Summary

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

Published: March 16, 2018
doi:

Summary

すべての病原性リーシュ マニア原虫種に存在し、脊椎動物のホストのマクロファージ内で複製。ここでは、リーシュ マニア、続いて細胞増殖動態の正確な定量培養マウス骨髄由来マクロファージに感染するプロトコルを提案する.このメソッドは、リーシュ マニアの病原性と宿主-病原体相互作用に影響を与える個々 の要因を調べる場合に役立ちます。

Abstract

リーシュ マニア、リーシュ マニア症の原因となるエージェントのライフ サイクルそれぞれ昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホスト間で交互に行います。脊椎動物の段階で感染種によって非常に致命的な内臓疾患形態に良性の皮膚病変から広く、リーシュ マニア症の病原性の症状があります、すべてのリーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージの内部に存在します。そのライフ サイクル。リーシュ マニア感染が侵入し生き残るため、マクロファージ内 parasitophorous 液胞 (PVs) 内のレプリケート機能に直結したがってします。したがって、細胞内で複製する寄生虫の能力評価は、病原性を決定するための信頼性の高い方法として機能します。モデル動物を用いたリーシュ マニア症開発の勉強は時間がかかり、退屈で、多くの場合困難である特に pathogenically 重要な内臓フォームです。骨髄由来マクロファージ (BMMs)リーシュ マニア原虫の細胞内の発展を追跡する方法をご紹介します。細胞内の寄生虫数は 72 96 h の感染のための 24 時間間隔で決定されます。このメソッドは、リーシュ マニア病原性に及ぼすさまざまな遺伝的要因の信頼性の高い定量できます。リーシュ マニア原虫ミトコンドリア鉄トランスポーター遺伝子 (LMIT1) の単一の対立遺伝子の削除がリーシュ マニア amazonensis変異株LMIT1/ΔLmit1の BMMs、内部成長能力を損なう方法を示す例については、野生型と比較して毒性の大幅な削減を反映しています。この試金は、宿主-病原体相互作用に及ぼす諸要因(栄養素、活性酸素種など)の分析を個別に操作できる実験条件を正確に制御できます。したがって、適切な実行と BMM 感染症研究の定量化は、従来の動物モデル研究の非侵襲的、急速な経済的な安全で信頼性の高い代替を提供します。

Introduction

リーシュ マニア症は、原虫リーシュ マニア属の種によって引き起こされる人間の病気の広いスペクトルを指します。約 1200 万人現在リーシュ マニア、世界中に感染しているし、以上 3 億 5000 万が危険にさらされます。病の病理は、リーシュ マニア原虫種と宿主因子によって決まるし、症状が無害な自己治癒皮膚病変から致命的な visceralizing フォームに変わる。最悪の人間の病気としてマラリア後だけランキングが1原虫感染によって引き起こされる未処理、内臓リーシュ マニア症は致命的な場合。病の病理や症状に多岐にわたる違いがあるにもかかわらずすべてのリーシュ マニア原虫種昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホストをそれぞれ交互 digenic ライフ サイクルがあります。内部脊椎動物、リーシュ マニアホスト マクロファージ浸潤、parasitophorous 液胞 (Pv)、高度病原性 amastigote フォームが複製ファゴライソゾームの特性と酸性コンパートメントの形成を誘導します。Amastigotes 慢性感染の間に宿主組織の永続化および伝送サイクルを完了するに感染していないサシチョウバエを渡されることができます。したがって、人間の病気の開発の中で、amastigotes は、最も重要なリーシュ マニアライフ サイクル フォーム2です。理解リーシュ マニア病原性3,4,5,67のための重要なマクロファージ Pv 内での amastigotes の複製方法の調査は、新規の効果的な治療法の開発。

リーシュ マニア感染や骨髄由来マクロファージ (BMMs)、時間の経過とともに細胞内リーシュ マニア原虫の数の定量的評価を含むレプリケーションを研究する研究室による定期的な利用法をご紹介します。リーシュ マニアの定量化の文化におけるマクロファージに感染フォーム (metacyclic promastigotes または amastigotes)の in vitro感染マウス骨髄と分化から球の収穫には、細胞内寄生虫感染 72 96 h の期間の 24 時間間隔での数です。この試金は、いくつかの環境要因および足蹠でさらに検証されたL. amazonensis病原性の促進に鉄の役割の重要性の識別を含む寄生虫の遺伝子の影響を判断する私たちの研究室で使用されていますマウス6,8,9,1011,12,13,14,15 病変の開発研究.以来、すべての病原性リーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージ内の複製のニッチを確立、この試金はすべてリーシュ マニア原虫種の病原性決定の普遍的に使用できます。

BMM 感染症を実行する単一セルのレベルでホスト寄生虫相互作用の解析とこうしてリーシュ マニア原虫が彼らのホストの優先の微小環境、マクロファージの PVs と対話する方法のより広範な理解ことができます。探索する正常にマクロファージ感染アッセイ複数グループ16,17,18,19,20,21,22で使用されています。ホスト マクロファージや細胞内感染症を特徴付ける複雑な相互作用の彼らの潜在的関与やリーシュ マニア原虫遺伝子の機能。BMM の感染症は、寄生虫としての成長、読み出し殺菌一酸化窒素産生、活性酸素種の生成および他の不利な条件など、細胞の生存に影響を与えるホストの要因の影響の定量化を許可します。ライソソーム様 Pv23中が発生しました。マクロファージ感染アッセイは、治療開発13,24の潜在的な抗 leishmanial 薬リードを識別するために利用されています。

BMM 感染症の体外性質は、リーシュ マニア病原性を評価するために他の方法に比べていくつかの利点を提供します。ただし、時間の経過とともに細胞内寄生虫生存のメカニズムを調べるいくつかの以前の研究では、感染率20,21,24は定量化しなかった。さらに、次の時間をかけて生体内で感染症に焦点を当てた多くの研究によってそう寄生虫レプリケーション25,26に間接的にのみ関連が他の生理学的な症状や皮膚病変の長さを測る,27.体内感染寄生生物の毒性を評価するために厳格なアプローチが単独で腫れ足蹠に基づく病変サイズ測定はしばしば不十分で彼らは感染した組織の炎症反応を反映してではなく、寄生虫の絶対数。このため、足蹠ヒメシバの試金が感染した体内寄生虫の負荷の定量化が続いて長い制限希釈を必要とする手順28の試金します。さらに、研究生体内では度々 関心6,8,9,10,の組織を抽出する時に別のポイントで複数の動物を犠牲にします。11,13。 対照的に、ちょうど 1 つの動物から得られる BMMs の数が多いと、これらの細胞は、時間の様々 なポイントで感染症の評価を許可する条件の下でめっきすることが。さらに、生体内での研究と比較すると実験条件をより細かく制御 BMM 感染体外を実行できます。寄生虫自身と一緒に感染するマクロファージの定量化は、感染 (MOI) と培養条件の多様性の正確に制御できます。これらの要因を細かく制御は、離散細胞経路の特性を識別する内感染に与える影響を理解する上でのキーをすることができます。

これらの利点を考えると、それはリーシュ マニア病原性を研究する非常に少数グループがマクロファージの細胞内複製の定量的評価をフルに活用を撮影ところやや意外。この資料では、このアッセイのより広範な利用を妨げる、その適切な実施を促進するステップバイ ステップのプロトコルを提供可能性があります一般的な落とし穴について述べる.精度、汎用性を考慮してここで述べる BMM 感染試験ないのみ利用できるリーシュ マニア病原性に影響を及ぼす宿主-病原体相互作用を探索する内で複製その他の微生物の研究にもマクロファージ29。重要なは、この試金は反 leishmanial 医薬品開発の迅速かつ経済的な前臨床スクリーニング法としても開発できます。

Protocol

すべての実験手順はケアと実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従って健康の国民の協会によって実施され、メリーランド大学 IACUC によって承認されました。1 4 からのセクションで説明するすべての手順は、生物層流キャビネット内無菌実施されなければなりません。個人用保護具を使用する必要がありますと実験のすべての段階を通してライブリーシュマニア原虫の処理中?…

Representative Results

リーシュ マニアは 2 つの感染形 – metacyclic promastigotes procyclic promastigotes から文化の固定相で区別する amastigotes、細胞内ステージ (図 1) であります。L. amazonensisなどのいくつかのリーシュ マニア原虫種の amastigotes 区別できます無菌培養で pH (4.5) および高温 (32 ° C)、BMM PVs の中見つけられるそれらに類似した条件を下げる promasti…

Discussion

上記、BMM 感染試験によって生成された定量的データにより、感染率と比較的短い期間 (最長 2 週間、2 に比べて病原性の変化の信頼性の決定を取得します。ヶ月生体内で実験に必要な)。このメソッドは、DNA 特定色素 DAPI、特にマクロファージと寄生虫の核を汚れと感染細胞の迅速な同定及び定量化に依存します。比較では、ギムザなどの他の汚れは強さを変化させて、複雑な視覚分析<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国立衛生研究所健康付与 RO1 AI067979 NWA によって支えられました。
有限会社は、学部の交わりからハワード ヒューズ医学研究所/大学のメリーランド州カレッジパークの受信者です。

Materials

6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

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Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

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