH | composición | ||
| 9 | 50 mM Tricina con 0.1 M de NaCl y CaCl2 de 10 mM | ||
| 7 | 50 mM de Tris-HCl con 0,1 M de NaCl y 10 mM CaCl2 | ||
| 5 | acetato de sodio 50 mM que contiene 0,1 M de NaCl y 10 mM CaCl2 | ||
| 3 | ácido cítrico de 50 mM que contiene 0,1 M de NaCl y 10 mM CaCl2 | ||
Tabla 3: Composición de las soluciones buffer utilizadas.
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Discussion
Este protocolo utiliza la espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejido y puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples. En particular, manipulamos pH para causar un cambio en la especificidad de sustrato.
Se utilizó el método de (ABC) complejo avidina-biotina, que ha sido ampliamente utilizado en Bioquímica debido a su especificidad de Unión, en nuestro protocolo. Debido a la fuerte afinidad de la ABC, la Unión de la avidina con biotina es casi irreversible. Purificación de la afinidad para la ABC, por tanto, es altamente ineficiente. Por esta razón, se reporta que la tasa de recuperación de sustratos marcados con biotina se espera que sea baja. En este estudio, hemos utilizado un nivel de pH bajo para elución; sin embargo, deglycosylated avidina-resina13 o14 de avidina-resina monomérica puede también utilizar para purificar los sustratos marcados con biotina.
El método propuesto en este estudio se puede ajustar para diferentes sistemas experimentales y aplicaciones; teniendo en cuenta que el espectrómetro de masas MALDI-TOF es incapaz de llevar a cabo análisis cuantitativo. Una vez que se ha determinado la especificidad de sustrato, puede ser mejor realizar cuantificación mediante análisis espectrométricos análisis fluorométrico y transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET).
La calibración de espectrometría de masas fue el paso más importante en el presente Protocolo. En los casos donde se detectan los sustratos con similares pesos moleculares, se puede mejorar la exactitud de los resultados añadiendo el peso molecular de los precursores.
Puesto que la reacción enzimática se ha mejorado con el tiempo, es posible extender el tiempo de reacción si la enzima no puede ser detectada. Sin embargo, dejar la reacción durante más de 24 h resulta en reacciones secundarias que generan picos indeseados. Por lo tanto, es recomendable llevar a cabo la reacción para hasta 18 h o para control de pruebas usando calor trata muestras. Este procedimiento puede determinar la especificidad de la proteasa para dentro de unos pocos femtomol de tripsina.
En conclusión, presentamos un método práctico que utiliza sustratos marcados con iminobiotin para evaluar la especificidad de la proteasa. Este método permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras y puede usarse para simplificar la detección de la proteasa.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por la beca de investigación Universidad Farmacéutica Nihon Nihon Pharmaceutical University (2016) y el MEXT KAKENHI concesión número JP17854179.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminomethyl]phenoxy resin) |
Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
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