Summary
Hier beschrijven we een methode voor het genereren van driedimensionale sferoïde culturen van menselijke nasale epitheliale cellen. Spheroïden worden dan gestimuleerd naar station Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR)-afhankelijk van de ion en vloeistof secretie, kwantificeren van de verandering in de sferoïde luminal grootte als een proxy voor CFTR-functie.
Abstract
Terwijl de invoering van Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator (CFTR) modulator drugs heeft een revolutie teweeggebracht in zorg in Cystic Fibrosis (CF), heeft het genotype gerichte therapie model momenteel in gebruik verschillende beperkingen. Eerste, zeldzame of understudied mutatie groepen zijn uitgesloten van de definitieve klinische proeven. Bovendien, zoals extra modulator geneesmiddelen de markt betreden, het zal moeilijker geworden voor het optimaliseren van de modulator keuzes voor een individuele certificaathouder. Beide zaken worden behandeld met het gebruik van patiënt-afgeleid, geïndividualiseerde preklinische modelsystemen van CFTR-functie en modulatie. Menselijke nasale epitheliale cellen (HNEs) zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van respiratoire weefsel voor een dergelijk model. Hierin beschrijven we de generatie van een driedimensionale sferoïde model van CFTR-functie en modulatie met behulp van primaire HNEs. HNEs zijn geïsoleerd van onderwerpen in een minimaal invasieve manier, uitgebreid in voorwaardelijke herprogrammering voorwaarden, en in de cultuur sferoïde agarvoedingsbodem. Binnen 2 weken na het zaaien, sferoïde culturen genereren HNE spheroïden die kunnen worden gestimuleerd met 3', 5'-cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP)-het genereren van agonisten CFTR-functie te activeren. Sferoïde zwelling is dan gekwantificeerd als een proxy voor CFTR-activiteit. HNE spheroïden kapitaliseren op de minimaal invasieve echter respiratoire oorsprong van nasale cellen voor het genereren van een toegankelijke, gepersonaliseerde model relevant zijn voor een epitheel die als gevolg van ziekte morbiditeit en mortaliteit. Vergeleken met de air-liquide interface HNE culturen, zijn spheroïden relatief snel te rijpen, die vermindert de totale verontreiniging tarief. In zijn huidige vorm, wordt het model beperkt door lage doorvoersnelheid, maar dit wordt gecompenseerd door het relatieve gemak van weefsel overname. HNE spheroïden kunnen worden gebruikt om betrouwbaar kwantificeren en karakteriseren CFTR activiteit op het individuele niveau. Een lopend onderzoek te binden deze kwantificering in vivo drug antwoord zal bepalen of HNE spheroïden een ware preklinische voorspeller van patiënt reactie op CFTR modulatie zijn.
Introduction
Cystic Fibrosis (CF) is een fatale, autosomaal recessieve ziekte die meer dan 70.000 mensen wereldwijd1. Deze leven-verkorting genetische ziekte wordt veroorzaakt door mutaties in de Cystic Fibrosis Transmembrane huidgeleiding Regulator eiwit (CFTR)2. CFTR is een lid van de familie van adenosinetrifosfaat-binding cassette, en functies als ionkanaal waardoor verkeer van chloride en bicarbonaat in de apicale membraan van meerdere gepolariseerde epitheel, met inbegrip van het maag-darmkanaal, zweetklier, en respiratoire tree, o.a.3,4. Als zodanig, leidt disfunctionele CFTR naar Multisysteem epitheliale dysfunctie, met de meeste sterfte als gevolg van de respiratoire ziekte1. In de CF Long, verlies van CFTR-gedreven airway oppervlakte vloeibare (ASL) verordening en slijm release leidt tot verdikt slijm, obstructie, chronische infectie, en progressieve airway remodeling alsmede van1,5van de functie van de longen.
Ondanks de identificatie van CFTR dysfunctie als de oorzaak van de ziekte, therapieën in CF oudsher gericht op mitigatie van symptomen (bijv, alvleesklier enzym substitutietherapie, luchtweg klaring therapieën)1. Deze aanpak werd onlangs een revolutie door de komst van nieuwe therapeutics, genoemd "CFTR modulatoren," die rechtstreeks gericht zijn op disfunctionele CFTR. Deze aanpak is de klinische landschap verschoven van symptoom beheer naar ziekte-aanpassen verzorgen maar draagt verschillende beperkingen6,7,8,9,10. Modulator activiteit is specifiek voor het eiwit defect begeleidende elke CFTR-mutatie en beperkt tot het selecteren van genetische populaties11. Deze beperking wordt gedreven door het heterogene karakter van eiwit gebreken, maar ook door de onuitvoerbaarheid van klinische proeven in zeldzame mutatie groepen. Daarnaast, onder onderwerpen met goed bestudeerde genotypen (b.v., F508del/F508del CFTR, de meest voorkomende CFTR-mutatie), is er grote variabiliteit in ziekte lasten en modulator reactie6,,7,8 ,9,11.
Om te overwinnen beide zaken, hebben onderzoekers voorgesteld het gebruik van de gepersonaliseerde modellen voor preklinische testen12. Dit concept maakt gebruik van patiënt-specifieke weefsel voor het genereren van een geïndividualiseerde ex vivo modelsysteem voor het testen van de samengestelde, het voorspellen van in vivo onderwerp reactie op therapieën op een persoonlijke manier. Eenmaal gevalideerd, kan een dergelijk model worden gebruikt door clinici naar station precisie therapie ongeacht het onderliggende CFTR genotype van de patiënt.
Menselijke bronchiale epitheliale (HBE) cellen explant weefsel verkregen op het tijdstip van Long transplantatie opgericht de mogelijkheid van een dergelijk model voor CF13,14. HBEs geteeld op een lucht-vloeistof-interface (ALI) is voorzien van functionele CFTR kwantificering rechtstreeks via het electrophysiologic testen, of indirect via maatregelen van ASL homeostase13,15. Dit model is cruciaal geweest voor het begrip CFTR biologie en was een belangrijke stimulans in de ontwikkeling van CFTR modulatoren16. HBE modellen zijn helaas niet houdbaar als een gepersonaliseerde model vanwege het invasieve karakter van verkrijging (Long transplantatie of bronchiale borstelen) en het ontbreken van monsters voor mensen met zeldzame mutaties of milde ziekte. Omgekeerd, intestinale weefsel, verkregen uit rectale of duodenale biopsie monsters, kan worden gebruikt voor intestinale Stroommeting (ICM) of een zwelling gebaseerde organoid assay te bestuderen van geïndividualiseerde CFTR functie17,18, 19. Organoid tests, in het bijzonder zijn zeer gevoelige modellen van CFTR activiteit20,21,22. Beide modellen zijn beperkt door de weefsel bron (intestinale weefsel, terwijl de meeste ziekte pathologie respiratoire is) en de semi-invasieve methode van overname. U kunt ook hebben verschillende onderzoekers bestudeerd menselijke nasale epitheliale cellen van het (HNE) tot model CFTR restauratie23,24,25. HNEs veilig geoogst kan worden met de borstel of curettage in onderwerpen van elke leeftijd en wanneer gekweekt in ALI, recapituleren veel kenmerken van HBEs25,26,27,28. HNE enkelgelaagde culturen hebben traditioneel beperkt gebleven door squamous transformatie en een lange tijd tot en met29van de looptijd. Bovendien gemeld kortsluiting huidige metingen in HNEs zijn kleiner dan die in HBEs, een kleiner venster te sporen therapeutische werking25suggereren.
Gezien de behoefte aan een persoonlijke, niet-invasieve respiratoire weefselkweek model van CFTR-functie, die wij willen samenvoegen van de gevoeligheid van een zwelling gebaseerde, organoid assay met de niet-invasieve en respiratoire aard van HNEs. Hier beschrijven we onze methode voor de opwekking van 3-dimensionale "sferoïde" culturen van HNEs voor geïndividualiseerde CFTR-studie in een zwelling gebaseerde assay-30. HNE spheroïden polariseren betrouwbaar met de epitheliale apex richting het centrum van het gebied, of lumen. Dit model recapituleert vele kenmerken van een lagere respiratoire epitheel en rijpt sneller dan ALI culturen. Als een functionele assay kwantificeren HNE spheroïden betrouwbaar een bereik van CFTR-functie, evenals de modulatie in goed bestudeerde mutatie groepen (bijvoorbeeld, F508del CFTR). Deze zwelling gebaseerde assay speelt in op de ion/zout vervoer eigenschappen van CFTR, niet indirect meten vloeistof toestroom in de sferoïde als water apicale zout efflux volgt. Op deze wijze zwellen gestimuleerd spheroïden met volledig functionele CFTR krachtig, terwijl die met disfunctionele CFTR minder zwellen of krimpen. Dit wordt gekwantificeerd door beeldanalyse van pre- en 1 h na stimulatie spheroïden, luminal oppervlakte te meten en het bepalen van het percentage wijzigen. Deze maatregel kan vervolgens worden vergeleken tussen de experimentele groepen aan het scherm voor drug topicale in een patiënt-specifieke mode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE monsters werden verkregen onderwerpen aangeworven door de Cincinnati Children's Hospital Medical Center CF Research Center. Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Schriftelijke toestemming is verkregen uit alle onderwerpen vóór de test.
1. voorbereiding van de uitbreiding Media en antibiotica
- Verzamelen mediacomponenten vermeld in tabel 1. Ontdooien van bevroren materialen bij kamertemperatuur en maken noodzakelijk stamoplossingen zoals aangegeven in tabel 1 onder "Uitbreiding Media".
Opmerking: Wees voorzichtig bij het verwerken van cholera-toxine, die giftig is wanneer ingenomen, en is een huid, ogen en luchtwegen irriterend. Maken en alle oplossingen en media onder schone omstandigheden in het biosafety kabinet te combineren. - Met behulp van een serologische Pipet van 50 mL, verwijder en werp 50 mL basis medium (Dulbecco bewerkt Eagle Medium/F12) van een container om te compenseren voor de toevoeging van andere materialen. Giet alle base media met de hand in een gesteriliseerde met autoclaaf 1 L-fles.
- Pipetteer een serologische Pipet van 50 mL of 1 mL pipet gebruikt gelang van het geval, alle resterende onderdelen van de sectie van de "Expansie Media" van tabel 1 in de gesteriliseerde met autoclaaf glazen fles die het medium bevat. Zachtjes swirl de fles met de hand te mengen.
- Filtreer media in een frisse, steriele 1 L, 0,22 µm polyethersulfon (PES) filtreerkolf met behulp van de instructies van de fabrikant en annoteren met "Uitbreiding Media" en de datum.
-
Antibiotica Media voor te bereiden. Maken van de nodige antibiotica stamoplossingen zoals aangegeven in tabel 1 onder "Antibiotica Media."
- Met behulp van een serologische Pipet van 50 mL, breng 150 mL van expansie Media een verse 250 mL gesteriliseerde met autoclaaf glazen fles.
- Met behulp van een pipet 1 mL, voeg alle componenten van de sectie van de "Antibiotica Media" van tabel 1 in de gesteriliseerde met autoclaaf glazen fles die het medium bevat. Swirl met de hand te mengen tot de media uniform in verschijning is.
- Filtermedia in een frisse, steriele 250 mL, 0,22 µm PES filtreerkolf met behulp van de instructies van de fabrikant en annoteren met "Antibiotica Media" en de datum.
- Opgeslagen media bij 4 ° C voor maximaal één maand, teruggooi als bewolkt, suggereren besmetting.
2. voorbereiding van de differentiatie Media
- Verzamelen mediacomponenten vermeld in tabel 2. Ontdooien van bevroren materialen bij kamertemperatuur en maken noodzakelijk stamoplossingen zoals aangegeven in tabel 2.
Opmerking: Wees voorzichtig bij het hanteren van retinoïnezuur, oftewel een reproductieve toxine, kan giftig bij inslikken en veroorzaakt irritatie van de huid. Maken, aliquoot en combineren alle oplossingen en media onder schone omstandigheden in het biosafety kabinet. - Verwijder en werp 52 mL van het basis medium uit een container om te compenseren voor de toevoeging van andere materialen. Giet alle base media in een gesteriliseerde met autoclaaf 1 L-fles.
- Een serologische Pipetteer 25 mL of 1 mL pipet voorkomend, alle resterende onderdelen uit tabel 2 overbrengen in de gesteriliseerde met autoclaaf glazen fles die het medium bevat en swirl zachtjes met de hand te mengen.
- Filtreer media in een frisse, steriele 1 L, 0,22 µm polyethersulfon (PES) filtreerkolf met behulp van de instructies van de fabrikant en annoteren met "Differentiatie Media" en de datum.
- Opgeslagen media bij 4 ° C voor maximaal één maand, teruggooi als bewolkt, suggereren besmetting.
3. vacht cultuur gerechten en Plate Feeder fibroblasten
Opmerking: Voer alle stappen uit onder schone omstandigheden in het biosafety kabinet.
- Meng 0,5 mL collageen voorraad en 37,5 mL steriel water in een conische tube van 50 mL.
- Pipetteer 4-5 mL van de oplossing van het collageen in elke schone P100 cultuur schotel, ervoor te zorgen dat het gehele oppervlak bedekt is.
- Dekking van gerechten met deksels en na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijder alle schotel deksels in het biosafety kabinet. Swirl oplossing om dekking van de schotel, dan gecombineerd.
- Steriliseren door blootstelling aan ultraviolet (UV) licht voor 1 h. plaats deksels terug op de gerechten, gerechten van de stack en dekken met aluminiumfolie.
- Winkel gecoat gerechten bij 4 ° C gedurende 3-6 maanden, opnieuw steriliseren onder UV-licht 15-30 min vóór mobiele cultuur te gebruiken.
- 24 uur vóór het verkrijgen van een HNE monster, steriliseren een vooraf gecoate schotel en een label als muis embryonale Fibroblast (MEF) en de datum.
- De Media van de uitbreiding ter dekking van de plaat (circa 5 mL) met een serologische pipet toevoegen.
- Ontdooi een flacon van 2 x 106 bestraalde MEFs in 37 ° C waterbaden. Zodra de MEFs zijn ontdooid, kunt u de helft van de flacon (ongeveer 106 cellen) toevoegen aan de schotel met een 1 mL Pipet, wervelende met de hand om te dispergeren.
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 overnachting in voorbereiding HNE cultuur.
Opmerking: Indien nodig stappen 3.7-3.10 kunnen worden uitgevoerd zo laat 60 min vóór plating cellen, maar 's nachts is ideaal.
4. ophalen en verwerken van HNE monster
- Zorgen IRB-goedgekeurde toestemming/instemming is verkregen voor alle certificaathouders.
- Hebben patiënten klap neus om los slijm.
- Visualiseren van inferior turbinate met behulp van een rhinoscope. Zorgen geen letsels of poliepen zijn aanwezig zijn die sample collectie beletten kan.
-
Nasale cellen van de eerste neusgat verzamelen door curettage of afborstelen.
- Curettage: Bend-curettage op haar middelpunt te maken van een lichte, ~ 135° hoek met de apex van de curettage cup. Breng in het neusgat, de curettage en vooraf de curettage cup onder de turbinate inferior. Zachtjes druk op de curettage cup tegen het inferieur turbinate en schraap de turbinate door te trekken de curettage forward, herhalende 3 - 4 keer total.
- Borstel: Pass de cytologie borstel onder het inferieur turbinate, dan draaien en verplaatsen van de borstel en licht 4 - 5 keer, zonder het verlaten van de neusgat.
- Plaats curettage/borstel in een conische 15 mL gevuld met antibiotica Media. Herhaal stap 4.3-4.4 voor het andere neusgat, het plaatsen van de curettage/borstel in de dezelfde conische buis.
- Winkel conische op ijs totdat u voor verwerking. Ervoor zorgen dat de verwerking binnen 4 uur van monster overname plaatsvindt maar zo laat zoals 24 h na de overname kan optreden indien nodig.
5. verwerken en HNE cellen in gerechten uit te breiden
Opmerking: Voer alle stappen uit onder schone omstandigheden in het biosafety kabinet.
- Gebruik een 1 mL pipet en de media uit het monster kegelvormig, wassen alle cellen off van Curettes|/cytologie borstels in de dezelfde conische buis. Zodra schoon, negeren Curettes| / borstels.
- Centrifugeer conische bij 360 x g- en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Gecombineerd supernatant, het verzorgen niet te verstoren, de cel-pellet.
- Resuspendeer de pellet cel in 3 mL cell detachement oplossing, pipetteren met een 1 mL tip om het homogeniseren van het mengsel.
- Centrifugeer conische bij 360 x g- en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Herhaal stap 5.3-5.5 eens.
- Gecombineerd resterende bovendrijvende substantie, niet te verstoren de cel pellet verzorgen.
- Resuspendeer de pellet in 1 mL antibiotica Media en cellen tellen met een hemocytometer.
- Met behulp van een pipet 1 mL, plaat cellen ontkleuring op de schotel van het gecoate, fibroblast-geplaatste bereid in stap 3.10. Toevoegen van antibiotica Media om volledig dekken de schotel en de cellen verspreiden over het oppervlak. Label schotel met inhoud en datum en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 48u, zorgen ervoor dat de cellen zijn gekoppeld aan de cultuur-schotel. De media gecombineerd en vervangen met genoeg verse antibiotica Media ter dekking van de plaat.
- Wijzigen van media 3 x per week, oude media met een vacuüm Pipet van Pasteur en zuigen, en genoeg verse media ter dekking van de plaat te vervangen. Na 5 dagen op antibiotica Media, door de media te omzetten in expansie Media, blijven drie keer per week vervangen.
Opmerking: Risico op besmetting is hoog in de eerste week van de cultuur. Houd verse monsters in een aparte incubator om te minimaliseren van het risico van kruisbesmetting. - Controleer de celgroei meerdere malen per week. Zodra de cellen zijn ongeveer 70-80% heuvels, gaat u verder met de passage cellen.
6. passage HNE cellen
-
Bereid trypsine-oplossing 0,1% in ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA).
Opmerking: Wees voorzichtig hanteren trypsine, oftewel een huid, luchtwegen, en de ogen irriterend.- Weeg 15 mg trypsine uit de alvleesklier varkens in een conische buis.
- Weeg 56 mg EDTA in een aparte conische buis.
- Pipetteer in het kabinet van de bioveiligheid, trypsine en EDTA in een gesteriliseerde met autoclaaf 250 mL glazen fles. Gebruik een kleine hoeveelheid van steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) te spoelen van de trypsine/EDTA buizen om ervoor te zorgen volledige overdracht.
- Steriele PBS te brengen van de totale oplossing 150 ml toevoegen. Sluit de deksel strak.
- Incubeer trypsine oplossing in 37 ° C waterbaden totdat volledig is opgelost. Controleer elke 15 minuten en verwijder snel eens ontbonden.
Opmerking: Laat geen ongecontroleerde voor langdurig van tijd (bijvoorbeeld 's nachts) als trypsine in oplossing denatureren zal bij verhitting te lang. - Reinigen van de fles met 2-3 sprays van 70% ethanol en terugkeren naar het biosafety kabinet.
- Filtreer trypsine-EDTA-oplossing 0,1% in een frisse, steriele 250 mL, 0,22 µm PES filtreerkolf met behulp van de instructies van de fabrikant en annoteren met inhoud en datum.
- Opslaan trypsine-EDTA-oplossing bij 4 ° C voor maximaal één maand, teruggooi als bewolkt.
- Breng differentiatie Media, trypsine-EDTA-oplossing 0,1% en steriele PBS op kamertemperatuur meer dan 30 min. schone met 70% ethanol en overdracht aan een schone bioveiligheid kabinet.
- In het biosafety kabinet, kunt een vacuüm lijn en de Pipet van Pasteur gecombineerd en zich ontdoen van media van weefselkweek schotel. De schotel door toe te voegen, zwenken en zuigen 5 mL PBS met behulp van een precisiepipet schoon serologische wassen.
- Met behulp van serologische Pipetteer 5 mL, voeg 5 mL trypsine-EDTA-oplossing van 0,1% tot de schotel weefselkweek en terugkeren naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 min.
- Visualiseren van cellen op een omgekeerde Microscoop op 4-10 X. Controleer of de cellen van de schotel loskoppelen, ronde worden, en zweven. Tik zachtjes op de kant van de cultuur-schotel verjagen van cellen en/of opnieuw Incubeer gedurende een extra 5 minuten totdat de meeste cellen zijn vrijstaand.
Opmerking: Nemen voorzichtigheid om snel te verwijderen cellen eenmaal los van de schotel van cultuur; levensvatbaarheid van de cellen van de langdurige blootstelling aan 0,1% trypsine-EDTA zal schaden. - Met behulp van serologische Pipetteer 10 mL, voeg 5 mL van expansie Media aan de schotel en verzamelen van alle vloeibare inhoud (10 mL totaal) in een conische buis van gelabelde, steriele 50 mL.
-
Als cellen blijven aanhangend op de cultuur-dish, herhaal stap 6,4 via 6.6 omhoog tot twee keer, verzamelen inhoud in de dezelfde conische buis.
- Als cellen blijven aanhangend aan de cultuur-schotel na drie rondes van trypsine oplossing blootstelling, gebruik een steriele cel schraper zachtjes de rest verwijderen. Na het slijmen de schotel, de schraper en schotel met 5 mL uitbreiding Media wassen en verzamelen in de dezelfde gelabelde conische buis.
Opmerking: Als passaging om spheroïden, wijzigt u deze procedure voor het uitvoeren van een differentiële trypsinebehandeling. Na het toevoegen van trypsine oplossing (stap 6.4.), Controleer de schotel vaak totdat fibroblasten hebben losgekoppeld (meestal 1-2 min), alleen veelhoekige epitheliale cellen verlaten aangesloten op de schotel. Verzamelen en zet opzij dit supernatant, die vooruit kan worden gepasseerd voor uitbreiding. Herhaal stap 6.4-6.6 met behulp van dezelfde trypsine oplossing, en verzamelen van alleen de resterende epitheliale cellen voor sferoïde cultuur.
- Als cellen blijven aanhangend aan de cultuur-schotel na drie rondes van trypsine oplossing blootstelling, gebruik een steriele cel schraper zachtjes de rest verwijderen. Na het slijmen de schotel, de schraper en schotel met 5 mL uitbreiding Media wassen en verzamelen in de dezelfde gelabelde conische buis.
- Centrifugeer conische bij 360 x g gedurende 5 min en 4 ° C. Media van conische gecombineerd.
- Resuspendeer cel pellet in 1 mL uitbreiding Media en het aantal cellen met behulp van een hemacytometer.
- Zodra gekwantificeerd, cellen kunnen worden ingedeeld, indien nodig en gepasseerd doorsturen naar een nieuwe cultuur schotel (met inbegrip van de voorbereiding van de fibroblast co cultuur, stap 3, en plating cellen voor uitbreiding, stappen 5,9-5.12) of gekweekt als spheroïden (stap 7).
Opmerking: Als passaging op een nieuwe cultuur dish voor uitbreiding, een seeding dichtheid van 0,5-1 × 106 cellen in een schotel P100 wordt aanbevolen.
7. zaaien cellen voor HNE sferoïde culturen
Opmerking: Uitvoeren van alle procedures in deze stap, dan centrifugeren, in een schone bioveiligheid kabinet.
- Ontdooi de kelder membraan matrix op ijs per fabrikant instructies (100 µL per sferoïde goed).
Opmerking: Overwegen steriele 500 µL aliquots van de kelder membraan matrix op ontvangst; Dit bedrag zal het zaad van een enkele plaat 4-well. - Scheiden van een passend aantal differentieel trypsinized, gepasseerd cellen (uit stap 6.9) voor een eindconcentratie van 500.000 cellen per mL van de matrix. Voor een 4-well plaat, 200.000 cellen worden gebruikt. Verzamelen in een 1,5 mL-buis.
- Centrifugeer cel en media mengsel bij 360 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Volledig, maar zorgvuldig gecombineerd en negeren van media met behulp van een precisiepipet van 1 mL, verzorgen niet te storen van de cel-pellet.
- Voeg met behulp van een 1 mL pipet tip 100 µL per gepland goed van de matrix van de kelder membraan aan de 1,5 mL-buis met de cellen. Houd de buis op ijs.
- Pipetteer omhoog en omlaag om zorgvuldig en grondig resuspendeer de cellen in de kelder membraan-matrix. Snel om te voorkomen dat de stolling van de matrix. Vermijd volledig leegmaken van het uiteinde van de pipet te zorgen luchtbellen worden niet ingevoerd in de matrix/cel-mix.
-
Zaad 100 µL matrix aliquots in ieder putje van een 4-well IVF cultuur plaat.
- Uit de distale 3-4 mm van een tip van 200 µL Pipetteer met behulp van een schone paar van schaar, trim.
- Gebruik de bijgesneden tip, zorgvuldig Pipetteer 100 µL van het mengsel van cel/matrix in het midden van elk putje. Pipetteer langzaam, met het doel van het maken van een enkele matrix "drop" in het midden van elk putje. De daling van de sferische moet blijven, en de zijkanten van de put niet moet aanraken. Wanneer het bewegen van de plaat, doen zo zorgvuldig wordt vermeden verstoren deze dalingen.
- Incubeer de kelder membraan matrix druppels bij 37 ° C en 5% CO2 voor 30 min, tot solid.
- Zorgvuldig Pipetteer 500 µL van differentiatie Media in elk putje, verzorgen niet te storen van de daling van de matrix. Ervoor zorgen dat de media enkel dekking de matrix drop en meer toe te voegen indien nodig.
8. onderscheiden en oudere HNE spheroïden
- Gebruik een 1 mL pipet tip, zachtjes gecombineerd alle media uit put; Vermijd aspirating van de matrix, die spheroïden in dat gedeelte van de matrix, vernietigen zal hoewel elke spheroïden achtergelaten levensvatbaar kunnen blijven.
- Met behulp van een vers 1 mL pipet tip, voeg voorzichtig 500 µL van differentiatie media naar de waterput rond de matrix. Raak de matrix met de pipet en dat niet wordt verstoord de daling van de matrix.
- Spheroïden terug naar de incubator bij 37 oC en 5% CO2 voor aanhoudende groei. Herhaal stap 8.1 via 8.3 drie keer per week.
- Evalueren sferoïde morfologie dagelijks onder een omgekeerde Microscoop 20 X. Spheroïden moeten vormen binnen 3-5 dagen van plating en geslachtsrijp binnen ongeveer 10 dagen.
9. voorbehandeling, stimuleren en Image HNE spheroïden voor analyse
- Voorbehandeling spheroïden desgewenst voorafgaand aan beeldvorming zoals eerder beschreven30.
Opmerking: Voor VX809 de voorbehandeling, toevoegen 3 µM van VX809 tot de media gedurende 48-72 uur voorafgaand aan de beeldvorming. Meng 1 µL van 10 mM VX809 voorraad (Zie Materialen tabel) in 3.3 mL van media voor deze concentratie. - Wijzigen van elk goed voor spheroïden aan 1 mL verse differentiatie Media, met inbegrip van voorbehandeling (stappen 8.1-8.3) voor imaging spheroïden.
- Het bereiden van vers stimulatie drugs oplossingen (Forskolin, 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], VX770, en CFTR-remmer 172 [Inh172]) van voorraden (Zie Materialen tabel). Toevoegen 1 µL van elk aandeel aan 98 µL van steriel water in één label 1,5 mL tube voor forskolin/IBMX. Voor VX770 en Inh172, voeg toe 1 µL van elk aandeel aan 99 µL van steriel water in aparte gelabelde 1,5 mL tubes. Het maken van een totaal volume waardoor 50 µL van oplossing voor elk goed getest. Bereid oplossingen onder steriele omstandigheden in het biosafety kabinet.
- Sferoïde plaat overbrengen in een bebroede kamer ingesteld op 37 ° C en 5% CO2, gemonteerd op een omgekeerde Microscoop uitgerust met elektronische beeld vangt software en een mechanische podium voor XY aanpassing. Inschakelen van de Microscoop en een camera, evenals de imaging computer.
-
Basislijn foto's vastleggen van spheroïden in een put.
- Open de afbeelding capture software (Slidebook 5.5 voor hieronder richtingen). Eenmaal geïnitialiseerd, kunt u een nieuw bestand openen door te klikken op "Bestand" en vervolgens "Nieuwe". Dienovereenkomstig het bestand een naam en klik op "Opslaan".
- Zorgvuldig en verwijder het deksel van de plaat cultuur en één matrix druppel centreren over het doel.
- Vanaf de bovenkant van de daling van de matrix, verplaatsen in een raster te vinden van spheroïden op 20 x vergroting met de Microscoop oculair. Focus op en neer om het vangen van de sfeer op het breedste gedeelte. Aantekeningen van de locatie van elke sferoïde op een kaart van de daling van de matrix opnieuw identificeren na imaging.
- In de software, klikt u op 'Fotolader'. Voor blootstelling, selecteert u 'Handmatig' en voert 50 ms. zorgen andere instellingen geschikt zijn (Bin Factor: 1 x 1, b: 512, H: 512, X en Y-verschuiving: 0). Geef een passende naam voor elke afbeelding in het vak "Naam" (bijvoorbeeld sferoïde 1 basislijn). Klik op "Start" om te bekijken een live beeld en "Opslaan" om de opname van een basislijn.
- Herhaal de stappen 9.5.1-9.5.4 doel nummer is bereikt, of hele matrix drop image is gemaakt.
Opmerking: Groep verschillen kunnen worden opgespoord met zo weinig als 3-5 spheroïden per voorwaarde, echter het is geworden van onze praktijk om het imago van 10 of meer spheroïden per voorwaarde om macht te vergroten. Variabiliteit van de bepaling wordt geïllustreerd in Figuur 2 van de sectie "Vertegenwoordiger resultaten" met monsters van 8-10 spheroïden per onderwerp als voorbeeld.
-
Spheroïden stimuleren.
- Met behulp van een pipet 200 µL, voeg 50 µL van de drug van de juiste stimulatie in de media binnen het goed, niet te verstoren de matrix verzorgen.
Opmerking: Na deze 10-fold verdunning (50 µL in 500 µL van media), de laatste drug concentratie worden: forskolin 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM. - Toevoegen voor kamp alleen, enige forskolin/IBMX.
- Voeg voor kamp + VX770, forskolin/IBMX eerst, dan VX770 na 2 min.
- Bij de geremde voorwaarden toevoegen Inh172 eerste, dan forskolin/IBMX na 2 min.
- Met behulp van een pipet 200 µL, voeg 50 µL van de drug van de juiste stimulatie in de media binnen het goed, niet te verstoren de matrix verzorgen.
- Onmiddellijk na stimulatie, controleren sferoïde zwelling door timelapse imaging gedurende 1 uur. In de software, klikt u op 'Fotolader'. Klik op "Timelapse" en het interval instelt op 30 s, met een duur van 60 min. Enter een geschikte naam en klik op "Opslaan" om te beginnen met timelapse.
Opmerking: Standaard timelapse is het vastleggen van beelden van een enkele sferoïde elke 30 s om een video van hoge kwaliteit. U kunt ook lager-vergroting verovering van de hele put (bijvoorbeeld 4 X), en minder beelden desgewenst uitvoeren Als een geautomatiseerde stadium wordt gebruikt, voert u timelapse van alle spheroïden met behulp van vooraf gedefinieerde coördinaten; Gebruik anders timelapse van een subset van spheroïden om een kwalitatieve beoordeling van zwelling en om ervoor te zorgen dat geen systematische problemen ontstaan tijdens het imaging (bijvoorbeeld matrix detachement uit de put). -
Onmiddellijk na voltooiing van het beeld van de timelapse 1 h, na stimulatie foto's vastleggen van alle spheroïden (per stap 9.5) met behulp van de kaart gemaakt in stap 9.5.3.
- Verwijzen naar pre stimulatie beelden om ervoor te zorgen dat de hetzelfde vlak van de focus wordt gebruikt voor follow-up beelden (de focal kwaliteit van de omringende cellen, spheroïden of puin sterk vergemakkelijken dit proces).
- Bestanden opslaan met een gepaarde aantekening uit stap 9.5.4 (bijvoorbeeld sferoïde 1 na stimulatie).
Opmerking: deze stap te voltooien onmiddellijk na de timelapse, als spheroïden blijven kunnen te zwellen.
- Vervangen door media in de verbeelde goed vers differentiatie Media.
- Herhaal stap 9.5 via 9,9 voor elke goed/voorwaarde, stimulatie drugs aan te passen, zoals aangegeven voor experimentele omstandigheden.
- Zodra alle beeldvorming is voltooid, ga terug spheroïden naar de incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Afhankelijk van de steriliteit van de bebroede Microscoop kamer, na stimulatie besmetting van spheroïden kan worden vrij gemeenschappelijk. Ofwel verbeelde spheroïden in een aparte incubator, om risico op kruisbesmetting, houden of wegdoen spheroïden onmiddellijk na de beeldvorming.
10. het analyseren van HNE sferoïde beelden
- Alle opgenomen afbeeldingen exporteren naar een indeling die compatibel is met de software van de analyse van de afbeelding. In de software, klik op "Weergave", hover over 'Export', en selecteer "Standaard Views of alle afbeeldingen als TIFF...". Opslaan op de vaste schijf of een flash drive voor analyse.
Nota: A commerciële analysesoftware (Tabel van materialen) en .tiff bestanden goed presteren en worden hier beschreven, hoewel analyse kan ook worden uitgevoerd met behulp van andere platformen. Bij het benoemen van bestanden, moet personeel analyseren van beelden geblindeerde aan de experimentele omstandigheden, maar bewust van welke beelden zijn gekoppeld (pre- en post stimulatie) om ervoor te zorgen gelijkwaardig analyse. -
Met behulp van analysesoftware, het luminal gebied van elke afbeelding sferoïde af te bakenen en exporteren naar een data-analysesoftware.
- Open analysesoftware. Klik op "Bestand", dan "Open" en navigeer naar de map van de file met sferoïde images. Selecteer alle afbeeldingen voor analyse en klik op "Open".
- Klik op "Maatregel" en selecteer "Regio metingen". Binnen de regio metingen van het dialoogvenster Selecteer het "Configuration" van droptab en zorgen "Image Name" en "Ruimte" selectievakjes zijn ingeschakeld.
- Klik op "Aanmelden" en selecteer "Open Data Log". Klik op "OK" op de Data Log dialoog doos en naam bestand dienovereenkomstig (b.v., voorwaarde X, datum). Dit zal alle metingen overbrengen naar een werkblad.
- Selecteer "Trace regio" knop en het lumen van de sferoïde in de eerste afbeelding p.a. zorgvuldig te traceren. Klik in het dialoogvenster regio-meting op "Logboekgegevens" om in te loggen van de meting in Excel.
- Herhaal de stappen 10.2.2-10.2.4 om alle spheroïden worden geanalyseerd.
- Bereken het percentage wijzigen (100 * [Post-stim - basislijn] ÷ basislijn) in het luminal gebied van basislijn voor elke individuele sferoïde beeld paar verzamelen en bewaren van gegevens voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNEs moet hechten aan de cultuur-schotel en vormen eilandjes van cellen binnen 72 uur van zaaien; voorbeelden van goede en slechte eiland vorming op één week worden weergegeven in figuur 1A en 1B, respectievelijk. Deze eilanden moeten uitbreiden ter dekking van de schotel in de loop van 15-30 dagen. Kleine of suboptimaal monsters kunnen langer duren, en vaak levert niet veel nuttige spheroïden. Besmetting met infectieuze agentia wordt bewezen door diep geel/bewolkt media, falen van de cellen te hechten aan de cultuur-schotel en/of directe visualisatie van schimmels/bacteriën. Elke besmette culturen moeten onmiddellijk worden weggegooid Voorkom kruisbesmetting.
Binnen de eerste 3-4 dagen van cultuur in de kelder membraan-matrix, moeten kleine cystic structuren beginnen te vormen in de matrix. Dit zal ongeveer 10 dagen vervallen in intact spheroïden aan te tonen een dunne wand en een luminal oppervlak. Als uitplaten aan de beschreven dichtheid, bevat succesvolle culturen 50-100 spheroïden per daling van de matrix. De lumen kunnen relatief duidelijk (Figuur 1 c) of gevuld met cellulaire puin en slijm (Figuur 1 d); de voormalige komt vaker voor bij spheroïden met wild-type CFTR (wtCFTR), en de laatste in CF spheroïden. Maskeren te bakenen het luminal gebied van de spheroïden in Figuur 1 c en 1 D wordt geïllustreerd in figuur 1E en 1F, respectievelijk. Voorbeelden van slecht gevormd/mislukte sferoïde culturen vindt u in figuur 1G en 1 H.
Representatieve functionele gegevens voor wild type en F508del CFTR homozygoot HNE spheroïden wordt weergegeven in figuur 2A en 2B, respectievelijk; deze gegevens zijn vertegenwoordiger van > 10 unieke HNE monsters in wild type en F508del CFTR homozygoot onderwerpen30. Kortom, spheroïden met functionele CFTR zwellen, terwijl die met disfunctionele CFTR deining aanzienlijk minder, of kunnen krimpen. Specifiek, spheroïden van onderwerpen met wtCFTR meer dan een uur moeten zwellen wanneer gestimuleerd, en moet minder zwellen of krimpen als gestimuleerd in het bijzijn van het CFTR-remmer Inh172. Omgekeerd, spheroïden van een homozygoot voor F508del CFTR onderwerp moeten ofwel krimpen of zwellen zeer licht, met verhoogde zwelling (of minder krimpende) wanneer farmacologisch gecorrigeerd met het CFTR-modulatoren, VX809 en VX770. Eerdere analyses van sferoïde betrouwbaarheid zowel binnen als tussen onderwerpen dezelfde genotype tonen functionele scheiding van CFTR genotypen en bescheiden variabiliteit in herhaalde maatregelen30.
| Media Component | Stockoplossing | Bedrag | Opslag |
| Uitbreiding Media | |||
| DMEM / F-12 nutriënten mengsel "Base Media" | Gebruik zoals is | 2 x 500 mL containers | Bewaren bij 4 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Foetale runderserum | Gebruik zoals is | 50 mL | Bewaren bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Cholera-toxine | 10 mg in 1 mL steriel water | 1 ΜL | Voorraad bij-20 ° c tot zes maanden opslaan |
| Epidermale groeifactor | 500 µg in 1 mL steriel water | 20 ΜL | Voorraad bij-20 ° c tot zes maanden opslaan |
| Hydrocortison | 0.4 mg in 400 µL van steriel water | Hele 400 µL aliquot | Verse met iedere batch maken Winkel poeder bij kamertemperatuur tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Adenine | 24 mg in 1 mL steriel water | Hele 1 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Winkel poeder bij kamertemperatuur tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Y-27632 | 3,2 mg in 1 mL steriel water | Hele 1 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Antibiotica Media | |||
| Amfotericine B | Gebruik zoals is | 1.2 mL | Bewaren bij 4 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Ceftazidim | 15 mg in 1 mL steriel water | Hele 1 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Tobramycine | 15 mg in 1 mL steriel water | Hele 1 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Vancomycine | 15 mg in 1 mL steriel water | Hele 1 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
Tabel 1: Componenten van expansie en antibiotica Media.
| Media Component | Stockoplossing | Bedrag | Opslag |
| DMEM / F-12 nutriënten mengsel "Base Media" | Gebruik zoals is | 2 x 500 mL containers | Bewaren bij 4 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Ultroser-G | 20 mL steriel water in een enkele, 20 mL fles gelyofiliseerd Ultroser-G | Hele 20 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij 4 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Foetale kloon II | Gebruik zoals is | 20 mL | Bewaren bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Pen Strep | Gebruik zoals is | 10 mL | Bewaren bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Boviene hersenen Extract | Gebruik zoals is | 2,48 mL | Bewaren bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Transferrine | Gebruik zoals is | 250 ΜL | Bewaren bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Insuline | Gebruik zoals is | 250 ΜL | Bewaren bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Ethanolamine | Gebruik zoals is | 15 ΜL | Bewaren bij kamertemperatuur tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Adrenaline | 2.75 / mg in 1 ml steriel water | Hele 1 mL aliquoot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij 4 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Trijodothyronine | 8.4 mg in 50 µL van DMSO | Hele 50 µL aliquot | Verse met iedere batch maken Opslaan van poeder bij-20 ° c tot de vervaldatum van de fabrikant |
| Hydrocortison | 7.24 mg in 1 mL ethanol | 1 ΜL | Voorraad bij-20 ° c tot zes maanden opslaan |
| Phsophoryletheanolamine | 35.25 mg in 1 mL steriel water | 1 ΜL | Voorraad bij-20 ° c tot zes maanden opslaan |
| Retinoïnezuur | 3 mg in 1 mL van DMSO | 1 ΜL | Voorraad bij-20 ° c tot zes maanden opslaan |
Tabel 2: Onderdelen van differentiatie Medium.
Figuur 1 : HNE expansie en structurele kenmerken van HNE spheroïden. Helderveld beelden van HNE uitbreiding culturen zeven dagen na de beplating genomen tonen succesvolle (witte pijl, deelvenster A) en mislukte (deelvenster B) HNE kolonie vorming op een achtergrond van de fibroblast feeder. Succesvolle wtCFTR en F508del homozygoot spheroïden staan in panelen C en D, respectievelijk. Maskeren te bakenen het luminal gebied van spheroïden van C/D vindt u in panelen E en F, respectievelijk. Mislukte sferoïde culturen worden gekenmerkt door kleine, ongeorganiseerd cellulaire puin (deelvenster G) en/of ongeorganiseerd bosjes van cellen (deelvenster H). Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Functionele eigenschappen van HNE spheroïden. Representatieve functionele reacties van wtCFTR spheroïden van een enkele donor, wanneer gestimuleerd met forskolin/IBMX met/zonder de aanwezigheid van het CFTR-remmer Inh172 worden weergegeven in het deelvenster (A) elk punt het antwoord in een één sferoïde vertegenwoordigt. Representatieve functionele reacties van F508del homozygoot spheroïden van een enkele donor, wanneer gestimuleerd met forskolin/IBMX met/zonder de aanwezigheid van VX809 en VX770 worden weergegeven in het deelvenster (B). Foutbalken = SEM. ** p < 0,01; p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de generatie van patiënt-afgeleide nasale sferoïde celculturen kunnen produceren een geïndividualiseerde, specifieke model van CFTR-functie. Er zijn verscheidene belangrijke stappen in het proces dat moet nauw worden bijgewoond om te voorkomen dat problemen. Ten eerste is de verwerving van een goed voorbeeld uit de neus van de patiënt. Een goed voorbeeld moeten > 50.000 cellen, slijm/puin beperkt en worden klaar voor verwerking binnen 4 uur (hoewel succes ook gemakkelijk haalbaar met overnachting verzending op ijs is). Praktijk het verwerven van de monsters met curettage of borstel door studie personeel is nodig, die wordt vergemakkelijkt door de vroegtijdige verwerving van de steekproef in de handen van één of twee aanbieders te maximaliseren hun comfort gericht. Tweede, goed schoon/steriele techniek in alle stappen van weefselkweek is essentieel. De primaire modus van mislukking, in onze ervaring, voor alle HNE culturen is bacteriële of schimmel verontreiniging, die zowel het primaire monster en andere groeiende culturen in de incubator kan bemoeilijken. Dit risico verhoogt alleen met culturen van patiënten met chronische infectie (zoalsCF), dus succes staat of valt grotendeels met de mogelijkheid om schoon en afzonderlijke culturen te houden. Onze praktijk is een incubator gescheiden houden alleen voor infectie-naar voren gebogen culturen binnen de eerste 5-7 dagen, oudere, succesvolle culturen te beschermen tegen onbedoelde verontreiniging. Ten derde is het belangrijk nauw kijken van cellen tijdens de ontwikkelingsfase en overconfluence voorkomen. Als de cellen worden doorgelaten aan volledige samenvloeiing op de plaat, is er een risico dat de cultuur zal worden verouderend of cellen zullen sterven en loskoppelen. Tot slot, wanneer plating cellen als spheroïden, is het belangrijk de cellen via de matrix grondig te verspreiden en plaat van een gelijkmatig verdeelde steekproef. Ofwel over - of onder - population van de matrix druppels zal leiden tot falen van de cultuur en grote bosjes van cellen zal niet succesvol spheroïden produceren.
Terwijl de uitvoering van dit protocol, kunnen onderzoekers een paar gemeenschappelijke problemen optreden. Besmetting, zoals hierboven vermeld, is het best vermeden door de aanschaf van een goede eerste steekproef zonder slijm en schone cultuur technieken. Als culturen succesvol door middel van uitbreiding zijn, maar geen gedifferentieerde bollen worden gevormd, kunnen diverse problemen hebben voorgedaan. Als de matrix leeg meestal, het is zeer waarschijnlijk dat de cellen werden zaadjes op te laag met een dichtheid; de seeding dichtheid van vervolgpogingen met ongeveer 20% toenemen. Omgekeerd, als de matrix lijkt te zijn "vuile" met overvloedige cel puin, is het waarschijnlijk dat de cellen ook werden zaadjes op high van een dichtheid en vervolgpogingen moet gebruiken een seeding bevolkingsdichtheid met ongeveer 20% verlaagd. Een gemeenschappelijke complicatie van post seeding voeden, en onderhoud is het detachement van de matrix uit het schip van de cultuur. Dit wordt veroorzaakt door de overdreven agressieve media uitwisseling en kan worden vermeden door voorzichtig en handmatig veranderen media met een 1 mL Pipet, geen zuiging van de muur. Aangetroffen, kunnen bollen nog steeds worden gestimuleerd als beeld, hoewel dit moeilijk wellicht als de matrix "zweeft" in de put tijdens imaging, vergend voorzichtig toewijzing van spheroïden binnen de put.
Onderzoekers kunnen verschillende wijzigingen in het protocol, afhankelijk van de behoeften van hun lab aanspannen. Voor de beeldvorming van de hogere resolutie van spheroïden, hebben we de 4-Wells-platen met optisch glas opties, met inbegrip van 35-mm glazen-bodem gerechten of kamer dia's eerder vervangen. Dit zorgt voor hoge resolutie, live beelden van spheroïden, maar doorvoer kan verminderen. Anderzijds om te verhogen doorvoer, kunnen kleinere aliquots van cellen in de matrix worden ontpit in andere vaartuigen (bijvoorbeeld 24-well cultuur platen). In onze ervaring groeien spheroïden best met de matrix in de vorm van een "druppel" in tegenstelling tot de vorming van een blad op de bodem van de put; Zo hebben we de beste succes met druppels van ten minste 25 µL. onderzoekers desgewenst te wijzigen van de dichtheid van de matrix door verder verdunnen met media. Dit vermindert de totale hoeveelheid matrix nodig, verbetering van de kosten van de test. Dit kan ook de samenstelling sferoïde echter wijzigen. In onze eerdere ervaringen gewijzigd concentraties lager van de basement membraan matrix tot sferoïde structuur, met gedeeltelijke of volledige vorming van spheroïden in de morfologie van een "cel-apex-out". Als zodanig, moeten spheroïden gegenereerd door middel van eventuele wijzigingen van het protocol in de concentratie van de matrix worden voorzichtig geëvalueerd voor morfologie voordat de functionele testen wordt geprobeerd. Ten slotte kon verschillende stimulerende of remmende geneesmiddelen of verschillende concentraties van deze drugs, worden ingezet. Forskolin, IBMX en Inh172 werden gekozen voor onze studies bij deze concentraties op basis van eerdere ervaring in ALI culturen31. Gebruik van andere drugs (bijvoorbeeld isoproterenol voor stimulatie, GlyH101 voor remming) kan beter toepassen van een onderzoeker de studie. Ook het dynamisch bereik van de test het gebruiken van verschillende concentraties van forskolin, IBMX of Inh172 kan veranderen, echter hebben wij niet systematisch getest deze opties.
Gezien het aantal bestaande ex vivo patiënt afkomstige CFTR testen, is het beschreven model opmerkelijk om verschillende belangrijke redenen. Ten eerste speelt het in op nasale cellen als een gemakkelijk verkregen bron van respiratoire weefsel. HNE aanbestedingen kan veilig worden uitgevoerd met minimale opleiding in bijna elke omgeving (kliniek, OR, onderzoek bezoek) in alle leeftijdsgroepen25. Dit vereenvoudigt robuuste monster aanbestedingen, en herhalen van bemonstering eventueel als gevolg van de moeilijkheid van de groei of besmetting. In vergelijking met intestinale organoids, HNE spheroïden minder goed worden gekenmerkt en lijken te hebben een kleiner dynamisch bereik in de huidige vorm, echter, gebruik van respiratoire in plaats van GI weefsel kunnen zijn dat een belangrijk voordeel, diverse CF ziekte bestuurders (b.v. mucociliary van mijnen, epitheliale natrium kanaal expressie) zijn niet equivalent in de darm. In tegenstelling tot de vlakke, ALI culturen van HNE cellen, kunnen spheroïden zijn sneller gegroeid en meer vertegenwoordiger van in vivo voorwaarden, meten een fysiologische proces (vloeistof homeostase) die meer relevant dan electrofysiologie alleen32kan zijn. Door verbetering van de tijd van monster inkoop om te testen, wordt potentiële verontreiniging verminderd, daarom verhogen de kans op succes van de cultuur. Tot slot, het 3-dimensionale karakter van het model kan worden vatbaar voor de roman en/of de aanvullende regels van het onderzoek in de luchtweg ontwikkeling of morfologie die niet haalbaar in ALI culturen (b.v., luminal slijm bijhouden, snelle studies van differentiatie, etc.).
Er zijn verschillende belangrijke beperkingen aan HNE spheroïden als een kwantitatieve analyse van CFTR-functie. Ten eerste is deze bepaling blijft relatief laag-doorvoer. Met behulp van de huidige methoden Beeldacquisitie duurt meer dan een uur voor elke voorwaarde voor cultuur en analyse duurt een extra 20-30 min per voorwaarde. Dit wordt verergerd door de mate van overlapping tussen bepaalde voorwaarden (zoals aangetoond in figuur 2A), die vergt een groter aantal metingen (deze overlapping op zich kan een beperking van de gevoeligheid van deze test ook vertegenwoordigen). Als dusdanig, vereist een één experiment met 4-6 voorwaarden bijna twee dagen voor voltooiing. Doorvoer kan worden verbeterd door gebruik te maken van geautomatiseerde Fotolader en analysemethoden; dergelijke aanpassingen zijn momenteel aan de gang. Ten tweede, dit model vereist een grote hoeveelheid matrix, die duur worden kan. Zoals hierboven vermeld, verdunning van de matrix kan helpen bij het overwinnen van deze barrière, maar moet worden gehouden met de nodige voorzichtigheid, aangezien wijzigingen in de groei matrix zal waarschijnlijk resulteren in wijzigingen in sferoïde morfologie. Ten derde, dit model berust op sferoïde metingen in een XY-oppervlakte alleen, en negeert zwelling in het Z-vlak, die vooringenomenheid kan invoeren. Terwijl eerdere analyses van de reproduceerbaarheid geruststellend zijn, kan deze tekortkoming worden overwonnen door gebruik van geautomatiseerde imaging met Z-plane scannen om te berekenen volume30. Tot slot, en dit is het belangrijkst, moet uitgebreide werk te binden sferoïde reacties op de individuele certificaathouder in vivo drug reactie nog worden voltooid. Bij ontbreken van deze correlatie is de voorspellende waarde van de model - terwijl veelbelovende - onduidelijk.
Generatie en analyse van HNE spheroïden mogelijk ex vivo analyse van individuele CFTR-activiteit en modulatie, die uiteindelijk als een pre-klinische model van drug reactie nuttig kan zijn. Bovendien, gezien de uitgebreide variabiliteit CF de ernst van de ziekte, die een geïndividualiseerde model kunt inzicht verwerven in een betreft's unieke airway communicatie. Op deze manier kan een dergelijk model nuttig zijn voor studies van de bredere CFTR biologie en hulp bij het begrijpen van de heterogeniteit van de ziekte. Toekomstig gebruik van dit model, alsmede andere soortgelijke modellen van geïndividualiseerde CFTR-functie, houdt belofte CFTR biologie in het lab, en naar station gepersonaliseerde beter te begrijpen en precisie geneeskunde in de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Cystic Fibrosis Stichting Therapeutics, nummer CLANCY14XX0 te verlenen en door middel van Cystic Fibrosis Stichting, verlenen nummer CLANCY15R0. De auteurs bedank Kristina Ray voor haar hulp bij de patiënt werving en regelgevend toezicht. De auteurs ook bedank de werkgroep HNE, ondersteund door de Cystic Fibrosis Stichting, die bijgestaan in de generatie van HNE cultuur mogelijkheden: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon en Katherine Tuggle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
References
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
- Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
- CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
- Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
- Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
- Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
- van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
- Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
- Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
- Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
- Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
- Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
- Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).
