Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generation av mänsklig Nasal epitelial Cell Spheroids för individualiserad cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator studie

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Här beskriver vi en metod för att skapa tredimensionella sfäroid kulturer av mänskliga näsans epitelceller. Spheroids stimuleras då att köra cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-beroende ion och vätska sekretion, kvantifiera förändringen i sfäroid luminala storleken som en proxy för CFTR funktion.

Abstract

Medan införandet av cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) modulator läkemedel har revolutionerat vården i cystisk fibros (CF), har genotyp-riktad terapi modellen används för tillfället flera begränsningar. Första, sällsynta eller understudied mutation grupper utesluts från definitiva kliniska prövningar. Dessutom som ytterligare modulator läkemedel in på marknaden, kommer det bli svårt att optimera de modulator val för en individ betvingar. Båda dessa frågor behandlas med användning av patientderiverade, individualiserad prekliniska modellsystem av CFTR funktion och modulering. Mänskliga näsans epitelceller (HNEs) är en lättillgänglig källa av respiratoriska vävnad för en sådan modell. Häri, beskriver vi generationen av en tredimensionell sfäroid modell av CFTR funktion och modulering med primära HNEs. HNEs är isolerade från patienter i en minimalinvasiv mode, expanderat i villkorlig omplanering villkor, och seedade in i sfäroid kulturen. Inom 2 veckor efter sådd, generera sfäroid kulturer HNE spheroids som kan stimuleras med 3', 5'-cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP)-generera agonister till aktivera CFTR-funktionen. Sfäroid svullnad då kvantifieras som en proxy av CFTR aktivitet. HNE spheroids kapitalisera på minimalt invasiva, men respiratoriska beskärningen av näsans celler för att skapa en tillgänglig, personlig modell som är relevanta för epitel återspeglar sjukdom sjuklighet och dödlighet. Jämfört med luft-vätska gränssnitt HNE kulturerna, är spheroids relativt snabba att mogna, vilket minskar den totala förorening frekvensen. I sin nuvarande form begränsas modellen av låg genomströmning, men detta uppvägs av den relativa lätthet av vävnad förvärv. HNE spheroids kan användas för att tillförlitligt mäta och karaktärisera CFTR aktivitet på individnivå. En pågående studie att knyta denna kvantifiering i vivo drug svar avgör om HNE spheroids är en sann prekliniska prediktor av patientens reaktion på CFTR modulering.

Introduction

Cystisk fibros (CF) är en dödlig, autosomalt recessiv sjukdom som drabbar över 70.000 människor världen över1. Detta liv-förkortare genetisk sjukdom orsakas av mutationer i cystisk fibros Transmembrane conductance Regulator (CFTR) protein2. CFTR är medlem av adenosintrifosfat-bindande kassett familj och funktioner som en jonkanal som tillåter rörelse av klorid och bikarbonat över de apikala membran av flera polariserade epitel inklusive mag-tarmkanalen, svett körtel, och respiratoriska träd, bland annat3,4. Som sådan, leder dysfunktionella CFTR till multisystem epitelial dysfunktion, med de flesta dödlighet som härrör från respiratorisk sjukdom1. I CF lungan, CFTR-driven airway surface flytande (ASL) förordning och slem release leder till förtjockade slem, luftvägsobstruktion, kronisk infektion, och progressiva luftvägarna remodeling och förlust av lung funktion1,5.

Trots identifiering av CFTR dysfunktion som orsak till sjukdom, behandlingar i CF traditionellt fokuserat på lindring av symtom (t.ex., pankreas enzymersättningsbehandling, luftvägarna clearance terapier)1. Detta tillvägagångssätt var nyligen revolutionerat genom tillkomsten av nya behandlingar, kallas ”CFTR modulatorer”, som är direkt riktade till dysfunktionella CFTR. Detta tillvägagångssätt har skiftat kliniska landskapet från symptom management till sjukdomsmodifierande hand men bär flera begränsningar6,7,8,9,10. Modulator aktivitet är specifika för protein defekten medföljer varje mutation i CFTR och begränsad till Välj genetiska populationer11. Denna begränsning är driven av den heterogena karaktären av protein defekter, men också av ogenomförlig prövningar i sällsynta mutationen grupper. Bland patienter med väl studerat genotyper (t.ex., F508del/F508del CFTR, den vanligaste mutationen i CFTR), är det dessutom brett variabilitet i sjukdom börda och modulator svar6,7,8 ,9,11.

För att lösa båda dessa problem, har utredare föreslagit användning av anpassade modeller för prekliniska test12. Detta koncept använder tredjeparts patientspecifika vävnad för att generera en individualiserad ex vivo modellsystem för sammansatta testning, förutsäga i vivo ämne svar till behandlingar på ett personligt sätt. När validerat, skulle en sådan modell kunna användas av vårdpersonal att driva precision behandling oavsett patientens underliggande CFTR genotyp.

Humana bronkial (HBE) epitelceller erhållits från explant vävnad vid tidpunkten för lungtransplantation etablerade möjligheten av en sådan modell för CF13,14. HBEs odlas på ett luft-vätska gränssnitt (ALI) möjliggör funktionella CFTR kvantifiering direkt genom Elektrofysiologisk testning eller indirekt genom åtgärder av ASL homeostas13,15. Denna modell har varit kritiska till att förstå CFTR biologi och var en viktig drivkraft i utvecklingen av CFTR modulatorer16. HBE modeller är tyvärr inte hållbart som en personlig modell på grund av förvärvet (lungtransplantation eller bronkial borstning) invasiva karaktär och avsaknaden av prover för dem med sällsynta mutationer eller mild sjukdom. Omvänt, Tarmvävnaden, erhållits från rektal eller duodenal biopsi exemplar, kan användas för intestinal strömmätning (ICM) eller en svullnad-baserade organoid analysen för att studera individualiserad CFTR funktion17,18, 19. Organoid analyser, i synnerhet, är mycket känsliga modeller av CFTR aktivitet20,21,22. Båda modellerna är begränsade av vävnad källan (Tarmvävnaden, medan de flesta sjukdom patologi är luftvägarna) och semi invasiva metoden för förvärvet. Alternativt, flera utredare har studerat människors nasal (HNE) epitelceller till modell CFTR restaurering23,24,25. HNEs säkert kan skördas med pensel eller skrapning hos patienter i alla åldrar, och när odlade i ALI, sammanfatta många kännetecken av HBEs25,26,27,28. HNE enskiktslager kulturer har traditionellt varit begränsad av skivepitelcancer transformation och en lång tid till förfall29. Dessutom rapporterade kortslutning aktuella mätningar i HNEs är mindre än de i HBEs, vilket tyder på ett mindre fönster för att upptäcka terapeutisk effekt25.

Med tanke på behovet av en personlig, icke-invasiv, respiratoriska vävnadsodling modell av CFTR funktion, försökt vi sammanfoga en svullnad-baserade, organoid analysens känslighet med icke-invasiv och respiratoriska beskaffenhet HNEs. Här beskriver vi vår metod för att generera 3-dimensionell ”sfäroid” kulturer av HNEs för individualiserad CFTR studie i en svullnad-baserad analys30. HNE spheroids polarisera tillförlitligt med epitelial spetsen mot sfär center, eller lumen. Denna modell recapitulates talrika kännetecken av en lägre respiratoriska epitel och mognar snabbare än ALI kulturer. Som en funktionell analys kvantifiera HNE spheroids tillförlitligt ett utbud av CFTR funktion, liksom modulering i väl studerat mutation grupper (t.ex., F508del CFTR). Denna svullnad-baserad analys kapitaliserar på egenskaperna ion/salt transport av CFTR, indirekt mäta vätska tillströmningen till sfäroid som vattnet följer apikala salt efflux. På detta sätt svälla stimuleras spheroids med fullt fungerande CFTR kraftfullt, medan de med dysfunktionella CFTR mindre svälla eller krympa. Detta kvantifieras genom bildanalys av före och 1 h efter stimulering spheroids, mäta luminala område och fastställa procent ändra. Denna åtgärd kan sedan jämföras över experimentella grupper till skärmen för drogen bioaktivitet i en patient-specifika mode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HNE prover uppbringades från försökspersonerna rekryteras genom Cincinnati Children's Hospital Medical Center CF Research Center. Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella granskning Board (IRB) av Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Skriftligt godkännande erhölls från alla ämnen före provning.

1. Förbered Expansion Media och antibiotika Media

  1. Samla media komponenterna som listas i tabell 1. Tina fryst material vid rumstemperatur och göra nödvändiga lager lösningar som anges i tabell 1 under ”Expansion Media”.
    Obs: Var försiktig vid hantering av kolera toxin, som är giftigt vid förtäring, och är en hud, ögon och respiratoriska irriterande. Göra och kombinera alla lösningar och media under rena förhållanden i biosäkerhet skåp.
  2. Med 50 mL serologic pipett, avlägsna och kassera 50 mL bas medium (Dulbecco modifierade Eagle Medium/F12) från en behållare till kompensera för tillägg av andra material. Häll alla base media för hand i en Ånghärdad 1 L glasflaska.
  3. Med en 50 mL serologic pipett eller 1 mL pipett som lämpliga, överföra alla återstående komponenter från avsnittet ”Expansion Media” i tabell 1 i Ånghärdad glasflaska innehållande media. Snurra försiktigt flaskan för hand för att blanda.
  4. Filtermedia i en fräsch, sterila 1 L, 0,22 µm polyetersulfon (PES) filtrera flask med tillverkarens anvisningar och kommentera med ”Expansion Media” och datum.
  5. Förbered antibiotika. Göra nödvändiga antibiotika stamlösningar som anges i tabell 1 under ”antibiotika Media”.
    1. Med pipett 50 mL serologiska överföra 150 mL Expansion Media till en färsk 250 mL Ånghärdad glasflaska.
    2. Med 1 mL pipett, lägga till alla komponenter från avsnittet ”antibiotika Media” i tabell 1 i Ånghärdad glasflaska innehållande media. Snurra för hand för att blanda tills media är enhetlig i utseende.
    3. Filtrera media till en fräsch, sterila 250 mL, 0,22 µm PES filtrerkolven med tillverkarens anvisningar och kommentera med ”antibiotika Media” och datum.
  6. Lagra media vid 4 ° C i upp till en månad, kasta om molnigt, vilket tyder på föroreningar.

2. Förbered differentiering Media

  1. Samla media komponenterna som listas i tabell 2. Tina fryst material vid rumstemperatur och göra nödvändiga lager lösningar som anges i tabell 2.
    Obs: Var försiktig vid hantering av retinoinsyra, som är en reproduktiv toxin, kan vara giftiga vid förtäring, och orsakar hudirritation. Göra, alikvotens och kombinera alla lösningar och media under rena förhållanden i biosäkerhet skåp.
  2. Avlägsna och kassera 52 mL av bas medium från en behållare till kompensera för tillägg av andra material. Häll alla base media i en Ånghärdad 1 L glasflaska.
  3. Med en 25 mL serologiska pipett eller 1 mL pipett som lämpliga, överföra alla återstående komponenter från tabell 2 till Ånghärdad glasflaska innehållande media och snurra försiktigt för hand att blanda.
  4. Filtermedia i en fräsch, sterila 1 L, 0,22 µm polyetersulfon (PES) filtrera flask med tillverkarens anvisningar och kommentera med ”differentiering Media” och datum.
  5. Lagra media vid 4 ° C i upp till en månad, kasta om molnigt, vilket tyder på föroreningar.

3. coat kultur rätter och tallrik Feeder fibroblaster

Obs: Utföra alla steg under rena förhållanden i biosäkerhet skåp.

  1. Blanda 0,5 mL av kollagen materiel och 37,5 mL sterilt vatten i en 50 mL konisk tub.
  2. Pipettera 4-5 mL kollagen lösning i varje ren P100 kultur maträtt, se till att hela ytan är täckt.
  3. Täck med lock och inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
  4. I biosäkerhet skåp, ta bort alla maträtt lock. Snurra lösning för att täcka skålen, sedan aspirera.
  5. Sterilisera av exponering för ultraviolett (UV) ljus för 1 h. plats lock tillbaka på rätterna, stack och täck rätter med aluminiumfolie.
  6. Store belagda rätter vid 4 ° C för 3-6 månader, åter sterilisering i UV-ljus 15-30 min innan cell kultur använder.
  7. 24 h innan att erhålla ett HNE prov, sterilisera en pre belagda maträtt och etikett som mus embryonala Fibroblast (MEF) och datum.
  8. Lägg till Expansion Media för att täcka plattan (ca 5 mL) med serologisk pipett.
  9. Tina en injektionsflaska med 2 x 106 bestrålade MEFs i 37 ° C vattenbad. Så snart MEFs är tinade, lägga hälften av flaskan (ca 106 celler) i skålen med 1 mL pipett, virvlande för hand för att skingra.
  10. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 övernattning i förberedelse för HNE kultur.
    Obs: Om nödvändigt steg 3,7-3.10 kan vara utfört så sent som 60 min före plätering celler, men natten är perfekt.

4. Skaffa och bearbeta HNE prov

  1. Säkerställa IRB-godkända samtycke/samtycke erhålls för alla ämnen.
  2. Har patienten blåser näsan för att rensa löst slem.
  3. Visualisera inferior Concha använder en rhinoscope. Se till att inga lesioner eller polyper är närvarande som kan utgöra hinder för provtagning.
  4. Samla in nasal celler från den första näsborren genom skrapning eller borstning.
    1. Skrapning: Böj kyrett på dess mittpunkt till skapa en liten, ~ 135° vinkel med spetsen från kyrett koppen. Infoga kyrett i näsborren och avancera kyrett koppen under sämre Concha. Försiktigt tryck kyrett koppen mot sämre Concha och skrapa den Concha genom att dra kyrett framåt, upprepande 3 - 4 gånger totalt.
    2. Borste: Passera cytologi borsta under sämre Concha, sedan rotera och flytta borsten och-ut något 4 - 5 gånger, utan spännande näsborren.
  5. Plats kyrett/borste i en 15 mL koniska fylld med antibiotika Media. Upprepa steg 4,3-4,4 för den andra näsborren, placera kyrett/borsten i samma koniska rör.
  6. Store konisk på is tills redo för bearbetning. Säkerställa att behandlingen sker inom 4 h av provtagning men kan uppstå så sent som 24 h efter förvärvet om det behövs.

5. behandla och expandera HNE celler i rätter

Obs: Utföra alla steg under rena förhållanden i biosäkerhet skåp.

  1. Använda en 1 mL pipett och media från provet koniska, tvätta alla celler bort av skrapningarna/cytologi borstar i samma koniska röret. När ren, kassera skrapningarna / borstar.
  2. Centrifugera konisk på 360 x g- och 4 ° C i 5 min.
  3. Aspirera supernatanten, noga med att inte störa cellpelleten.
  4. Återsuspendering cellpelleten i 3 mL cell avlossning lösning, pipettering med en 1 mL-tips för att homogenisera blandningen.
  5. Centrifugera konisk på 360 x g- och 4 ° C i 5 min.
  6. Upprepa steg 5,3-5,5 en gång.
  7. Aspirera återstående supernatanten, noga med att inte störa cellpelleten.
  8. Resuspendera pelleten i 1 mL av antibiotika Media och räkna celler med en hemocytometer.
  9. Med 1 mL pipett platta celler droppvis på bestruket, fibroblast-seedade skålen bereddes i steg 3.10. Lägga till antibiotika Media för att helt täcka skålen och skingra cellerna över ytan. Etikett maträtt med innehåll och datum och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
  10. Efter 48 h, se till att cellerna som är kopplade till kultur skålen. Aspirera media och ersätta med tillräckligt frisk antibiotika Media att täcka plattan.
  11. Ändra media 3 x per vecka, aspirera gamla medier med dammsugaren och Pasteur-pipett, och ersätta med tillräckligt frisk media att täcka plattan. Efter 5 dagar på antibiotika Media, ändra media till Expansion Media, fortsätter att ersätta tre gånger i veckan.
    Obs: Förorening risken är hög i den första veckan av kultur. Hålla färska prover i en separat inkubator att minimera risken för korskontaminering.
  12. Kontrollera celltillväxten flera gånger i veckan. När celler är ungefär 70-80% konfluenta, vidare till passagen celler.

6. passage HNE celler

  1. Bered 0,1% Trypsin i etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA).
    Obs: Försiktig hantering trypsin, som är en huden, andningsorganen, och ögat irriterande.
    1. Väg 15 mg av trypsin från svin bukspottkörteln i ett koniskt rör.
    2. Väg 56 mg EDTA i ett separat koniska rör.
    3. I biosäkerhet skåpet, överför trypsin och EDTA till en Ånghärdad 250 mL glasflaska. Använd en liten alikvot av steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) för att skölja de trypsin/EDTA-rören för att säkerställa fullständig överföring.
    4. Lägg till steril fosfatbuffrad Koksaltlösning för att få den totala lösningen till 150 mL. Stäng locket ordentligt.
    5. Inkubera trypsin lösning i 37 ° C vattenbad tills helt upplöst. Kontrollera varje 15 min och ta bort omgående en gång upplöst.
      Obs: Lämna inte okontrollerat för längre perioder (t.ex. över natten), eftersom trypsin i lösning kommer att denaturera om uppvärmd för länge.
    6. Rengör flaskan med 2-3 sprayer av 70% etanol och återgå till biosäkerhet skåp.
    7. Filtrera 0,1% Trypsin-EDTA-lösning till en fräsch, sterila 250 mL, 0,22 µm PES filtrerkolven med tillverkarens anvisningar och kommentera med innehåll och datum.
    8. Lagra trypsin-EDTA lösning vid 4 ° C i upp till en månad, kasta om grumlig.
  2. Placera differentiering Media, 0,1% Trypsin-EDTA-lösning och steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i rumstemperatur över 30 min. Rengör med 70% etanol och överför till en ren biosäkerhet skåp.
  3. I biosäkerhet skåp, använda en vakuum linje och Pasteur-pipett att aspirera och kasta media från vävnadsodling maträtt. Tvätta skålen genom att lägga till, virvlande och aspirera 5 mL PBS med ren serologiska pipett.
  4. Med serologiska pipett 5 mL, tillsätt 5 mL 0,1% Trypsin-EDTA-lösning i vävnadsodling skålen och återgå till inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2 för 5 min.
  5. Visualisera cellerna på ett inverterat Mikroskop på 4-10 X. Kontrollera att cellerna lossnar från skålen, blir runda och flyta. Knacka försiktigt på sidan av kultur skålen rubba celler eller åter Inkubera i en ytterligare 5 min tills de flesta celler är fristående.
    Obs: Ta försiktighet att snabbt ta bort celler en gång lossnat från kultur skålen; långvarig exponering för 0,1% Trypsin-EDTA kommer försämra cellviabilitet.
  6. Med serologisk pipett 10 mL, tillsätt 5 mL av Expansion Media till skålen och samla alla flytande innehållet (10 mL totalt) i en konisk märkt, sterila 50 mL-tub.
  7. Om celler förbli vidhäftat till kultur skålen, upprepa steg 6,4 genom 6,6 till två gånger, samla innehållet i samma koniska rör.
    1. Om celler förbli vidhäftat till kultur skålen efter tre rundor av Trypsin lösning exponering, använda en steril cell skrapa försiktigt bort resten. Efter skrapningen skålen, tvätta skrapan och skålen med 5 mL Expansion Media och samla i samma märkt koniska rör.
      Obs: Om passaging till spheroids, ändra den här proceduren om du vill utföra en differentierad trypsinization. Efter tillägger trypsin lösning (steg 6,4.), kontrollera skålen ofta tills fibroblaster har lossnat (vanligtvis 1-2 min), lämnar bara polygona epitelceller kopplad till skålen. Samla och upphäva detta supernatanten, som kan vara passaged framåt för expansion. Upprepa steg 6.4-6.6 använder samma trypsin lösning, och samla endast de återstående epitelcellerna för sfäroid kultur.
  8. Centrifugera koniska vid 360 x g i 5 min och 4 ° C. Aspirera media från koniska.
  9. Återsuspendera cellpelleten i 1 mL av Expansion Media och räkna celler som använder en hemacytometer.
  10. När kvantifierade, celler kan delas om det behövs och anpassade framåt mot en ny kultur maträtt (inklusive förberedelse av fibroblast samtidig kultur, steg 3, och plätering celler för expansion, steg 5,9-5.12) eller odlade som spheroids (steg 7).
    Obs: Om passaging till en ny kultur maträtt för expansion, en sådd täthet av 0.5-1 × 106 celler i en P100 maträtt rekommenderas.

7. seedning celler för HNE sfäroid kulturer

Obs: Utför alla procedurer i det här steget än centrifugering, i en ren biosäkerhet skåp.

  1. Tina i basalmembranet matrisen på is per tillverkarens instruktioner (100 µL per sfäroid väl).
    Överväg att göra sterila 500 µL portioner av basalmembranet matrisen på mottagandet. Detta belopp kommer seeda en enda 4-väl plåt.
  2. Separat ett lämpligt antal differentially trypsinized, anpassade celler (från steg 6,9) till en slutkoncentration på 500 000 celler per mL av matrisen. För en 4-väl plåt, Använd 200.000 celler. Samla i en 1,5 mL tub.
  3. Centrifugera cell och media blandning vid 360 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Helt, men noggrant aspirera och kasta media med 1 mL pipett, noga med att inte störa cellpelleten.
  4. Använda en 1 mL pipettspetsen, tillsätt 100 µL per planeras väl av matrisen basalmembranet till 1,5 mL röret som innehåller celler. Håll röret på is.
  5. Pipettera upp och ner till noggrant och grundligt Omsuspendera cellerna i matrisen basalmembranet. Agera snabbt för att undvika solidifiering av matrisen. Undvik helt tömma pipettspetsen att säkerställa luftbubblor inte införs i matriscellen/mixen.
  6. Utsäde 100 µL matrix alikvoter i varje brunn 4-väl IVF kultur platta.
    1. Med ett rent par sax, klipp av den distala 3-4 mm av en 200 µL pipettspetsen.
    2. Använder den trimmade spetsen, noggrant Pipettera 100 µL av cell/matrix blandningen i mitten av varje brunn. Pipettera långsamt, med målet att göra en enda matris ”släpp” i mitten av varje brunn. Minskningen bör förbli sfäriska och ska inte vidröra sidorna av brunnen. När du flyttar plattan, gör så noggrant undviks störande dessa droppar.
    3. Inkubera basalmembranet matrix dropparna vid 37 ° C och 5% CO2 för 30 min, tills solid.
    4. Noggrant Pipettera 500 µL av differentiering Media i varje brunn, noga med att inte störa matris droppe. Se till att media bara omslaget matrisen släppa och tillsätt mer om det behövs.

8. skilja och mogen HNE Spheroids

  1. Använda en 1 mL pipettspetsen, försiktigt aspirera alla medier från väl; Undvik att aspirera matrisen, som kommer att förstöra spheroids i den delen av matrisen, även om någon spheroids kvar kan förbli livskraftig.
  2. Använder en färsk 1 mL pipettspetsen, varsamt tillsätt 500 µL av differentiering media till brunnen runt matrisen. Inte röra matrisen med pipetten och undvika att störa matrix drop.
  3. Returnera spheroids till inkubatorn på 37 oC och 5% CO2 för fortsatt tillväxt. Upprepa steg 8,1 genom 8,3 tre gånger per vecka.
  4. Utvärdera sfäroid morfologi dagligen under en inverterade Mikroskop 20 X. Spheroids bör bilda inom 3-5 dagar efter plätering och nå mognad inom cirka 10 dagar.

9. förbehandla, stimulera och bild HNE Spheroids för analys

  1. Förbehandla spheroids som önskas före imaging som tidigare beskrivna30.
    Obs: För VX809 förbehandling, Lägg till 3 µM av VX809 till media för 48-72 h före imaging. Blanda 1 µL 10 mM VX809 lager (se Material tabell) i 3,3 mL media för denna koncentration.
  2. Ändra var väl av spheroids 1 ml färsk differentiering Media, inklusive förbehandling (steg 8,1-8.3) innan imaging spheroids.
  3. Förbereda färska stimulering droger lösningar (Forskolin, 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], VX770 och CFTR hämmare 172 [Inh172]) från bestånd (se Material tabell). För forskolin/IBMX, lägga till 1 µL av varje bestånd i 98 µL sterilt vatten i en enda märkt 1,5 mL tub. För VX770 och Inh172, tillsätt 1 µL av varje bestånd till 99 µL sterilt vatten i separata märkta 1,5 mL rör. Göra en total volym som möjliggör 50 µL lösning för varje brunn testas. Bered lösningar under sterila förhållanden i biosäkerhet skåp.
  4. Överföra sfäroid plattan till en ruvade kammare satt till 37 ° C och 5% CO2, monterad på ett inverterat Mikroskop utrustad med elektronisk bild ta till fånga mjukvaran och en mekanisk scen för XY justering. Slå på mikroskopet och kamera, samt imaging datorn.
  5. Fånga baslinjen bilder av spheroids i en brunn.
    1. Öppna programvaran image capture (Slidebook 5.5 för vägbeskrivning nedan). När initierats, öppna en ny fil genom att klicka på ”File” och sedan ”ny”. Döp filen med detta och klicka på ”Spara”.
    2. Försiktigt bort kultur plattan locket och centrerar en matris droppe över målet.
    3. Börjar på toppen av matrix drop, flytta i ett rutnät att hitta spheroids på 20 x förstoring med mikroskopet okularet. Fokus upp och ner för att fånga en sfär på det bredaste stället. Anteckna platsen för varje sfäroid på en karta över matris nedrullningsbara identifiera igen efter imaging.
    4. Till programvaran, klicka på ”bild-Capture”. För exponering, Välj ”manuell” och ange 50 ms säkerställa andra inställningar är lämpliga (Bin faktor: 1 x 1, W: 512, H: 512, X och Y-förskjutning: 0). Ange ett lämpligt namn för varje bild i rutan ”namn” (t.ex. sfäroid 1 Baseline). Klicka på ”Start” för att visa en levande bild och ”spara” för att fånga en baseline-bild.
    5. Upprepa steg 9.5.1-9.5.4 tills mål nummer nås eller hela matrix droppe är avbildade.
      Obs: Gruppen skillnader kan upptäckas med så få som 3-5 spheroids per tillstånd, men det har blivit vår praktik till bild 10 eller fler spheroids per tillstånd att öka makten. Variabilitet i analysen framgår i figur 2 i avsnittet ”representativa resultat” med prover av 8-10 spheroids per ämne som ett exempel.
  6. Stimulera spheroids.
    1. Med 200 µL pipett, tillsätt 50 µL av lämpliga stimulering drogen i media inom brunnen, noga med att inte störa matrisen.
      Obs: Efter denna 10-faldig utspädning (50 µL in 500 µL av media), slutliga drog koncentrationen kommer att: forskolin 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. För cAMP bara, lägga till bara forskolin/IBMX.
    3. För cAMP + VX770, lägga till forskolin/IBMX först, sedan VX770 efter 2 min.
    4. För hämmad villkor, lägga till Inh172 första, sedan forskolin/IBMX efter 2 min.
  7. Omedelbart efter stimulering, övervaka sfäroid svullnad av timelapse imaging för 1 h. Till programvaran, klicka på ”bild-Capture”. Klicka på ”Timelapse”, och ange intervallet till 30 s, med en löptid på 60 min. Ange ett lämpligt namn och klicka på ”Spara” starta timelapse.
    Obs: Standard timelapse är att fånga bilder av en enda sfäroid varje 30 s för att säkerställa en hög kvalitet video. Alternativt utföra lägre förstoring tillfångatagandet av hela brunnen (t.ex. 4 X), och färre bilder tagna om så önskas. Om du använder ett automatiserat Stadium utföra timelapse av alla spheroids använder fördefinierade koordinater; Annars Använd timelapse av en delmängd av spheroids att ge en kvalitativ granskning av svullnad och se till att inga systematiska problem uppstår under imaging (t.ex. matrix avlossning från Brunnen).
  8. Omedelbart efter avslutad 1 h timelapse bilden, bildtagning efter stimulering av alla spheroids (per steg 9,5) med hjälp av kartan som skapades i steg 9.5.3.
    1. Se före stimulering bilder att säkerställa samma plan fokus används för uppföljande bilder (focal kvaliteten av omgivande celler, spheroids eller skräp kraftigt underlätta denna process).
    2. Spara filer med en parkopplad annotation från steg 9.5.4 (t.ex. sfäroid 1 efter stimulering).
      Obs: slutföra detta steg omedelbart efter timelapse, som spheroids får fortsätta att svälla.
  9. Ersätta media i den avbildade väl med färska differentiering Media.
  10. Upprepa steg 9,5 genom 9,9 för varje brunn/villkor, justera stimulering droger som anges för experimentella förhållanden.
  11. När alla imaging är klar, återgå spheroids till inkubatorn vid 37 ° C och 5% CO2.
    Obs: Beroende på sterilitet ruvade Mikroskop kammaren, efter stimulering kontaminering av spheroids kan vara ganska vanligt. Antingen behålla avbildad spheroids i en separat inkubator, att minimera risken för korskontaminering, eller kassera spheroids omedelbart efter imaging.

10. analysera HNE sfäroid bilder

  1. Exportera alla tagna bilder till ett format som är kompatibelt med bild analys programvara. I programvaran, klicka på ”Visa”, håll muspekaren över ”Export”, och välj ”standard visningar av alla bilder som TIFF...”. Spara på hårddisken eller en flash-enhet för analys.
    Obs: en kommersiell analysprogramvara (Tabell av material) och TIFF-filer prestera bra och beskrivs här, även om analysen kan också utföras med andra plattformar. Vid namngivning av filer, bör personalen analysera bilder förblindade att de experimentella villkor, men medveten om vilka bilder paras (före och efter stimulering) för att säkerställa likvärdig analys.
  2. Använda analysprogram, avgränsa området luminala i varje sfäroid bild och exportera till en data analysprogram.
    1. Öppen programvara. Klicka på ”File”, sedan ”öppna” och navigera till mappen som innehåller sfäroid bilder. Välj alla bilder för analys och klicka på ”öppna”.
    2. Klicka på ”åtgärd” och välj ”regionen mått”. Inom den regionen mätningar i dialogrutan Välj droptab ”konfiguration” och se rutorna ”Image Name” och ”Area” kontrolleras.
    3. Klicka på ”Log” och välj ”Öppna Data Log”. Klicka ”OK” på filen Data Log dialog rutan och namn med detta (t.ex., skick X, datum). Detta kommer att överföra alla mätningar till ett kalkylblad.
    4. Välj ”Trace Region” verktygsknappen och noggrant spåra lumen sfäroid i den första bilden för analys. Klicka på ”Log Data” för att logga mätningen till Excel i dialogrutan Region mätning.
    5. Upprepa steg 10.2.2-10.2.4 tills alla spheroids analyseras.
  3. Beräkna procentuella förändringen (100 * [inlägget-stim - Baseline] ÷ Baseline) i området luminala från baslinjen för varje enskild sfäroid bild par och sammanställa data för analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HNEs bör bifoga till kultur skålen och bildar små öar av celler inom 72 timmar efter sådd; exempel på bra och dålig ö bildande på en vecka visas i figur 1A och 1B, respektive. Dessa öar bör utvidgas för att täcka skålen under loppet av 15-30 dagar. Små eller suboptimala prover kan ta längre tid, och ofta inte kommer att ge användbar spheroids. Kontaminering med smittämnen framgår av djupt gul/grumlig media, underlåtenhet av cellerna att fästa kultur skålen, och/eller direkt visualisering av svamp/bakterier. Eventuella förorenade kulturer ska kasseras omedelbart för att undvika korskontaminering.

Inom de första 3-4 dagarna av kultur i matrisen basalmembranet, bör små cystisk strukturer börja form i matrisen. Dessa kommer att mogna över cirka 10 dagar till intakt spheroids visar en tunn vägg och en luminala yta. Om pläterade på det beskrivna densitet, innehåller framgångsrika kulturer 50-100 spheroids per matris droppe. Lumina kan vara relativt tydliga (figur 1 c) eller fylld med cellulära skräp och slem (figur 1 d); den förstnämnda är vanligare i spheroids med vildtyp CFTR (wtCFTR), och den senare i CF spheroids. Maskering för att avgränsa området luminala i spheroids i figur 1 c och 1 D demonstreras i figur 1E och 1F, respektive. Exempel på dåligt bildade/misslyckade sfäroid kulturer finns i figur 1 g och 1 H.

Representativa funktionella uppgifter för vildtyp och F508del CFTR homozygot HNE spheroids visas i figur 2A och 2B, respektive; dessa data är representativt för > 10 unika HNE prover vildtyp och F508del CFTR homozygota individer30. Kort sagt, spheroids med funktionella CFTR svälla, medan de med dysfunktionella CFTR svälla betydligt mindre, eller kan krympa. Specifikt, spheroids från patienter med wtCFTR ska svälla över en timme när stimuleras, och bör mindre svälla eller krympa om stimuleras i närvaro av den CFTR-hämmaren Inh172. Omvänt, spheroids från ett ämne som är homozygota för F508del CFTR bör antingen krympa eller svälla mycket något, med ökad svullnad (eller mindre krympande) när farmakologiskt korrigeras med de CFTR modulatorer VX809 och VX770. Tidigare analyser av sfäroid tillförlitlighet både inom och mellan individer av samma genotyp visar funktionell åtskillnad av CFTR genotyper och blygsamma variabilitet i upprepade mätningar30.

Media-komponent Stamlösning Belopp Förvaring
Expansion Media
DMEM / F-12 näringsämne blandning ”Base Media” Användning som är 2 x 500 mL behållare Förvaras vid 4 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Fetalt bovint Serum Användning som är 50 mL Förvaras vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Kolera Toxin 10 mg i 1 mL sterilt vatten 1 ΜL Lagra lager vid-20 ° c upp till sex månader
Epidermal tillväxtfaktor 500 µg i 1 mL sterilt vatten 20 ΜL Lagra lager vid-20 ° c upp till sex månader
Hydrokortison 0,4 mg i 400 µL sterilt vatten Hela 400 µL alikvot Gör fräsch med varje batch. Förvara pulvret i rumstemperatur upp till tillverkaren utgångsdatum
Adenin 24 mg i 1 mL sterilt vatten Hela 1 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Förvara pulvret i rumstemperatur upp till tillverkaren utgångsdatum
Y-27632 3,2 mg i 1 mL sterilt vatten Hela 1 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Antibiotikum Media
Amfotericin B Användning som är 1,2 mL Förvaras vid 4 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Ceftazidime 15 mg i 1 mL sterilt vatten Hela 1 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Tobramycin 15 mg i 1 mL sterilt vatten Hela 1 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Vankomycin 15 mg i 1 mL sterilt vatten Hela 1 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum

Tabell 1: Komponenter i Expansion och antibiotika Media.

Media-komponent Stamlösning Belopp Förvaring
DMEM / F-12 näringsämne blandning ”Base Media” Användning som är 2 x 500 mL behållare Förvaras vid 4 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Ultroser-G 20 mL sterilt vatten i en enda, 20 mL flaska frystorkade Ultroser-G Hela 20 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid 4 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Fostrets klon II Användning som är 20 mL Förvaras vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Pen Strep Användning som är 10 mL Förvaras vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Bovin hjärnan extrakt Användning som är 2.48 mL Förvaras vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Transferrin Användning som är 250 ΜL Förvaras vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Insulin Användning som är 250 ΜL Förvaras vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Etanolamin Användning som är 15 ΜL Förvaras i rumstemperatur upp till tillverkaren utgångsdatum
Epinefrin 2,75 mg i 1 ml sterilt vatten Hela 1 mL alikvotens Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid 4 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Trijodtyronin 8,4 mg i 50 µL av DMSO Hela 50 µL alikvot Gör fräsch med varje batch. Lagra pulver vid-20 ° c upp till tillverkaren utgångsdatum
Hydrokortison 7.24 mg i 1 mL etanol 1 ΜL Lagra lager vid-20 ° c upp till sex månader
Phsophoryletheanolamine 35.25 mg i 1 mL sterilt vatten 1 ΜL Lagra lager vid-20 ° c upp till sex månader
Retinoinsyra 3 mg i 1 mL av DMSO 1 ΜL Lagra lager vid-20 ° c upp till sex månader

Tabell 2: Komponenter av differentiering Medium.

Figure 1
Figur 1 : HNE Expansion och strukturella egenskaper hos HNE Spheroids. Brightfield bilder av HNE expansion kulturer tagit sju dagar efter bordläggningen visar framgångsrika (vit pil, panel A) och misslyckade (panel B) HNE kolonin bildandet på mataren fibroblast bakgrund. Framgångsrika wtCFTR och F508del homozygot spheroids visas i panelerna C och D, respektive. Maskering för att avgränsa området luminala spheroids från C/D finns i paneler E och F, respektive. Misslyckade sfäroid kulturer kännetecknas av små, oorganiserad cellulära skräp (panel G) och/eller oorganiserad klumpar av celler (panelen H). Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Funktionella egenskaper hos HNE Spheroids. Representativa funktionella svar av wtCFTR spheroids från en enda donator, när stimuleras med forskolin/IBMX med/utan närvaro av CFTR-hämmaren Inh172 visas i panelen (A) varje punkt representerar responsen i en enda sfäroid. Representativa funktionella Svaren av F508del homozygot spheroids från en enda donator, när stimuleras med forskolin/IBMX med och utan förekomst av VX809 och VX770 visas i panelen (B). Felstaplar = SEM. ** p < 0,01; p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det här protokollet beskriver generationen av patientderiverade nasal sfäroid cellkulturer kunna producera en individualiserad, specifika modell av CFTR funktion. Det finns flera viktiga steg i den process som skall bevistas noga för att undvika svårigheter. Först är ett bra prov förvärv från patientens näsa. Ett bra prov bör ha > 50.000 celler, begränsad slem/skräp, och vara redo för bearbetning inom 4 h (även framgång är också enkelt kan uppnås med övernattning frakt på isen). Praktiken förvärva prover med kyrett eller borste av studien personal är nödvändigt, vilket underlättas av fokuserar tidiga prov förvärv i händerna av en eller två leverantörer att maximera deras komfort. Andra, bra rengör/steril teknik i alla vävnadsodling steg är viktigt. Primära funktionsläget av misslyckande, vår erfarenhet, för alla HNE kulturer är bakterie- eller svampinfektioner kontaminering, vilket kan komplicera både primära provet och andra växande kulturer i inkubatorn. Denna risk ökar bara med kulturer av patienter med kronisk infektion (t.ex., CF), därför framgång beror till stor del på förmågan att hålla kulturer ren och separat. Vår praktik är att hålla en inkubator separat endast för infektion-benägen kulturer inom 5-7 dagar, skydda äldre, framgångsrika kulturer från oavsiktlig kontaminering. Det tredje är det viktigt att noga titta på celler under expansionsfasen och undvika overconfluence. Om cellerna tillåts nå full sammanflödet på plattan, finns det en risk att kulturen kommer att antingen bli senescent eller celler börjar dö och lossa. Slutligen, när plätering celler som spheroids, är det viktigt att grundligt skingra cellerna genom matrisen och plattan en jämnt fördelad provet. Antingen över - eller under - population av matrix dropparna kommer att leda till kultur och stora klumpar av celler kommer inte att producera framgångsrika spheroids.

Samtidigt genomföra detta protokoll, kan utredare stöta på några vanliga problem. Kontaminering, undviks som nämnts ovan, bäst genom att skaffa en bra inledande prov utan slem och ren kultur tekniker. Om kulturer är framgångsrika genom expansion, men ingen differentierade områden bildas, flera problem kan ha uppstått. Om matrisen visas mestadels tom, det är mest sannolikt att cellerna var seedad på för låg med en densitet; öka den sådd tätheten av efterföljande försök med cirka 20%. Omvänt, om matrisen verkar vara ”smutsig” med rikliga cellfragment, det är troligt att cellerna var seedad på alltför hög densitet och efterföljande försök bör använda en sådd densitet minskat med cirka 20%. En vanlig komplikation vid sådd efter utfodring och underhåll är avskiljandet av matrisen från fartyget som kultur. Detta orsakas av alltför aggressiv media exchange och kan undvikas genom att försiktigt och manuellt ändra media med 1 mL pipett inte väggen sug. Om stött, kan sfärer fortfarande vara stimuleras och avbildade, även om detta kan vara svårt om matrisen ”flyter” i brunnen under imaging, kräver försiktiga kartläggning av spheroids i brunnen.

Utredarna kan driva flera ändringar i protokollet, beroende på deras labb behov. För högre upplösning imaging av spheroids, har vi tidigare ersatt 4-väl plattorna med optiskt glas alternativ, inklusive 35 mm glasbotten rätter eller kammare diabilder. Detta möjliggör hög upplösning, levande avbildning av spheroids, men kan minska genomströmning. Alternativt, för att öka dataflödet, mindre portioner av celler i matrisen kan dirigeras till andra fartyg (t.ex. 24-väl kultur pläterar). Vår erfarenhet växer spheroids bäst med matrisen i en ”droppe” form i motsats till bildar ett ark på botten av brunnen; som sådan, vi har haft bäst framgång med droppar av minst 25 µL. utredarna vill förändra tätheten av matris genom att späda med media. Detta minskar den totala mängden matrix nödvändigt, förbättra kostnaden för analysen. Detta också, dock kan förändra sfäroid sammansättning. I våra tidigare erfarenheter, lägre koncentrationer av basalmembranet matrix leda till förändrad sfäroid struktur, med antingen partiell eller komplett bildandet av spheroids i en ”cell-apex-out”-morfologi. Som sådan, bör spheroids genereras genom ändringar protokoll i matrix koncentration försiktigt utvärderas för morfologi innan funktionell testning görs. Slutligen kan olika stimulerande eller inhiberande droger eller olika koncentrationer av dessa läkemedel, användas. Forskolin, IBMX och Inh172 valdes för våra studier på dessa koncentrationer baserat på tidigare erfarenhet i ALI kulturer31. Använder andra läkemedel (t.ex. isoproterenol för stimulering, GlyH101 för hämning) kanske bättre gäller en prövarens studie. Likaså använder olika koncentrationer av forskolin, IBMX eller Inh172 kan förändra det dynamiska omfånget av analysen, dock har vi inte systematiskt testat dessa alternativ.

Med tanke på antalet befintliga ex vivo patientderiverade CFTR analyser, utmärks den beskrivna modellen av flera viktiga skäl. Först, det kapitaliserar på näsans celler som ett enkelt erhållna källa av respiratoriska vävnad. HNE upphandling kan utföras säkert med minimal utbildning i nästan alla miljöer (klinik, OR, forskning besök) i alla åldersgrupper25. Detta underlättar robust prov upphandling och upprepa provtagning om det behövs på grund av tillväxt svårighet eller kontaminering. Jämfört med intestinal organoids, HNE spheroids är mindre väl karakteriserade och visas som har ett mindre dynamiskt område i nuvarande form, emellertid, användning av respiratoriska istället för GI vävnad kan vara en viktig fördel, som flera CF sjukdom förare (t.ex. mukociliär clearance, epitelial natrium kanal uttryck) inte är likvärdiga i tarmen. I motsats till plana, ALI kulturer av HNE celler, spheroids odlas snabbare och kan vara mer representativ för i vivo villkor, mäta en fysiologisk process (vätska homeostasis) som kan vara mer relevant än elektrofysiologi ensam32. Genom att förbättra tiden från provet upphandling till testning, reduceras kontaminering potentiella, därför ökar sannolikheten för kultur framgång. Slutligen, den 3-dimensionella naturen av modellen kan vara mottaglig av Roman eller kompletterande linjer av forskning i luftvägarna utveckling eller morfologi som inte är genomförbara i ALI kulturer (t.ex., det luminala slem spårning, snabb studier av differentiering, etc.).

Det finns flera viktiga begränsningar för HNE spheroids som ett test av CFTR funktion. Först, denna analys förblir relativt låg genomströmning. Med nuvarande metoder, bild förvärvandet tar över en timme för varje kultur villkor och analys tar en ytterligare 20-30 min per tillstånd. Detta förvärras av graden av överlappning mellan vissa villkor (såsom visas i figur 2A), vilket kräver ett större antal mätningar (denna överlappning i sig kan också utgöra en begränsning av känsligheten i denna analys). Som sådan, kräver ett enda experiment med 4-6 villkor nästan två dagar för slutförande. Genomströmning kan förbättras genom att anställa automatiserade Bildinsamling och analysmetoder; sådana anpassningar pågår för närvarande. För det andra, denna modell kräver en stor mängd matris, som kan bli dyra. Som nämnts ovan, utspädning av matrisen kan bidra till att övervinna detta hinder, men måste tas med försiktighet, eftersom förändringar i tillväxt matrix kommer sannolikt resulterar i förändringar i sfäroid morfologi. För det tredje, denna modell bygger på sfäroid mätningar i ett XY-planet bara, och bortser från svullnad i det Z-planet, som kan införa bias. Medan tidigare reproducerbarhet analyser har varit lugnande, kunde denna brist övervinnas genom användning av automatiserade imaging med Z-plan för att beräkna volym30. Slutligen, och viktigast av allt, är omfattande arbete att knyta sfäroid Svaren till den enskilda personens i vivo narkotika svar ändå att slutföras. I avsaknad av detta samband är det prediktiva värdet av modell - medan lovande - oklart.

Generation och analys av HNE spheroids tillåter ex vivo analys av enskilda CFTR aktivitet och modulering, som i slutändan kan vara användbart som en preklinisk modell av narkotika svar. Dessutom kan ges den omfattande variationen i CF sjukdomens svårighetsgrad, sådan en individualiserad modell ge insikter i motivets unika luftvägarna mikromiljö. På detta sätt, kan en sådan modell vara användbart för studier av bredare CFTR biologi och stöd i att förstå sjukdomen heterogenitet. Framtida användning av denna modell, liksom andra liknande modeller av individualiserad CFTR funktion, håller löfte att bättre förstå CFTR biologi i labbet, och att driva personlig och precision medicin i kliniken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av cystisk fibros Foundation Therapeutics, bevilja nummer CLANCY14XX0 och genom cystisk fibros Foundation, tilldela CLANCY15R0. Författarna vill tacka Kristina Ray för hennes hjälp i Patientrekrytering och tillsyn. Författarna vill även tacka arbetsgruppen HNE stöds av stiftelsen cystisk fibros, som assisterade i generation av HNE kultur kapacitet: Preston Bratcher, Martina Gentzsch, Michael Myerburg, Elizabeth Joseloff, Calvin Cotton, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon och Katherine Tuggle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Tube USA Scientific  4036-3204
150 mL Filter Flask Midsci  TP99150 To filter Media
15 mL Conical Tube Midsci  TP91015
1 L Filter Flask Midsci  TP99950 To filter Media
35 mm Glass-Bottom Dish MatTek Corporation P35G-0-20-C Optional
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) Fisher Scientific  AC228420010  Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO
50 mL Conical Tube Midsci   TP91050
Accutase Innovative Cell Technologies, Inc. AT-104 Cell detachment solution
Adenine Sigma-Aldrich A2786-25G See Table 1
Amphotericin B Sigma-Aldrich A9528-100MG See Table 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL) Lonza  CC-4098 See Table 2
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich C3809-1G See Table 1
Cell Scrapers 20 cm  Midsci  TP99010
CFTR Inh172 Tocris Bioscience 3430 Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) Sigma-Aldrich C8052-.5MG See Table 1
CYB-1 Medical Packaging Corporation CYB-1 Cytology brush
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes  Life Technologies  11330-057 Base Medium; See Tables 1 and 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) Thermo Fisher Scientific PHG6045 See Table 1
Epinephrine Sigma-Aldrich E4250-1G See Table 2
Ethanol Fisher Scientific  2701
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135-500ML 16.6 mM solution; See Table 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) TCI America  E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) Invitrogen  10082147 See Table 1
Forskolin Sigma-Aldrich F6886-50 Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO
Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 356231 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) Advanced BioMatrix 5007-A Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)  GE Healthcare  SH30066.03HI See Table 2
Hydrocortisone StemCell Technologies 07904 See Tables 1 and 2
Insulin, human recombinant, zinc solution Life Technologies  12585014 4 mg/mL solution; see Table 2
IVF 4-Well Dish, Non-treated NUNC (via Fisher Scientific) 12566350 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate
MEF-CF1-IRR Globalstem GSC-6001G Irradiated murine embryonic fibroblasts
Metamorph 7.7 Molecular Devices Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote
Olympus IX51 Inverted Microscope Olympus Corporation Discontinued Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  for a quote
Pen Strep Life Technologies  15140122 See Table 2
Phsophoryletheanolamine Sigma-Aldrich P0503-5G See Table 2
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625-50MG See Table 2
Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. 96-0905 Nasal curette
Slidebook 5.5 3i, Intelligent Imaging Innovations Discontinued Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 20012050
Sterile Water Sigma-Aldrich W3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100 Techno Plastic Products 93100 Tissue culture dish for expansion
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG See Table 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza  CC-4205 See Table 2
Triiodothryonine Sigma-Aldrich T6397-1G 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; See Table 2
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma-Aldrich T4799-10G
Ultroser-G Crescent Chemical (via Fisher Scientific) NC0393024 20 mL lypophilized powder; See Table 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis Sigma-Aldrich V2002-5G See Table 1
VX770 Selleck Chemicals S1144 Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO
VX809 Selleck Chemicals S1565 Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO
Y-27632 Dihydrochloride  ROCK inhibitor  Enzo LifeSciences  ALX-270-333-M025  See Table 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

Tags

Medicin fråga 134 cystisk fibros CFTR Precision Medicine Organoid sfäroid Nasal Cell cellkultur
Generation av mänsklig Nasal epitelial Cell Spheroids för individualiserad cystisk fibros Transmembrane Conductance Regulator studie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., … More

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., LaRosa III, F. J., Moncivaiz, J. D., Ostmann, A. J., Strecker, L. M., Clancy, J. P. Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study. J. Vis. Exp. (134), e57492, doi:10.3791/57492 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter