Summary
Her beskriver vi en metode til at generere tredimensionelle klumpformet kulturer af menneskers nasal epitelceller. Spheroids derefter stimuleres til at drive cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR)-afhængige ion og væske sekretion, kvantificere ændringen i klumpformet luminale størrelse som en proxy for CFTR funktion.
Abstract
Mens indførelsen af cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator (CFTR) modulator narkotika har revolutioneret pleje i cystisk fibrose (CF), har genotype-rettet terapi model i øjeblikket i brug flere begrænsninger. Første, sjældne eller forsømt mutation grupper er udelukket fra endelige kliniske forsøg. Desuden, som yderligere modulator narkotika komme ind på markedet, vil det blive vanskeligt at optimere modulator valg for en individuel sag. Begge disse spørgsmål behandles med brug af patient-afledte, individuelt tilpassede prækliniske modelsystemer af CFTR funktion og graduering. Menneskers nasal epitelceller (HNEs) er en let tilgængelig kilde til respiratorisk væv til sådan en model. Heri, beskriver vi generation af en tre-dimensionelle klumpformet model af CFTR funktion og modulation ved hjælp af primære HNEs. HNEs er isoleret fra fag i en minimalt invasiv mode, udvidet i betinget omprogrammering betingelser, og seeded i klumpformet kultur. Senest 2 uger efter såning, klumpformet kulturer generere HNE spheroids, der kan blive stimuleret med 3', 5'-cyklisk adenosin fra (cAMP)-generering agonister at aktivere CFTR funktion. Klumpformet hævelse er derefter kvantificeres som en proxy for CFTR aktivitet. HNE spheroids kapitalisere på minimalt invasiv, men respiratorisk oprindelsen af nasal celler til at generere en tilgængelig, personlig model relevante for en epitel afspejler sygdom sygelighed og dødelighed. I forhold til luft-flydende interface HNE kulturer, er spheroids forholdsvis hurtig til at modnes, hvilket reducerer den samlede forurening hastighed. I sin nuværende form, er modellen begrænset af lav overførselshastighed, men dette opvejes af den relative lethed af væv erhvervelse. HNE spheroids kan bruges til at pålideligt kvantificere og karakterisere CFTR aktivitet på det individuelle plan. En igangværende undersøgelse at binde denne kvantificering i vivo drug reaktion vil afgøre, om HNE spheroids er en sand prækliniske prædiktor af patientens reaktion på CFTR graduering.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en fatal, autosomal recessiv sygdom påvirker over 70.000 mennesker over hele verden1. Dette liv-afkortning genetisk sygdom er forårsaget af mutationer i den cystisk fibrose Transmembrane ledningsevne Regulator protein (CFTR)2. CFTR er medlem af adenosin trifosfat-binding kassetten familie, og fungerer som en ion-kanal tillader bevægelse af chlorid, og bikarbonat over de apikale membraner af flere polariseret epitheler herunder mave-tarmkanalen, sved kirtel, og respiratoriske træ, blandt andet3,4. Som sådan, fører dysfunktionelle CFTR til multisystemisk epitelial dysfunktion, med de fleste dødelighed som følge af luftvejssygdomme1. I CF lunge, tab af CFTR-drevet luftvejene overflade flydende (ASL) forordning og slim release fører til fortykket slim, luftvejsobstruktion, kronisk infektion, og progressive luftvejene remodellering og tab af lunge-funktion1,5.
Trods identifikationen af CFTR dysfunktion som årsag til sygdom, behandlinger i CF traditionelt fokuseret på afbødning af symptomer (f.eks., pancreas enzym substitutionsbehandling, luftvejene clearance terapier)1. Denne tilgang blev for nylig revolutionerede ved fremkomsten af roman therapeutics, betegnes "CFTR modulatorer," der er direkte målrettet dysfunktionelle CFTR. Denne tilgang har flyttet den kliniske landskab fra symptom management til sygdomsmodificerende pleje men bærer flere begrænsninger6,7,8,9,10. Modulator aktivitet er specifikke for protein defekten ledsager hver CFTR mutation og begrænset til Vælg genetiske populationer11. Denne begrænsning er drevet af den heterogene karakter af protein mangler, men også af upraktiske af kliniske forsøg i sjældne mutation grupper. Derudover blandt forsøgspersoner med velundersøgte genotyper (f.eks.F508del/F508del CFTR, den mest almindelige CFTR mutation), er der bred variation i sygdom byrde og modulator svar6,7,8 ,9,11.
For at overvinde begge disse spørgsmål, har efterforskere foreslået brugen af personlig modeller for præklinisk afprøvning12. Dette begreb udnytter patient-specifikke væv for at generere en individualiseret ex vivo modelsystem for sammensatte test, forudsige i vivo emne svar på terapier i en personlig måde. Når validerede, kunne sådan en model bruges af klinikere at drive præcision terapi uanset patientens underliggende CFTR genotype.
Menneskelige bronchiale epitel (HBE) celler fremstillet af eksplantat væv i forbindelse med lungetransplantation etableret muligheden for sådan en model for CF13,14. HBEs dyrkes i en air-liquid grænseflade (ALI) giver mulighed for funktionel CFTR kvantificering direkte gennem elektrofysiologisk testning eller indirekte gennem foranstaltninger af ASL homøostase13,15. Denne model har været afgørende for at forstå CFTR biologi og var en vigtig drivkraft i udviklingen af CFTR modulatorer16. Desværre er HBE modeller ikke holdbar som en personlig model på grund af erhvervelse (lungetransplantation eller bronkial børstning) invasive art og manglende prøver for personer med sjældne mutationer eller mild sygdom. Omvendt, tarmens væv, fremstillet af rektal eller duodenal biopsi prøver, kan bruges til tarm aktuelle måling (ICM) eller en hævelse-baserede organoid analysen for at studere individualiseret CFTR funktion17,18, 19. Organoid assays, i særdeleshed er meget følsomme modeller af CFTR aktivitet20,21,22. Begge modeller er begrænset af væv kilde (tarmens væv, mens de fleste sygdom patologi er respiratorisk) og den semi-invasive metode til erhvervelse. Alternativt, adskillige efterforskere har studeret menneskers nasal (HNE) epitelceller til model CFTR restaurering23,24,25. HNEs sikkert kan høstes af børste eller curettage i emner i alle aldre, og når kulturperler i ALI, sammenfatte mange Karakteristik af HBEs25,26,27,28. HNE éncellelag kulturer har traditionelt været begrænset af planocellulære transformation og lang tid at modenhed29. Desuden rapporterede kortslutte aktuelle målinger i HNEs er mindre end i HBEs, tyder på et mindre vindue for at registrere terapeutiske virkning25.
I betragtning af behovet for en personlig, ikke-invasiv, respiratorisk vævskultur model af CFTR funktion, forsøgte vi at flette følsomhed af en hævelse-baseret, organoid assay med HNEs non-invasiv og respiratoriske karakter. Her, beskriver vi vores metode til at generere 3-dimensional "klumpformet" kulturer af HNEs for individualiseret CFTR undersøgelse i en hævelse-baseret analyse30. HNE spheroids polarisere pålideligt med epitelial apex mod kuglens centrum, eller lumen. Denne model indeholder talrige Karakteristik af en lavere respiratorisk epitel og modner hurtigere end ALI kulturer. Som en funktionel assay kvantificere HNE spheroids pålideligt en vifte af CFTR funktion samt graduering i velundersøgte mutation grupper (f.eks.F508del CFTR). Denne hævelse-baseret analyse udnytter ion/salt transport egenskaber af CFTR, indirekte måling væske tilstrømning til sfæroide, som vandet følger apikale salt efflux. På denne måde, stimuleret spheroids med fuldt funktionelle CFTR svulme håndfast, mens dem med dysfunktionelle CFTR svulme mindre eller krybe. Dette er kvantificeret gennem billedanalyse af præ og 1 h efter stimulation spheroids, måle luminale område og fastlægge procent ændre. Denne foranstaltning kan derefter sammenlignes på tværs af eksperimentelle grupper til at screene for drug bioactivity i en patient-specifikke mode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE prøver blev indkøbt fra fag rekrutteret gennem Cincinnati children's Hospital medicinsk Center CF Research Center. Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Review Board (IRB) af Cincinnati children's Hospital Medical Center. Skriftlige samtykke blev opnået fra alle fag inden prøvningen.
1. Forbered ekspansion medier og antibiotika medier
- Samle medier komponenter der er anført i tabel 1. Optø frosne materialer ved stuetemperatur og foretage nødvendige stamopløsninger som angivet i tabel 1 under "Ekspansion medier".
Bemærk: Vær forsigtig, når du håndterer kolera toksin, som er giftigt ved indtagelse, og er en hud, øje, og respiratoriske irriterende. Gøre og kombinere alle løsninger og medier på ren betingelser i biosikkerhed kabinet. - Ved hjælp af en 50 mL serologiske pipette, Fjern og kassér 50 mL af base medium (Dulbecco ændret Eagle Medium/F12) fra en container til at kompensere for tilføjelse af andre materialer. Hæld alle base medier i hånden i en autoklaveres 1 L glasflaske.
- Ved hjælp af en 50 mL serologiske pipette eller 1 mL pipette som passende, overføres alle resterende komponenter fra afsnittet "Ekspansion Media" i tabel 1 til autoklaveres glasflaske indeholdende medierne. Forsigtigt swirl flaske i hånden at blande.
- Filter medier ind i en ny, sterile 1 L, 0,22 µm polyethersulfone (PES) sugekolbe ved hjælp af producentens anvisninger og anmærke med "Ekspansion medier" og dato.
-
Forberede antibiotika medier. Foretage nødvendige antibiotika stamopløsninger som angivet i tabel 1 under "Antibiotika medier."
- Overføre ved hjælp af 50 mL serologisk pipette, 150 mL af ekspansion medier til en frisk 250 mL autoklaveres glasflaske.
- Brug 1 mL pipette, tilføje alle komponenter fra afsnittet "Antibiotikaresistens Media" i tabel 1 i autoklaveres glasflaske indeholdende medierne. Hvirvel i hånden til at blande indtil medierne er ensartet i udseende.
- Filter medier i en frisk, sterile 250 mL, 0,22 µm PES sugekolbe ved hjælp af producentens anvisninger og anmærke med "Antibiotika medier" og dato.
- Gemme medier ved 4 ° C i op til en måned, udsmid hvis overskyet, hvilket tyder på forurening.
2. klargør differentiering medier
- Samle medier komponenter der er anført i tabel 2. Optø frosne materialer ved stuetemperatur og foretage nødvendige stamopløsninger som angivet i tabel 2.
Bemærk: Udvis forsigtighed ved håndtering af retinoid syre, som er en reproduktive toksin, kan være giftig ved indtagelse, og forårsager hudirritation. Gøre, alikvot, og kombinere alle løsninger og medier på ren betingelser i biosikkerhed kabinet. - Fjern og kassér 52 mL af den base medium fra en container til at kompensere for tilføjelse af andre materialer. Hæld alle base medier i en autoklaveres 1 L glasflaske.
- Ved hjælp af en 25 mL serologisk pipette eller 1 mL pipette som passende, overføre alle resterende komponenter fra tabel 2 til autoklaveres glasflaske indeholdende medierne og hvirvles forsigtigt i hånden til at blande.
- Filter medier ind i en ny, sterile 1 L, 0,22 µm polyethersulfone (PES) sugekolbe ved hjælp af producentens anvisninger og anmærke med "Differentiering medier" og dato.
- Gemme medier ved 4 ° C i op til en måned, udsmid hvis overskyet, hvilket tyder på forurening.
3. coat kultur retter og plade Feeder fibroblaster
Bemærk: Udføre alle trinene ren betingelser i biosikkerhed kabinet.
- Bland 0,5 mL af kollagen materiel og 37,5 mL sterilt vand i en 50 mL konisk slange.
- Afpipetteres 4-5 mL af kollagen i hver ren P100 kultur parabol, at sikre hele overfladen er dækket.
- Dække retter med låg og inkuberes natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Biosikkerhed kabinet, Fjern alle parabol låg. Swirl løsning til at dække fad, så Aspirér.
- Sterilisere ved udsættelse for ultraviolet (UV) lys for 1 h. sted låg tilbage på retterne, stak og dække retter med aluminiumsfolie.
- Butik belagt retter ved 4 ° C i 3-6 måneder, re sterilisering under UV-lys 15-30 min før celle kultur brug.
- 24 timer før at have fået en HNE prøve, sterilisere en præ-coatede parabol og etiket som musen embryonale Fibroblast (MEF) og datoen.
- Tilføje ekspansion medier for at dække plade (ca. 5 mL) med en serologiske pipette.
- Optø et hætteglas med 2 x 106 bestrålet MEFs i et 37 ° C vandbad. Så snart MEFs er optøet, Tilsæt halvdelen af hætteglas (ca. 106 celler) til fadet med 1 mL pipette, hvirvlende i hånden for at sprede.
- Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 overnatning i forberedelse til HNE kultur.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, trin 3.7-3.10 kan udføres så sent som i 60 min før plating celler, selv natten er ideelt.
4. opnå og behandle HNE prøve
- Sikre IRB-godkendte samtykke/samtykke er opnået for alle fag.
- Har patienten slag næse at rydde løs slim.
- Visualisere ringere turbinate, ved hjælp af en rhinoscope. Sikre, at ingen læsioner eller polypper er gave, som kan være til hinder prøvetagning.
-
Indsamle nasal celler fra den første næsebor af curettage eller børstning.
- Curettage: Bøje curette på dens midtpunkt til at skabe en lille, ~ 135° vinkel med apex fra curette cup. Indsæt curette i næsebor og fremme curette cup under ringere turbinate. Forsigtigt Tryk på curette cup mod ringere turbinate og skrabe den turbinate ved at trække curette fremad, gentaget 3 - 4 gange i alt.
- Brush: Pass cytologi børste under ringere turbinate, derefter rotere og flytte pensel og-ud lidt 4 - 5 gange, uden at afslutte næsebor.
- Sted curette/pensel i en 15 mL konisk fyldt med antibiotika medier. Gentag trin 4.3-4.4 for det andet næsebor, placere curette/børste i den samme koniske rør.
- Gemme konisk på is indtil klar til behandling. Sikre, at behandlingen sker inden for 4 h af prøven erhvervelse men kan opstå så sent som i 24 timer efter erhvervelse, hvis nødvendigt.
5. processen og udvide HNE celler i retter
Bemærk: Udføre alle trinene ren betingelser i biosikkerhed kabinet.
- Brug en 1 mL pipette og medier fra prøven, konisk, vaske alle celler ned af curettes/cytologi pensler i den samme koniske rør. Når rent, kassere curettes / børster.
- Der centrifugeres konisk på 360 x g og 4 ° C i 5 min.
- Aspirat supernatanten, pas på ikke for at forstyrre den celle pellet.
- Genopslæmmes celle pellet i 3 mL af celle detachement løsning, når der afpipetteres med en 1 mL tip til at homogenisere blandingen.
- Der centrifugeres konisk på 360 x g og 4 ° C i 5 min.
- Gentag trin 5.3-5.5 én gang.
- Opsug resterende supernatanten, pas på ikke for at forstyrre den celle pellet.
- Genopslæmmes pellet i 1 mL af antibiotika medier og tælle celler med en hemocytometer.
- Brug 1 mL pipette, plade celler dråbevis på overtrukket, fibroblast-seedede fadet forberedt i trin 3.10. Tilføje antibiotika medie der skal fuldt ud dække skålen og sprede cellerne hen over overfladen. Etiket parabol med indhold og dato og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 48 h, sikre at cellerne er knyttet til fadet, kultur. Opsug mediet og erstatte med nok friske antibiotika medier til at dække pladen.
- Ændre media 3 x ugentligt, sugning gamle medier med en vakuum linje og Pasteur pipette, og erstatter med nok friske medier til at dække pladen. Efter 5 dage på antibiotika medier, skal du ændre medierne til ekspansion medier, fortsætter med at erstatte tre gange ugentlig.
Bemærk: Forurening risikoen er høj i den første uge af kultur. Hold friske prøver i en separat inkubator til at minimere risikoen for krydskontaminering. - Kontrollere cellevækst flere gange ugentligt. Når celler er ca 70-80% sammenflydende, fortsætte med at passage celler.
6. passage HNE celler
-
Forberede 0,1% Trypsin løsning i ethylendiamintetra syre (EDTA).
Bemærk: Vær forsigtig håndtering trypsin, som er en hud, luftveje, og øjet irriterende.- Veje 15 mg af trypsin fra svin bugspytkirtlen i en konisk slange.
- Veje 56 mg EDTA i et separat koniske rør.
- I biosikkerhed kabinet, overføre trypsin og EDTA i en autoklaveres 250 mL glasflaske. Bruge en lille alikvot af sterile fosfatbufferet saltopløsning (PBS) for at skylle trypsin/EDTA-rør for at sikre komplet overførsel.
- Tilføje steril PBS for at bringe den samlede løsning til 150 mL. Luk låget stramt.
- Inkuber trypsin løsning i et 37 ° C vandbad indtil helt opløst. Tjekke hver 15 min og fjern straks når opløst.
Bemærk: Må ikke være umarkeret for længere perioder (f.eks. natten) som trypsin i løsning vil denaturere hvis opvarmes i for lang tid. - Rengør flasken med 2-3 sprøjter af 70% ethanol og vende tilbage til biosikkerhed kabinet.
- Filtrer 0,1% Trypsin-EDTA-oploesning til en ny, sterile 250 mL, 0,22 µm PES sugekolbe ved hjælp af producentens anvisninger og anmærke med indhold og dato.
- Gemme trypsin-EDTA-oploesning ved 4 ° C i op til en måned, udsmid hvis overskyet.
- Bringe differentiering medier, 0,1% Trypsin-EDTA-oploesning og steril PBS til stuetemperatur over 30 min. Rens med 70% ethanol og overførsel til en ren biosikkerhed kabinet.
- I biosikkerhed kabinet, skal du bruge en vakuum linje og Pasteur pipette til Aspirér og kassér medier fra vævskultur parabol. Vask skålen ved at tilføje, hvirvlende og sugning 5 mL PBS ved hjælp af en ren serologisk pipette.
- Bruger en serologisk afpipetteres 5 mL, tilsættes 5 mL af 0,1% Trypsin-EDTA-oploesning til fadet, vævskultur og vende tilbage til inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 min.
- Visualisere celler på en inverteret mikroskop på 4-10 X. Check at cellerne løsnes fra fadet, blive runde og flyde. Tryk forsigtigt på siden af kultur parabol til dislodge celler, og/eller re inkuberes i en yderligere 5 min, indtil de fleste celler er frakoblet.
Bemærk: Tag forsigtighed til hurtigt at fjerne celler når løsrevet fra kultur fadet; langvarig udsættelse for 0,1% Trypsin-EDTA vil forringe cellernes levedygtighed. - Ved hjælp af 10 mL serologisk pipette, tilsættes 5 mL af ekspansion medier til fadet og indsamle alle flydende indholdet (10 mL total) i en mærket, sterile 50 mL konisk slange.
-
Hvis celler forbliver vedhængende til fadet, kultur, Gentag trin 6,4 gennem 6.6 til to gange, indsamle indholdet i den samme koniske rør.
- Hvis celler forbliver vedhængende til fadet, kultur efter tre runder af Trypsin løsning eksponering, bruge en steril celle skraber forsigtigt fjerne resten. Efter skrabning parabol, vaske skraberen og parabol med 5 mL af ekspansion medier og indsamle i den samme mærket koniske rør.
Bemærk: Hvis passaging til spheroids, ændre denne fremgangsmåde for at udføre en differentieret trypsinization. Efter tilsætning af trypsin løsning (trin 6.4.), tjekke skålen ofte indtil fibroblaster har løsrevet (typisk 1-2 min.), forlader kun polygonale epitel celler knyttet til fadet. Indsamle og afsætte dette supernatanten, som kan være passaged frem for ekspansion. Gentag trin 6.4-6.6 ved hjælp af den samme trypsin løsning, og indsamler kun de resterende epitelceller for klumpformet kultur.
- Hvis celler forbliver vedhængende til fadet, kultur efter tre runder af Trypsin løsning eksponering, bruge en steril celle skraber forsigtigt fjerne resten. Efter skrabning parabol, vaske skraberen og parabol med 5 mL af ekspansion medier og indsamle i den samme mærket koniske rør.
- Der centrifugeres konisk på 360 x g til 5 min og 4 ° C. Opsug medier fra konisk.
- Resuspend celle pellet i 1 mL af ekspansion medier og tælle celler ved hjælp af en hemacytometer.
- Når kvantificeret, celler kan opdeles, hvis det er nødvendigt og enten passaged frem på en ny kultur fad (herunder forberedelse af fibroblast Co kultur, trin 3, og plating celler for ekspansion, trin 5.9-5.12) eller kulturperler som spheroids (trin 7).
Bemærk: Hvis passaging til en ny kultur parabol for ekspansion, en seeding tæthed af 0,5-1 × 106 celler i en P100 parabol er anbefalet.
7. seeding celler til HNE klumpformet kulturer
Bemærk: Gennemføre alle procedurerne i dette trin, end centrifugering, i en ren biosikkerhed kabinet.
- Tø basalmembranen matrix på is pr fabrikantens anvisninger (100 µL pr. klumpformet godt).
Bemærk: Overveje at gøre steril 500 µL delprøver af matrixen basalmembranen modtagelse; Dette beløb vil frø en enkelt 4-godt plade. - Adskille et passende antal varierende trypsinized, passaged celler (fra trin 6,9) til en slutkoncentration på 500.000 celler pr. mL af matrixen. For en 4-godt plade, bruge 200.000 celler. Indsamle i en 1,5 mL tube.
- Centrifugeres celle og medier blanding ved 360 x g i 5 min. ved 4 ° C. Helt, men omhyggeligt Aspirér og kassér medier ved hjælp af 1 mL pipette, pas på ikke for at forstyrre den celle pellet.
- Brug en 1 mL pipette tip, tilføje 100 µL pr. planlagt godt af matrixen basalmembranen til 1,5 mL tube med cellerne. Hold røret på is.
- Pipetteres op og ned til omhyggeligt og grundigt resuspend celler i matrixen basalmembranen. Bevæge sig hurtigt at undgå solidificering af matrixen. Undgå fuldstændig tømning pipette tip at sikre luftbobler ikke er indført i matrixcelle/mix.
-
Seed 100 µL matrix delprøver i hver brønd med en 4-godt IVF kultur plade.
- Med en ren saks, trim off den distale 3-4 mm af en 200 µL pipette tip.
- Bruger den trimmede spids, omhyggeligt afpipetteres 100 µL af celle/matrix blanding i midten af hver brønd. Tilsæt langsomt, med mål at gøre en enkelt matrix "drop" i midten af hver brønd. Drop bør forblive sfærisk, og bør ikke røre siderne af brønden. Når du flytter pladen, gør så omhyggeligt at undgå at forstyrre disse dråber.
- Inkuber basalmembranen matrix dråber på 37 ° C og 5% CO2 i 30 min, indtil solid.
- Omhyggeligt afpipetteres 500 µL af differentiering medier i hver brønd, pas på ikke for at forstyrre matrix dråbe. Sikre, at media bare dække matrix drop og tilføje flere hvis nødvendigt.
8. differentiere og modne HNE Spheroids
- Bruger en 1 mL pipette tip, forsigtigt Aspirér alle medier fra godt; undgå sugning matrix, som vil ødelægge spheroids i del af matrixen, selvom enhver spheroids efterladt kan forblive levedygtigt.
- Ved hjælp af en frisk 1 mL pipette tip, forsigtigt tilføje 500 µL af differentiering medier til godt omkring matrix. Ikke røre matrix med en pipette og undgå at forstyrre matrix drop.
- Returnere spheroids inkubator på 37 oC og 5% CO2 for vedholdende vækst. Gentag trin 8,1 gennem 8.3 tre gange ugentlig.
- Evaluere klumpformet morfologi dagligt under en inverteret mikroskop på 20 X. Spheroids bør danne inden for 3-5 dage i yderklædningen og bliver kønsmodne efter ca 10 dage.
9. forbehandle, stimulere og Image HNE Spheroids for analyse
- Forbehandle spheroids som ønskede før imaging som tidligere beskrevet30.
Bemærk: For VX809 forbehandling, tilføje 3 µM af VX809 til mediet i 48-72 timer før billeddannelse. Bland 1 µL af 10 mM VX809 lager (Se Materialer tabel) i 3.3 mL af medier til denne koncentration. - Ændre hver godt af spheroids til 1 mL frisk differentiering medier, herunder forbehandling (trin 8,1-8.3) før imaging spheroids.
- Forberede frisk stimulation narkotika løsninger (Forskolin, 3-isobutylmethacrylat-1-Methylxanthin [IBMX], VX770 og CFTR hæmmer 172 [Inh172]) fra bestande (Se Materialer tabel). Forskolin/IBMX, føje 1 µL af hver bestand til 98 µL sterilt vand i en enkelt mærket 1,5 mL tube. For VX770 og Inh172, skal du tilføje 1 µL af hver bestand til 99 µL sterilt vand i separate mærket 1,5 mL rør. Gøre en samlede volumen tillader 50 µL af løsning til hver godt testet. Forberede løsninger under sterile forhold i biosikkerhed kabinet.
- Overføre klumpformet plade til en rugede kammer sat til 37 ° C og 5% CO2, monteret på en inverteret mikroskop udstyret med elektronisk billed fange programmel og en mekanisk scenen for XY justering. Tænde mikroskopet og kamera, samt den billeddiagnostiske computer.
-
Fange baseline billeder af spheroids i en brønd.
- Åbne image capture software (Slidebook 5,5 til anvisningerne nedenfor). Når initialiseres, skal du åbne en ny fil ved at klikke på "File" og derefter "Ny". Navngiv filen i overensstemmelse hermed, og klik på "Gem".
- Forsigtigt fjerne kultur plade låg og centrere en matrix dråbe over målet.
- Startende fra toppen af matrix drop, flytte i et gitter til finde spheroids ved 20 x forstørrelse med mikroskop okularet. Fokusere op og ned for at fange sfære på sit bredeste sted. Anmærke placeringen af hver klumpformet på et kort over matrix drop identificerer igen efter billeddannelse.
- Klik på "Billedoptagelse" i softwaren. For eksponering, Vælg "Manual" og Indtast 50 ms. sikre andre indstillinger er passende (Bin faktor: 1 x 1, W: 512, H: 512, X og Y forskydning: 0). Skriv et passende navn for hvert billede i feltet "Navn" (fx klumpformet 1 Baseline). Klik på "Start" for at se en levende billede, og "Gem" for at fange en baseline billede.
- Gentag trin 9.5.1-9.5.4 indtil mål nummer er nået, eller hele matrix drop er afbildet.
NOTE: Gruppe forskelle kan registreres med så få som 3-5 spheroids pr. betingelse, men det er blevet vores praksis til billede 10 eller flere spheroids pr. betingelse at øge magt. Variation af analysen er vist i figur 2 i afsnittet "Repræsentant resultater" med prøver af 8-10 spheroids per emne som et eksempel.
-
Stimulere spheroids.
- Bruger en 200 µL pipette, tilføje 50 µL af passende stimulation stof i medierne i brønden, pas på ikke for at forstyrre matrixen.
Bemærk: Efter denne 10-fold fortynding (50 µL til 500 µL af medier), bliver den endelige drug koncentration: forskolin 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM. - CAMP kun, tilføje eneste forskolin/IBMX.
- For cAMP + VX770, tilføje forskolin/IBMX først, derefter VX770 efter 2 min.
- For hæmmet betingelser, tilføje Inh172 første, derefter forskolin/IBMX efter 2 min.
- Bruger en 200 µL pipette, tilføje 50 µL af passende stimulation stof i medierne i brønden, pas på ikke for at forstyrre matrixen.
- Umiddelbart efter stimulation, overvåge klumpformet hævelse af timelapse tænkelig nemlig 1 h. Klik på "Billedoptagelse" i softwaren. Klik på "Timelapse", og Angiv intervallet 30 s, med en varighed af 60 min. Skriv et passende navn og klik på "Gem" for at starte timelapse.
Bemærk: Standard timelapse er at fange billeder af en enkelt klumpformet hver 30 s til at sikre en høj kvalitet video. Alternativt kan du udføre lavere forstørrelse erobringen af hele brønden (f.eks. 4 X), og færre billeder taget hvis det ønskes. Hvis et automatiseret Stadium bruges, udføre timelapse af alle spheroids ved hjælp af foruddefinerede koordinater; ellers bruger timelapse af en delmængde af spheroids for at foretage en kvalitativ gennemgang af hævelse og for at sikre ingen systematiske problemer opstår under imaging (f.eks. matrix løsrivelse fra brønden). -
Straks efter afslutningen af 1 h timelapse billede, fange efter stimulation billeder af alle spheroids (pr. trin 9.5) ved hjælp af kort skabt taktfast 9.5.3.
- Henvise til pre stimulation billeder til at sikre det samme planet for fokus bruges til opfølgende billeder (focal kvaliteten af omkringliggende celler, spheroids eller vragrester høj grad lette denne proces).
- Gem filer med en parret anmærkning fra trin 9.5.4 (fx klumpformet 1 efter Stimulation).
Bemærk: fuldføre dette trin umiddelbart efter timelapse, som spheroids kan fortsætte til at svulme.
- Erstatte medier i den afbildede godt med frisk differentiering medier.
- Gentag trin 9.5 gennem 9,9 til hver brønd/tilstand, justere stimulation narkotika, som er angivet for forsøgsbetingelser.
- Når alle billedbehandling er afsluttet, returnere spheroids til inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
Bemærk: Afhængigt af sterilitet rugede mikroskop kammer, kan efter stimulation kontaminering af spheroids være ganske almindelige. Enten holde afbildet spheroids i en separat incubator, at minimere risiko for krydskontaminering, eller kassere spheroids umiddelbart efter billeddannelse.
10. analysere HNE klumpformet billeder
- Eksportere alle optagne billeder til et format kompatibelt med billede analyse software. I softwaren, klik på "View", hover over "Eksport", og vælg "Standard visninger af alle billeder som TIFF...". Gemme på harddisken eller et flashdrev for analyse.
Bemærk: en kommerciel analyse software (Table of Materials) og .tiff-filer fungerer godt og er beskrevet her, selvom analyse kan også udføres ved hjælp af andre platforme. Når du navngiver filer, bør personalet analysere billeder, blindet til de eksperimentelle betingelser, men klar over hvilke billeder er parret (før og efter stimulation) for at sikre tilsvarende analyse. -
Ved hjælp af analysesoftwaren, afgrænse den luminale område af hver klumpformet billede og eksportere til en data analyse software.
- Åben analyse software. Klik på "Fil", derefter "Open" og Naviger til den filmappe indeholdende klumpformet billeder. Alle billeder til analyse og klik på "Åbn".
- Klik på "Foranstaltning" og vælg "Region målinger". I dialogboksen Region målinger Vælg droptab "Konfiguration" og sikre "Image Name" og "Område" bokse er kontrollerede.
- Klik på "Log" og vælg "Åbn Data Log". Klik på "OK" på Data dialog boks og navnet på logfilen i overensstemmelse hermed (f.eks.tilstand X, dato). Dette vil overføre alle målinger til et regneark.
- Vælg "Trace Region" værktøjsknap og omhyggeligt spore lumen af klumpformet i det første billede til analyse. I regionen måling dialogboks, skal du klikke på "Log Data" for at logge måling i Excel.
- Gentag trin 10.2.2-10.2.4, indtil alle spheroids analyseres.
- Beregn procentvise ændre (100 * [Post-stim - Baseline] ÷ Baseline) i området luminale fra baseline for hver enkelte klumpformet billede par og kompilere data for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNEs bør vedhæfte til fadet, kultur og danner små øer af celler i 72 h af såning; eksempler på god og dårlig ø dannelse på én uge er vist i figur 1A og 1B, henholdsvis. Disse øer bør udvides til at dække skålen i løbet af 15-30 dage. Små eller suboptimal prøver kan tage længere tid, og ofte vil ikke give nyttige spheroids. Kontamination med infektiøse agenser fremgår af dyb gul/overskyet medier, manglende cellerne til at vedhæfte til fadet, kultur, og/eller direkte visualisering af svampe/bakterier. Enhver forurenet kulturer bør kasseres straks for at undgå krydskontaminering.
Inden for de første 3-4 dage af kultur i matrixen basalmembranen, bør små cystisk strukturer begynder at danne i matrixen. Disse vil modnes i ca 10 dage til intakt spheroids demonstrere en tynd væg og en luminale overflade. Hvis belagt på den beskrevne tæthed, vil succesfulde kulturer indeholde 50-100 spheroids pr. matrix drop. Lumen kan være relativt klart (figur 1 c) eller fyldt med celleaffald og slim (fig. 1 d); førstnævnte er mere almindelige i spheroids med vildtype CFTR (wtCFTR), og sidstnævnte i CF spheroids. Maskering for at afgrænse området luminale i spheroids i figur 1 c og 1 D er vist i figur 1E og 1F, henholdsvis. Eksempler på dårligt dannet/mislykket klumpformet kulturer er angivet i figur 1 g og 1 H.
Repræsentative funktionelle data for vildtype og F508del CFTR homozygot HNE spheroids er vist i figur 2A og 2B, henholdsvis; disse data er repræsentative for > 10 unikke HNE prøver i vildtype og F508del CFTR homozygot fag30. Kort sagt, spheroids med funktionelle CFTR svulme, mens dem med dysfunktionelle CFTR svulme betydeligt mindre, eller kan skrumpe. Specifikt, spheroids fra fag med wtCFTR skal svulme over en time når stimuleret, og skal svulme mindre eller formindske hvis stimuleret i overværelse af CFTR hæmmer Inh172. Omvendt, spheroids fra et emne, der er homozygot for F508del CFTR bør enten krybe eller svulme meget lidt med øget hævelse (eller mindre skrumpende) når farmakologisk korrigeret med CFTR modulatorer, VX809 og VX770. Tidligere analyser af klumpformet pålidelighed både inden for og mellem fag af den samme genotype påvise funktionelle adskillelse af CFTR genotyper og beskeden variation i gentagne foranstaltninger30.
| Media komponent | Stamopløsningen | Beløb | Opbevaring |
| Ekspansion medier | |||
| DMEM / F-12 næringsstof blanding "Base medier" | Brug som er | 2 x 500 mL beholdere | Opbevares ved 4 ° c indtil udløbsdatoen for producenten |
| Føtal bovint Serum | Brug som er | 50 mL | Opbevares ved-20 ° c op til producenten udløbsdato |
| Kolera toksin | 10 mg i 1 mL sterilt vand | 1 ΜL | Gemme lager ved-20 ° c op til seks måneder |
| Epidermal vækstfaktor | 500 µg i 1 mL sterilt vand | 20 ΜL | Gemme lager ved-20 ° c op til seks måneder |
| Hydrocortison | 0,4 mg i 400 µL sterilt vand | Hele 400 µL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Butik pulver ved stuetemperatur indtil udløbsdatoen for producenten |
| Adenin | 24 mg i 1 mL sterilt vand | Hele 1 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Butik pulver ved stuetemperatur indtil udløbsdatoen for producenten |
| Y-27632 | 3,2 mg i 1 mL sterilt vand | Hele 1 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver ved-20 ºC til fabrikanten udløbsdato |
| Antibiotika medier | |||
| Amphotericin B | Brug som er | 1,2 mL | Opbevares ved 4 ° c indtil udløbsdatoen for producenten |
| Ceftazidime | 15 mg i 1 mL sterilt vand | Hele 1 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver ved-20 ºC til fabrikanten udløbsdato |
| Tobramycin | 15 mg i 1 mL sterilt vand | Hele 1 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver ved-20 ºC til fabrikanten udløbsdato |
| Vancomycin | 15 mg i 1 mL sterilt vand | Hele 1 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver ved-20 ºC til fabrikanten udløbsdato |
Tabel 1: Komponenter af ekspansion og antibiotika medier.
| Media komponent | Stamopløsningen | Beløb | Opbevaring |
| DMEM / F-12 næringsstof blanding "Base medier" | Brug som er | 2 x 500 mL beholdere | Opbevares ved 4 ° c indtil udløbsdatoen for producenten |
| Ultroser-G | 20 mL sterilt vand i en enkelt, 20 mL flaske frysetørret Ultroser-G | Hele 20 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver på 4 ºC op til producenten udløbsdato |
| Føtal klon II | Brug som er | 20 mL | Opbevares ved-20 ° c op til producenten udløbsdato |
| Pen Strep | Brug som er | 10 mL | Opbevares ved-20 ° c op til producenten udløbsdato |
| Kvæg hjernen ekstrakt | Brug som er | 2,48 mL | Opbevares ved-20 ° c op til producenten udløbsdato |
| Transferrin | Brug som er | 250 ΜL | Opbevares ved-20 ° c op til producenten udløbsdato |
| Insulin | Brug som er | 250 ΜL | Opbevares ved-20 ° c op til producenten udløbsdato |
| Ethanolamin | Brug som er | 15 ΜL | Opbevares ved stuetemperatur indtil udløbsdatoen for producenten |
| Adrenalin | 2,75 mg i 1 ml sterilt vand | Hele 1 mL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver på 4 ºC op til producenten udløbsdato |
| Triiodothyronin | 8,4 mg i 50 µL af DMSO | Hele 50 µL alikvot | Gøre friske med hver enkelt batch. Gemme pulver ved-20 ºC til fabrikanten udløbsdato |
| Hydrocortison | 7.24 mg i 1 mL ethanol | 1 ΜL | Gemme lager ved-20 ° c op til seks måneder |
| Phsophoryletheanolamine | 35.25 mg i 1 mL sterilt vand | 1 ΜL | Gemme lager ved-20 ° c op til seks måneder |
| Retinsyre | 3 mg i 1 mL af DMSO | 1 ΜL | Gemme lager ved-20 ° c op til seks måneder |
Tabel 2: Komponenter af differentiering Medium.
Figur 1 : HNE ekspansion og strukturelle karakteristika af HNE Spheroids. Brightfield billeder af HNE ekspansion kulturer taget syv dage efter plating demonstrere vellykket (hvid pil, bedømmelseskomite A) og forgæves (panel B) HNE koloni dannelse på en feeder fibroblast baggrund. Vellykket wtCFTR og F508del homozygot spheroids er vist i paneler C og D, henholdsvis. Maskering for at afgrænse området luminale i spheroids fra C/D er fastsat i paneler E og F, henholdsvis. Mislykket klumpformet kulturer er karakteriseret ved små, uorganiseret celleaffald (panel G) og/eller uorganiseret klumper af celler (panel H). Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Funktionelle kendetegn HNE Spheroids. Repræsentative funktionelle svar af wtCFTR spheroids fra en enkelt donor, når stimuleret med forskolin/IBMX med/uden tilstedeværelse af CFTR hæmmer Inh172 er vist i panelet (A) hvert punkt repræsenterer reaktion i en enkelt klumpformet. Repræsentative funktionelle svar af F508del homozygot spheroids fra en enkelt donor, når stimuleret med forskolin/IBMX med/uden tilstedeværelsen af VX809 og VX770 er vist i panelet (B). Fejllinjer = SEM. ** p < 0,01; p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver generation af patient-afledte nasal klumpformet cellekulturer stand til at producere en individualiseret, specifikke model af CFTR funktion. Der er flere vigtige skridt i den proces, der bør være nøje deltog for at undgå problemer. For det første er en god prøve erhvervelse fra patientens næse. En god prøve bør have > 50.000 celler, begrænset Slim/snavs, og være klar til forarbejdning i 4 h (selvom succes er også let opnåelige med overnatning shipping på is). Praksis erhverver prøver med curette eller børste af undersøgelse personale er nødvendigt, som er lettere ved at fokusere tidlige prøven erhvervelse i hænderne af én eller to udbydere til at maksimere deres komfort. Andet, god ren/steril teknik i alle vævskultur trin er afgørende. Den primære transportform fiasko, vores erfaring, for alle HNE kulturer er bakterie- eller svampeinfektion kontaminering, hvilket kan komplicere både den primære prøve og andre voksende kulturer i rugemaskinen. Denne risiko kun stiger med kulturer af patienter med kronisk infektion (fx, CF), derfor succes afhænger i høj grad på evnen til at holde kulturer, ren og separat. Vores praksis er at adskille en inkubator kun for smitte-udsatte kulturer inden for de første 5-7 dage, beskytte ældre, succesrige kulturer fra utilsigtet forurening. For det tredje er det vigtigt at nøje Se celler under ekspansionsfasen og undgå overconfluence. Hvis cellerne er tilladt at nå fuld sammenløbet på pladen, er der en risiko for, at kulturen vil enten blive senescent eller celler vil begynde at dø og frigøre. Endelig når plating celler som spheroids, er det vigtigt at grundigt sprede celler gennem matrixen og plade en jævnt fordelte prøve. Enten over - eller under - population af matrix dråber vil medføre kultur, og store klumper af celler vil ikke producere vellykket spheroids.
Mens gennemføre denne protokol, kan efterforskere støde nogle fælles problemer. Forurening, er som nævnt ovenfor, bedst undgås ved fremskaffelse af en god indledende prøve uden slim og ren kultur teknikker. Hvis kulturer er vellykket gennem ekspansion, men ingen differentieret kugler dannes, flere problemer kan være opstået. Hvis matrixen, vises for det meste tomme, det er mest sandsynligt, at cellerne var seedet på for lavt af densitet; øge seeding tætheden af efterfølgende forsøg af ca. 20%. Omvendt, hvis matrix synes at være "beskidt" med rigelige celle debris, er det sandsynligt, at cellerne var seedede i alt for høj densitet og efterfølgende forsøg skal bruge seeding densitet reduceres med ca. 20%. En almindelig komplikation af efter såning fodring og vedligeholdelse er udstationering af matrix fra kultur fartøj. Dette er forårsaget af alt for aggressive medier udveksling og kan undgås ved at forsigtigt og manuelt ændre medier med 1 mL pipette, ikke væggen suge. Hvis stødt, kan kugler stadig stimuleret og afbildet, selvom det kan være svært hvis matrix "svæver" i brønden under imaging, nødvendiggør forsigtige kortlægning af spheroids i brønden.
Efterforskere kan udøve flere ændringer til protokollen, afhængigt af deres lab behov. For højere opløsning billeddannelse af spheroids, har vi tidligere substitueret 4-godt plader med optiske glas muligheder, herunder 35-mm glas-bund retter eller kammer dias. Dette giver mulighed for høj opløsning, live imaging af spheroids, men kan reducere overførselshastighed. Alternativt, for at øge gennemløb, mindre delprøver af celler i en matrix kan være seedet til andre fartøjer (f.eks. 24-og kultur plader). Vores erfaring vokser spheroids bedst med matrix i en "dråbe" form i modsætning til danner et ark på bunden af brønden; som sådan, vi har haft bedst succes med dråber af mindst 25 µL. efterforskere måtte ønske at ændre tæthed af matrix ved fortynding med medier. Dette reducerer det samlede beløb af matrix nødvendigt, forbedre omkostninger af analysen. Dette kan dog også, ændre klumpformet sammensætningen. I vores tidligere erfaringer, lavere koncentrationer af basalmembranen matrix fører til ændret klumpformet struktur, med enten delvis eller komplet dannelsen af spheroids i en "celle-apex-out" morfologi. Som sådan, bør spheroids genereres via protokollen ændringer i matrix koncentration forsigtigt evalueres for morfologi før funktionelle test er forsøgt. Endelig kunne forskellige stimulerende eller hæmmende stoffer eller forskellige koncentrationer af disse stoffer, anvendes. Forskolin, IBMX og Inh172 blev valgt til vores undersøgelser på disse koncentrationer baseret på tidligere erfaringer med ALI kulturer31. Bruge andre stoffer (fx isoproterenol for stimulation, GlyH101 for hæmning) kan bedre anvende en investigator's undersøgelse. På samme måde, ved hjælp af forskellige koncentrationer af forskolin, IBMX eller Inh172 kan ændre det dynamiske område af analysen, men vi har ikke systematisk testet disse indstillinger.
I betragtning af antallet af eksisterende ex vivo patient-afledte CFTR assays, er den beskrevne model kendt for flere vigtige grunde. Først, det udnytter nasal celler som en let opnåede kilde til respiratorisk væv. HNE indkøb kan udføres sikkert med minimal træning i næsten enhver indstilling (klinik, OR, forskning besøg) i alle aldersgrupper25. Dette letter robust prøve indkøb, og Gentag prøveudtagning, hvis det er nødvendigt på grund af vækst vanskeligheder eller forurening. I forhold til tarm organoids, HNE spheroids karakteriseres mindre godt og ud til at have en mindre dynamikområde i den nuværende form, dog, brug af åndedrætsværn i stedet for GI væv kan være en vigtig fordel, som flere CF sygdom drivere (f.eks. mucociliary clearance, epithelial natrium kanalen udtryk) er ikke tilsvarende i tarmen. I modsætning til plane, ALI kulturer af HNE celler, spheroids er vokset hurtigere og kan være mere repræsentativ for i vivo betingelser, måling en fysiologisk proces (væske homøostase), der kan være mere relevant end Elektrofysiologi alene32. Ved at forbedre tid fra prøven indkøb til afprøvning, reduceres forurening potentielle, derfor øge sandsynligheden for kultur succes. Endelig, den 3-dimensionelle karakter af modellen kan være modtagelig til roman og/eller supplerende linjer af forskning i luftvejene udvikling eller morfologi, der ikke er muligt i ALI kulturer (fx, luminale Slim tracking, hurtige undersøgelser af differentiering, osv).
Der er flere centrale begrænsninger HNE spheroids som en analyse af CFTR funktion. Første, denne assay forbliver relativt lav-overførselshastighed. Ved hjælp af de nuværende metoder, billede erhvervelse tager over en time for hver kultur betingelse, og analysen tager en yderligere 20-30 min. pr. betingelse. Dette forværres af graden af overlap mellem visse betingelser (som vist i figur 2A), som kræver et større antal målinger (denne overlapning i sig selv kan også udgøre en begrænsning af følsomheden af denne analyse). Som sådan kræver en enkelt eksperiment med 4-6 betingelser næsten to dage for færdiggørelse. Overførselshastighed kan forbedres ved at ansætte automatiseret billedoptagelse og analysemetoder; sådanne tilpasninger er i øjeblikket i gang. For det andet, denne model kræver en stor mængde af matrix, som kan blive dyrt. Som nævnt ovenfor, fortynding af matrix kan hjælpe med at overvinde denne barriere, men skal tages med forsigtighed, som ændringer i vækst matrix vil sandsynligvis resultere i ændringer i klumpformet morfologi. Tredje, denne model er baseret på klumpformet målinger i et XY-plan kun, og ignorerer hævelse i Z-plan, som kan indføre bias. Mens tidligere reproducerbarhed analyser har været beroligende, kunne denne mangel overvindes ved hjælp af automatiseret billedbehandling med Z-flyet scanning for at beregne volumen30. Endelig, og vigtigst, er omfattende arbejde med at binde klumpformet svar til det individuelle emne i vivo drug svar endnu skal udfyldes. I fraværet af denne sammenhæng er den prædiktive værdi af model - mens man lover - uklart.
Generation og analyse af HNE spheroids mulighed for ex vivo analyse af enkelte CFTR aktivitet og graduering, som i sidste ende kan være nyttige som en præ-klinisk model af narkotika svar. Derudover kan givet den omfattende variation i CF sygdommens sværhedsgrad, sådan en individualiseret model give indsigt i et emne unikke luftvejene mikromiljø. På denne måde, kan sådan en model være nyttige for studier af bredere CFTR biologi og støtte i at forstå sygdom heterogenitet. Fremtidig brug af denne model, samt andre lignende modeller af individualiserede CFTR funktion, holder løftet til bedre at forstå CFTR biologi i laboratoriet og til at drive, personificeret og præcision medicin i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af cystisk fibrose Foundation Therapeutics, giver CLANCY14XX0, og gennem cystisk fibrose Foundation, tildele nummeret CLANCY15R0. Forfatterne vil gerne takke Kristina Ray for hendes hjælp i patient rekruttering og myndighedstilsyn. Forfatterne også ønsker at takke arbejdsgruppen HNE, støttet af cystisk fibrose Foundation, der har bistået i generation af HNE kultur kapaciteter: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon og Katherine Tuggle.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
References
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
- Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
- CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
- Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
- Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
- Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
- van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
- Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
- Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
- Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
- Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
- Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
- Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).
