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Medicine

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Hier beschreiben wir eine Methode um dreidimensionale Sphäroid Kulturen der menschlichen nasalen Epithelzellen zu generieren. Sphäroide werden dann Laufwerk Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) stimuliert-abhängigen Ion und Fluid-Sekretion, Quantifizierung der Änderung der Sphäroid luminalen Größe als Proxy für CFTR-Funktion.

Abstract

Während die Einführung Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) Modulator Arzneimittel Pflege bei zystischer Fibrose (CF) revolutioniert hat, hat das unter der Regie von Genotyp Therapie-Modell derzeit im Einsatz mehrere Einschränkungen. Erste, seltene oder erforschten Mutation Gruppen sind vom endgültigen klinischen Studien ausgeschlossen. Darüber hinaus als zusätzliche Modulator Medikamente auf den Markt kommen, wird es der Modulator-Möglichkeiten für ein individuelles Thema optimieren schwieriger. Diese beiden Probleme richten sich mit dem Einsatz von Patienten abgeleitet, individuelle vorklinische Modellsysteme der CFTR-Funktion und Modulation. Menschlichen nasale Epithelzellen (HNEs) sind eine leicht zugängliche Quelle für Atemwege Gewebe für ein solches Modell. Hier beschreiben wir die Generation eines dreidimensionalen Sphäroid-Modells von CFTR-Funktion und Modulation mit primären HNEs. HNEs sind isoliert von Themen in einem minimal-invasiven Mode, bedingte Neuprogrammierung Bedingungen ausgebaut und in die Kultur der Sphäroid ausgesät. Innerhalb von 2 Wochen nach der Aussaat Sphäroid Kulturen erzeugen HNE Sphäroide, die mit 3', 5'-zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) gefördert werden können-Generierung von Agonisten CFTR-Funktion zu aktivieren. Sphäroid Schwellung wird dann als Proxy CFTR-Aktivität quantifiziert. HNE Sphäroide profitieren Sie von der minimal-invasiven noch Atemwege Ursprung der nasale Zellen um eine zugängliche, personalisierte Modell auf ein Epithel reflektieren Krankheit Morbidität und Mortalität zu erzeugen. Im Vergleich zu den Air-Liquid-Schnittstelle HNE Kulturen, sind Sphäroide relativ schnell zu Reifen, wodurch die Gesamtrate der Kontamination. In seiner jetzigen Form wird das Modell durch niedrigen Durchsatz begrenzt, obwohl dies durch die relative Leichtigkeit der Gewebe Erwerb ausgeglichen. HNE Sphäroide können verwendet werden, um zuverlässig zu quantifizieren und zu charakterisieren, CFTR-Aktivität auf der individuellen Ebene. Eine laufende Studie, binden diese Quantifizierung in Vivo Medikament Antwort bestimmt, ob HNE Sphäroide sind eine wahre präklinischen Prädiktor für die geduldige Beantwortung CFTR-Modulation.

Introduction

Cystische Fibrose (CF) ist eine fatale, autosomal rezessive Erkrankung, die mehr als 70.000 Menschen weltweit1. Diese lebensverkürzende genetische Krankheit verursacht durch Mutationen in der Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Protein (CFTR)2. CFTR ist Mitglied der Adenosintriphosphat-bindende Kassette Familie und Funktionen als einen Ionenkanal, so dass Bewegung von Chlorid und Bikarbonat über den apikalen Membranen mehrere polarisierte Epithelien einschließlich Magen-Darm-Trakt, Schweißdrüsen, und der Atemwege Baum, unter anderem3,4. Als solche führt dysfunktionalen CFTR zu multisystemischen epitheliale Dysfunktion, mit den meisten Sterblichkeit infolge der Erkrankung der Atemwege-1. In der CF-Lunge, Verlust von CFTR-driven Atemwege Oberfläche flüssig (ASL) Regulierung und Schleim Freisetzung führt zu verdickten Schleim, Atemwegsobstruktion, chronische Infektion und progressive Atemwege Umbau und der Lunge Funktion1,5.

Trotz der Identifizierung der CFTR-Dysfunktion als Ursache der Krankheit Therapien in CF traditionsgemäß auf Milderung der Symptome (z.B., Pankreas-Enzym-Ersatz-Therapie, Atemwege Abstand Therapien)1konzentriert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem durch das Aufkommen neuer Therapeutika, genannt "CFTR-Modulatoren,", die auf direkt dysfunktionalen CFTR revolutioniert. Dieser Ansatz hat verlagerte sich die klinischen Landschaft von Symptom-Management, Disease modifying Pflege aber trägt mehrere Einschränkungen6,7,8,9,10. Modulator-Aktivität ist spezifisch für die Protein-Mangel begleiten jede CFTR-Mutation und beschränkt sich auf genetische Populationen11wählen. Diese Einschränkung wird durch die Heterogenität der Protein-Mängel, sondern auch durch die Unmöglichkeit von klinischen Studien in seltenen Mutation Gruppen Gefahren. Darüber hinaus gibt es unter Patienten mit gut untersuchte Genotypen (z.B.F508del/F508del CFTR die häufigsten CFTR-Mutation), große Variabilität in Krankheit Belastung und Modulator Antwort6,7,8 ,9,11.

Um diese beiden Probleme zu überwinden, haben die Ermittler die Verwendung von personalisierten Modelle für präklinische Tests12vorgeschlagen. Dieses Konzept nutzt Patienten-spezifischen Gewebe erzeugen eine individualisierte ex Vivo -Modell-System für zusammengesetzte testen, Vorhersage in Vivo Thema Antwort auf Therapien auf individuelle Weise. Nach der Validierung, könnte ein solches Modell von Ärzten zu Laufwerk Präzision Therapie unabhängig von der zugrunde liegenden CFTR-Genotyp des Patienten verwendet werden.

Menschlichen Bronchien (HBE) Epithelzellen Explant Gewebe entnommen, zum Zeitpunkt der Lungentransplantation etabliert die Möglichkeit eines solchen Modells für CF13,14. HBEs angebaut an ein Air-Liquid-Schnittstelle (ALI) ermöglichen funktionelle CFTR-Quantifizierung direkt durch elektrophysiologische Tests oder indirekt durch Maßnahmen der ASL Homöostase13,15. Dieses Modell ist für das Verständnis von CFTR-Biologie kritisch gewesen und war ein Schlüsselfaktor bei der Entwicklung von CFTR-Modulatoren16. HBE-Modelle sind leider nicht haltbar als personalisierte Modell durch die invasive Art des Erwerbs (Lungen-Transplantation oder bronchiale Bürsten) und Mangel an Proben für Menschen mit seltenen Mutationen oder mildem Krankheitsverlauf. Im Gegensatz dazu Darmgewebe, rektale oder Zwölffingerdarm Gewebeproben entnommen Darm Strommessung (ICM) oder eine Schwellung-basierte organoide Assay einsetzbar für individualisierte CFTR-Funktion17,18, zu studieren 19. organoide Assays, insbesondere sind sehr sensible Modelle von CFTR-Aktivität20,21,22. Beide Modelle sind durch die Gewebe-Quelle (Darmgewebe, während die meisten Krankheit Pathologie Atemwege ist) und die semi-invasive Methode der Erwerb begrenzt. Alternativ haben einige Forscher menschliche Nase (HNE) Epithelzellen, Modell CFTR Restaurierung23,24,25untersucht. HNEs mit Pinsel oder Kürettage bei Patienten jeden Alters sicher geerntet werden kann und wenn ALI, kultiviert rekapitulieren viele Merkmale des HBEs25,26,27,28. HNE Monolayer-Kulturen haben traditionell durch Plattenepithel Transformation und lange Reife29begrenzt. Darüber hinaus berichtet Kurzschluss Strommessungen im HNEs sind kleiner als die in HBEs, was auf ein kleineres Fenster um therapeutische Wirksamkeit25zu erkennen.

Angesichts der Notwendigkeit für eine persönliche, nicht-invasive, Atemwege Gewebekultur-Modell des CFTR-Funktion, haben wir versucht, die Empfindlichkeit eines Schwellung basierende organoide Assays mit nicht-invasiv und Atemwege Artder HNEs zusammenführen. Hier beschreiben wir unsere Methode 3-dimensionale "Sphäroid" Kulturen der HNEs für individualisierte CFTR-Studie in einer Schwellung basierende Assays30zu erzeugen. HNE Sphäroide polarisieren zuverlässig mit der epithelialen Spitze in Richtung Mitte der Kugel oder Lumen. Dieses Modell zahlreiche Merkmale eine geringere respiratorische Epithel rekapituliert und reift schneller als ALI Kulturen. Als eine funktionelle Assay quantifizieren HNE Sphäroide zuverlässig eine Palette von CFTR-Funktion sowie die Modulation in gut untersuchte Mutation Gruppen (z. B.F508del CFTR). Diese Schwellung basierende Assays nutzt die Ion/Salz Transporteigenschaften von CFTR, indirekt messende Flüssigkeit Zustrom in den Sphäroid, wie Wasser apikalen Salz Efflux folgt. Auf diese Weise anschwellen angeregt Sphäroide mit voll funktionsfähigen CFTR robust, während diejenigen mit dysfunktionalen CFTR weniger anschwellen oder schrumpfen. Dies wird durch Bildanalyse von Pre quantifiziert und 1 h nach Stimulation Sphäroide, luminalen Messfläche und Bestimmung der Prozent ändern. Diese Maßnahme kann dann über experimentelle Gruppen zum Bildschirm für die Droge Bioaktivität in Patienten-spezifischen Weise verglichen werden.

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Protocol

HNE Proben wurden von Probanden rekrutiert durch die Cincinnati Children Hospital Medical Center CF Research Center beschafft. Alle hier beschriebene Methoden sind durch institutionelle Review Board (IRB) des Cincinnati Children Hospital Medical Center genehmigt worden. Schriftlicher Zustimmung aus allen Fächern vor der Prüfung ermittelt.

1. bereiten Sie Expansion und Antibiotika-Medien

  1. In Tabelle 1aufgeführten Medienkomponenten zu sammeln. Tauen Sie gefrorenen Materialien bei Raumtemperatur auf und machen Sie notwendigen Stammlösungen zu, wie in Tabelle 1 unter "Expansion Medien" angegeben.
    Hinweis: Vorsicht im Umgang mit Cholera-Toxin, die bei Einnahme toxische Reaktionen, und ist eine Haut, Augen und Atemwege reizend. Machen und alle Lösungen und Medien unter sauberen Bedingungen in der Biosicherheit Kabinett zu kombinieren.
  2. Verwenden eine serologische 50-mL-Pipette, entfernen Sie und entsorgen Sie 50 mL Basis Medium (Dulbecco geändert Eagle Medium/F12) aus einem Container, für den Zusatz von anderen Materialien zu kompensieren. Gießen Sie alle base Medien per hand in eine autoklaviert 1 L Glasflasche.
  3. Mit einem serologischen 50-mL-Pipette oder 1-mL-Pipette je nach Bedarf, alle übrige Komponenten von "Expansion" Pressebereich von Tabelle 1 in die autoklaviert Glasflasche mit den Medien übertragen. Vorsichtig schwenken die Flasche von hand zu mischen.
  4. Filtermedien in einem frischen, sterilen 1 L, 0,22 µm Polyethersulfone (PES) Kolben mit den Anweisungen des Herstellers zu filtern und mit "Erweiterung Media" und Datum versehen.
  5. Bereiten Sie antibiotische Medien. Notwendigen antibiotische Stammlösungen zu machen, wie in Tabelle 1 unter "Antibiotische Medien."
    1. Mit Hilfe einer serologischen 50-mL-Pipette, 150 mL Expansion Medien zum Übertragen einer frisch 250 mL autoklaviert Glasflasche
    2. Mit einer 1-mL-Pipette, fügen Sie alle Komponenten aus "Antibiotika" Pressebereich von Tabelle 1 in die autoklaviert Glasflasche mit den Medien. Strudel von hand zu mischen, bis die Medien einheitlich in Erscheinung.
    3. Filtermedien in einem frischen, sterilen 250 mL, 0,22 µm PES Filter Kolben mit den Anweisungen des Herstellers und mit "Antibiotische Medien" und Datum versehen.
  6. Speichern Sie Medien bei 4 ° C für bis zu einem Monat, verwerfen wenn bewölkt, was auf Kontamination.

2. bereiten Sie Differenzierung Medien

  1. Sammeln Sie Media-Komponenten, die in Tabelle 2aufgeführt. Tauen Sie gefrorenen Materialien bei Raumtemperatur auf und machen Sie notwendigen Stammlösungen zu, wie in Tabelle 2angegeben.
    Hinweis: Seien Sie vorsichtig im Umgang mit Retinsäure, die eine reproduktive Toxin ist, kann sein giftig beim Verschlucken und verursacht Hautreizungen. Machen Sie, aliquoten, und kombinieren Sie alle Lösungen und Medien unter sauberen Bedingungen in der Biosicherheit Kabinett.
  2. Entfernen Sie und entsorgen Sie 52 mL des Mediums Basis aus einem Container, für den Zusatz von anderen Materialien zu kompensieren. Gießen Sie alle base Medien in einem autoklaviert 1 L Glasflasche.
  3. Eine serologische 25-mL-Pipette oder 1-mL-Pipette je nach Bedarf, alle übrige Komponenten aus Tabelle 2 zur autoklaviert Glasflasche mit den Medien zu übertragen und Wirbel sanft mit der Hand zu mischen.
  4. Filtermedien in einem frischen, sterilen 1 L, 0,22 µm Polyethersulfone (PES) Kolben mit den Anweisungen des Herstellers zu filtern und mit "Differenzierung Media" und Datum versehen.
  5. Speichern Sie Medien bei 4 ° C für bis zu einem Monat, verwerfen wenn bewölkt, was auf Kontamination.

3. Mantel Kultur Speisen und Teller Feeder Fibroblasten

Hinweis: Führen Sie alle Schritte unter sauberen Bedingungen im Kabinett der Biosicherheit.

  1. Mischen Sie 0,5 mL der Kollagen und 37,5 mL steriles Wasser in einem 50 mL konische Röhrchen.
  2. Pipette 4-5 mL Kollagen-Lösung in jedem sauberen P100 Kulturschale, sicherzustellen, dass die gesamte Oberfläche bedeckt ist.
  3. Gerichte mit Deckel abdecken und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5 % CO2.
  4. Entfernen Sie in der Biosicherheit Kabinett alle Schüssel Deckel. Wirbel-Lösung, um Gericht zu decken, dann abzusaugen.
  5. Sterilisieren Sie durch Aussetzung zu Ultraviolett (UV) Licht für 1 h. Ort Deckel wieder auf den Tellern, Stack und Abdeckung Gerichte mit Aluminiumfolie.
  6. Store beschichtet Gerichte bei 4 ° C für ca. 3-6 Monate, erneute Sterilisation unter UV-Licht 15-30 min vor der Zelle Kultur Verwendung.
  7. 24 h vor der Erlangung einer Probe HNE sterilisieren eine vorbeschichtete Gericht und Label als Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) und das Datum.
  8. Fügen Sie die Expansion Medien zur Deckung die Platte (ca. 5 mL) mit einer serologischen Pipette hinzu.
  9. Ein Fläschchen mit 2 x 106 bestrahlt MEFs in einem 37 ° C Wasserbad Auftauen. Sobald die MEFs aufgetaut sind, fügen Sie die Hälfte der Flasche (ca. 106 Zellen hinzu) in die Schale mit einer 1-mL-Pipette, wirbelnden eigenhändig um zu zerstreuen.
  10. Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 Übernachtung in Vorbereitung für HNE-Kultur.
    Hinweis: Bei Bedarf Schritte 3,7-3.10 sein können ist so spät wie 60 min vor der Beschichtung Zellen durchgeführt aber über Nacht ideal.

(4) zu erhalten Sie und verarbeiten Sie HNE Probe

  1. Sicherstellen Sie, dass IRB genehmigten Zustimmung/Einwilligung für alle Fächer gewonnen wird.
  2. Haben Sie Patienten Schlag Nase, lockere Schleim zu löschen.
  3. Visualisieren Sie minderwertig Nasenmuschel mit einem Rhinoscope. Stellen Sie sicher, keine Läsionen oder Polypen vorliegen, die Entnahme von Proben ausschließen kann.
  4. Sammeln Sie nasale Zellen aus dem ersten Nasenloch durch Kürettage oder Bürsten.
    1. Kürettage: Bend Kürette in seiner Mitte, eine leichte, ~ 135° -Winkel mit der Spitze weg von der Kürette Cup zu schaffen. Legen Sie die Kürette in das Nasenloch und fördern Sie die Kürette Tasse unter der unteren Nasenmuschel. Sanft drücken die Kürette Cup gegen die untere Nasenmuschel und Kratzen der Nasenmuschel durch Ziehen der Kürette vorwärts, sich wiederholenden 3-4 mal total.
    2. Pinsel: Pass die Zytologie Pinsel unterhalb der unteren Nasenmuschel, dann drehen und bewegen Sie die Bürste-and-out leicht 4 - 5 Mal, ohne das Nasenloch zu beenden.
  5. Ort Kürette/Pinsel in einem 15 mL konisch mit Antibiotika Medien gefüllt. Wiederholen Sie die Schritte 4.3 4.4 für das andere Nasenloch, indem die Kürette/Pinsel in das gleiche konische Rohr.
  6. Speichern Sie konische auf Eis bis zur Verarbeitung bereit. Sicherstellen Sie, dass die Bearbeitung innerhalb von 4 h Probe Erwerb erfolgt sondern kann so spät wie 24 h nach Übernahme auftreten, wenn notwendig.

5. Bearbeiten Sie und erweitern Sie HNE Zellen in Gerichten

Hinweis: Führen Sie alle Schritte unter sauberen Bedingungen im Kabinett der Biosicherheit.

  1. Mit einer 1-mL-Pipette und Medien aus der Probe konisch, waschen Sie alle Zellen aus Küretten/Zytologie Bürsten in der gleichen konischem Rohr. Einmal sauber, verwerfen Küretten / Bürsten.
  2. Zentrifugieren Sie konische bei 360 x g und 4 ° C für 5 min.
  3. Aspirat überstand, kümmert sich nicht um die Zelle Pellet zu stören.
  4. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in 3 mL Zelle Ablösung Lösung, pipettieren mit 1 mL Spitze um die Mischung zu homogenisieren.
  5. Zentrifugieren Sie konische bei 360 x g und 4 ° C für 5 min.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 5,3-5,5 einmal.
  7. Aspirieren Sie verbleibende überstand, kümmert sich nicht um die Zelle Pellet zu stören.
  8. Wieder aussetzen Sie, das Pellet in 1 mL antibiotische Medien und Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer.
  9. Mit einer 1-mL-Pipette, Platte Zellen tropfenweise auf die beschichtete, Fibroblasten ausgesät Gericht in Schritt 3.10 vorbereitet. Hinzufügen von Antibiotika Medien vollständig bedecken Sie die Schüssel und die Zellen auf der Oberfläche verteilen. Gericht mit Inhalt und Datum beschriften und Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2.
  10. Sicherzustellen Sie nach 48 h, dass die Zellen in der Kulturschale befestigt sind. Aspirieren Sie die Medien, und ersetzen Sie mit genügend frische antibiotische Medien um die Platte zu decken.
  11. Wechseln Sie Medium 3 x wöchentlich, Absaugen von alten Medien eine Vakuumleitung mit Pasteurpipette, und ersetzt mit genügend frische Medien um die Platte zu decken. Nach 5 Tagen auf antibiotische Medien wechseln Sie das Medium auf Expansion Medien, weiterhin dreimal wöchentlich zu ersetzen.
    Hinweis: Kontaminationsrisiko ist hoch in der ersten Woche der Kultur. Halten Sie frische Proben in einem separaten Inkubator zur Minimierung des Risikos von Kreuzkontaminationen.
  12. Überprüfen Sie das Zellwachstum mehrmals wöchentlich. Sobald Zellen ca. 70-80 % Zusammenfluss sind, fahren Sie mit Abschnitt Zellen.

6. Durchgang HNE Zellen

  1. Bereiten Sie 0,1 % Trypsin Lösung in Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA).
    Hinweis: Vorsicht Umgang mit Trypsin, die eine Haut, Atemwege, und Auge reizend ist.
    1. Wiegen Sie 15 mg Trypsin aus der Schweine Bauchspeicheldrüse in einem konischen Rohr.
    2. Wiegen Sie 56 mg EDTA in einem separaten konische Rohr.
    3. Im Kabinett Biosafety transfer Trypsin und EDTA in einem Autoklaven 250 mL-Glasflasche. Verwenden Sie eine kleine aliquoten sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), spülen Sie die Trypsin/EDTA-Röhrchen um vollständige Übertragung zu gewährleisten.
    4. Fügen Sie sterile PBS um die Lösung insgesamt 150 mL bringen. Verschließen Sie Deckel gut.
    5. Inkubieren Sie Trypsin-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad bis vollständig aufgelöst. Überprüfen Sie alle 15 min und entfernen Sie sofort einmal aufgelöst.
      Hinweis: Lassen Sie nicht unkontrolliert über einen längeren Zeitraum hinweg (z.B. über Nacht), wie Trypsin in Lösung denaturieren werden, wenn zu lange erhitzt.
    6. Reinigen Sie Flasche mit 2-3 Sprays von 70 % Ethanol zu und wieder in die Biosicherheit Kabinett.
    7. 0,1 % Trypsin-EDTA-Lösung in einem frischen, sterilen 250 mL, 0,22 µm PES Filter Kolben mit den Anweisungen des Herstellers zu filtern und mit Inhalt und Datum beschriften.
    8. Speichern Sie Trypsin-EDTA-Lösung bei 4 ° C für bis zu einem Monat, verwerfen, wenn es bewölkt.
  2. Bringen Sie Differenzierung-Medien, 0,1 % Trypsin-EDTA Lösung und sterile PBS auf Raumtemperatur über 30 min. saubere mit 70 % Ethanol und Übertragung auf eine saubere Biosafety Schrank.
  3. Verwenden Sie in der Biosicherheit Kabinett eine Vakuumleitung Pasteurpipette Aspirieren und Medien aus Gewebekultur Gericht verwerfen. Waschen Sie die Schüssel durch Hinzufügen, Wirbeln und 5 mL PBS mit einer sauberen serologische Pipette absaugen.
  4. Mit Hilfe einer serologischen 5-mL-Pipette, Gewebe Kulturschale 5 mL Trypsin-EDTA-Lösung 0,1 % hinzu und in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 5 min zurück.
  5. Zellen auf einem inversen Mikroskop bei 4-10 X zu visualisieren. Überprüfen Sie, dass die Zellen aus der Schale lösen, runden und schweben. Klopfen Sie leicht die Seite der Kulturschale zu Zellen zu entfernen und/oder wieder eine zusätzliche 5 min inkubieren, bis die meisten Zellen gelöst werden.
    Hinweis: Vorsicht, schnell einmal losgelöst von der Kulturschale Zellen zu entfernen; längerer Exposition gegenüber 0,1 % Trypsin-EDTA beeinträchtigt Zelle Lebensfähigkeit.
  6. Mit Hilfe einer serologischen 10 mL-Pipette, die Schüssel 5 mL Expansion Medien hinzu und sammeln Sie alle flüssigen Inhalt (insgesamt 10 mL) in einem beschrifteten, steril 50 mL konische Rohr.
  7. Wenn Zellen bleiben Anhänger der Kulturschale, wiederholen Sie die Schritte 6,4 bis 6,6 bis auf zwei Mal, Sammeln von Inhalt in der gleichen konischem Rohr.
    1. Wenn Zellen bleiben Anhänger der Kulturschale nach drei Runden der Trypsin Lösung Exposition, verwenden ein sterile Zelle Schaber entfernen Sie vorsichtig den Rest. Waschen Sie nach dem Schaben der Schale den Schaber und Teller mit 5 mL der Expansion Medien und sammeln Sie sich in der gleichen beschrifteten konischem Rohr.
      Hinweis: Wenn auf Sphäroide passagierung, ändern Sie folgendermaßen vor, um eine differenzierte Trypsinization durchführen. Nach dem Hinzufügen von Trypsin Lösung (Schritt 6.4), überprüfen Sie das Gericht häufig bis Fibroblasten (in der Regel 1 – 2 min.) gelöst haben, verlassen nur polygonale Epithelzellen in der Schale befestigt. Sammeln und beiseite dies überstand, die nach vorne für die Expansion passagiert werden können. Wiederholen Sie die Schritte 6,4-6,6 mit der gleichen Trypsin-Lösung, und sammeln Sie nur die verbleibenden Epithelzellen Sphäroid Kultur zu.
  8. Zentrifugieren Sie konisch bei 360 X g für 5 min und 4 ° C. Aspirieren Sie Medien von konischen.
  9. Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 1 mL der Expansion Medien und Anzahl Zellen mit einem Hemacytometer.
  10. Sobald quantifiziert, können Zellen unterteilt werden, falls erforderlich und passagiert vorwärts auf eine neue Kulturschale (einschließlich Vorbereitung der Fibroblasten kokultur, Schritt 3, und galvanischen Zellen für Expansion, Schritte 5,9-5.12) oder als Sphäroide (Schritt 7) kultiviert.
    Hinweis: Wenn passagierung in eine neue Kulturschale für Expansion, Aussaatdichte von 0,5-1 × 106 Zellen in einer P100 Petrischale wird empfohlen.

7. säen Zellen für HNE Sphäroid Kulturen

Hinweis: Führen Sie alle Verfahren in diesem Schritt als Zentrifugation, in eine saubere Biosafety Kabinett.

  1. Auftauen der Basalmembran Matrix auf Eis gemäß Herstellerangaben (100 µL pro Sphäroid gut).
    Hinweis: Erwägen Sie steril 500 µL-Aliquots der Basalmembran Matrix nach Erhalt; Dieser Betrag wird eine einzige 4-Well-Platte Samen.
  2. Eine angemessene Zahl von differentiell trypsiniert, passagiert Zellen (aus Schritt 6,9) für eine Endkonzentration von 500.000 Zellen pro mL der Matrix zu trennen. Verwenden Sie für ein 4-Well-Platte 200.000 Zellen. Sammeln Sie in einem 1,5 mL-Tube.
  3. Zentrifugieren Sie Zelle und Medien-Gemisch bei 360 X g für 5 min bei 4 ° C. Vollständig, aber sorgfältig abzusaugen Sie und entsorgen Sie Medien mit einer 1-mL-Pipette, kümmert sich nicht um die Zelle Pellet zu stören.
  4. Fügen Sie mithilfe einer PIPETTENSPITZE 1 mL 100 µL pro auch der Basalmembran Matrix, die 1,5 mL Röhrchen mit den Zellen geplant. Halten Sie das Rohr auf dem Eis.
  5. Pipette rauf und runter sorgfältig und gründlich Aufschwemmen Zellen in der Basalmembran-Matrix. Bewegen Sie sich schnell zur Verfestigung der Matrix zu vermeiden. Vermeiden Sie vollständig entleeren die PIPETTENSPITZE sicherzustellen, Luftblasen in die Matrix/Zelle Mischung nicht eingeführt werden.
  6. Samen Sie 100 µL Matrix Aliquote in jede Vertiefung eine 4-Well-IVF-Kultur-Platte.
    1. Mit einer sauberen Schere, schneiden Sie die distalen 3-4 mm von einer PIPETTENSPITZE 200 µL.
    2. Pipette mit der gestutzten Spitze, sorgfältig 100 µL der Zellmatrix/Mischung in die Mitte jedes gut. Pipette langsam, mit dem Ziel der Herstellung einer einzigen Matrix "Tropfen" in der Mitte von jedem Bohrloch. Die Tropfen sollten kugelförmige bleiben und sollten die Seiten des Brunnens nicht berühren. Wenn die Platte bewegt, tun so sorgfältig zu vermeiden, diese Tropfen zu stören.
    3. Inkubieren Sie die Basalmembran Matrix Tropfen bei 37 ° C und 5 % CO2 für 30 min, bis fest.
    4. Pipette vorsichtig 500 µL Differenzierung Medien in jedem Brunnen, kümmert sich nicht um die Matrix-Drop zu stören. Sicherstellen Sie, dass die Medien nur Abdeckung die Matrix fallen und mehr hinzufügen, wenn nötig.

8. unterscheiden Sie und Reifen Sie HNE Sphäroide

  1. Mit einer 1 mL-Pipette-Spitze, sanft Aspirieren Sie alle Medien aus Brunnen; vermeiden Sie Absaugen der Matrix, die Sphäroide in diesem Teil der Matrix, zerstören wird, obwohl Sphäroide zurückgelassen lebensfähig bleiben können.
  2. Mit einer frischen 1 mL PIPETTENSPITZE, sanft fügen Sie 500 µL Differenzierung Medien nun um die Matrix hinzu. Berühren Sie die Matrix mit der Pipette nicht und nicht zu stören den Matrix-Tropfen.
  3. Der Inkubator bei 37 oC und 5 % CO2 für weiteres Wachstum Sphäroide zurückzukehren. Wiederholen Sie die Schritte 8,1 bis 8,3 dreimal wöchentlich.
  4. Bewerten Sie Sphäroid Morphologie täglich unter einem inversen Mikroskop 20 X. Sphäroide sollte innerhalb von 3-5 Tagen Überzug bilden, und erreichen Reife innerhalb von ca. 10 Tagen.

(9) Vorbehandeln, stimulieren und Bild HNE Sphäroide zur Analyse

  1. Sphäroide wie gewünscht vor Bildgebung wie zuvor beschrieben30Vorbehandeln.
    Hinweis: Für VX809 Vorbehandlung fügen Sie 3 µM VX809 an die Medien für 48-72 h vor Bildgebung hinzu. Mischen Sie 1 µL 10 mM VX809 Lager (siehe Materialtabelle) in 3,3 mL Medien für diese Konzentration.
  2. Ändern Sie nun der Sphäroide auf 1 mL frisch Differenzierung Medien, einschließlich Vorbehandlung (Schritte 8.1-8.3) vor imaging Sphäroide.
  3. Bereiten Sie frische Stimulation Drogen Lösungen (Forskolin, 3-Isobutyl-1-methylxanthin [IBMX], VX770 und CFTR-Inhibitor 172 [Inh172]) aus den Beständen (siehe Materialtabelle). Fügen Sie 1 µL der einzelnen Aktien Forskolin/IBMX 98 µL steriles Wasser in einem einzigen beschriftet 1,5 mL-Tube hinzu. Fügen Sie 1 µL der einzelnen Aktien für VX770 und Inh172 hinzu 99 µL steriles Wasser in separaten beschrifteten 1,5 mL-Tuben. Machen Sie ein Volumen von insgesamt 50 µL der Lösung ermöglicht für jedes gut getestet. Lösungen unter sterilen Bedingungen in der Biosicherheit Kabinett vorbereiten.
  4. Übertragen Sie Sphäroid Platte auf eine inkubierten Kammer setzen auf 37 ° C und 5 % CO2, montiert auf einem inversen Mikroskop mit elektronischen Bild-Capture-Software und einem Kreuztisch für XY-Verstellung ausgestattet. Schalten Sie das Mikroskop und Kamera sowie die bildgebenden Computer.
  5. Aufnahmen der Grundlinie der Sphäroide in einen Brunnen.
    1. Öffnen Sie die Image-Capture-Software (Slidebook 5.5 für Anweisungen unten). Sobald initialisiert, öffnen Sie eine neue Datei, indem Sie auf "Datei" und dann "Neu". Benennen Sie die Datei entsprechend und klicken Sie auf "Speichern".
    2. Vorsichtig den Kultur-Platte Deckel und zentrieren ein Matrix-Tropfen über das Ziel.
    3. Beginnend an der Spitze des Tropfens Matrix bewegen Sie in einem Raster Sphäroide bei 20 X Vergrößerung mit dem Mikroskop Okular zu finden. Konzentrieren uns rauf und runter, um die Kugel an der breitesten Stelle zu erfassen. Kommentieren Sie den Speicherort der einzelnen Sphäroid auf einer Karte von der Matrix-Tropfen, nach dem Imaging wiederzuerkennen.
    4. Klicken Sie in der Software "Image-Capture". Für Belichtung, wählen Sie "Manuell" und geben Sie 50 ms gewährleisten, eignen sich andere Einstellungen (Bin Faktor: 1 x 1, W: 512, H: 512, X und Y-Offset: 0). Geben Sie einen geeigneten Namen für jedes Bild in das Feld "Name" (z. B. Sphäroid 1 Baseline). Klicken Sie auf "Start", um ein live-Bild anzeigen und "Speichern" um ein Baseline-Abbild zu erfassen.
    5. Wiederholen Sie Schritte 9.5.1-9.5.4 bis Ziel Anzahl erreicht ist, oder gesamte Matrix Drop abgebildet.
      Hinweis: Gruppenunterschiede können mit so wenig wie 3-5 Sphäroide pro Zustand nachgewiesen werden, allerdings ist es unserer Praxis, Bild 10 oder mehr Sphäroide pro Bedingung zur Erhöhung der Leistung geworden. Variabilität des Tests wird in Abbildung 2 des Abschnitts "Vertreter Ergebnisse" mit Proben von 8-10 Sphäroide pro Fach als Beispiel gezeigt.
  6. Sphäroide zu stimulieren.
    1. Fügen Sie mithilfe einer 200 µL Pipette 50 µL des Medikaments geeignete Stimulation in den Medien in den Brunnen, kümmert sich nicht um die Matrix zu stören.
      Hinweis: Nach dieser 10-divisibel Verdünnung (50 µL in 500 µL der Medien), die endgültige Wirkstoffkonzentration werden: Forskolin 10 µM IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. Fügen Sie für nur cAMP nur Forskolin/IBMX hinzu.
    3. Fügen Sie für Lager + VX770 Forskolin/IBMX zuerst, dann VX770 nach 2 min.
    4. Für gehemmt Bedingungen, fügen Sie Inh172 zuerst, dann Forskolin/IBMX nach 2 min.
  7. Sofort nach der Stimulation überwachen Sie Sphäroid Quellung durch Zeitraffer Imaging für 1 h. Klicken Sie in der Software "Image-Capture". Klicken Sie auf "Zeitraffer", und legen Sie das Intervall auf 30 s, mit einer Dauer von 60 min geben Sie einen geeigneten Namen ein und klicken Sie auf "Speichern" Zeitraffer starten.
    Hinweis: Standard Timelapse besteht darin, Bilder von einem einzigen Sphäroid erfassen alle 30 s, um ein Video in hoher Qualität zu gewährleisten. Alternativ führen niedriger Vergrößerung Erfassung des gesamten Brunnens (z. B. 4 X), und weniger Bilder erfasst, falls gewünscht. Wenn eine automatisierte Bühne verwendet wird, führen Sie Zeitraffer alle Sphäroide mit vordefinierten Koordinaten; Verwenden Sie andernfalls Zeitraffer mit einer Teilmenge der Sphäroide ermöglichen eine qualitative Überprüfung der Schwellung und um sicherzustellen, dass keine systematische Probleme während der Bildgebung (z. B. Matrix Loslösung aus dem Brunnen).
  8. Sofort nach der Fertigstellung des Bildes 1 h Timelapse Aufnahmen nach Stimulation von allen Sphäroide (pro Schritt 9,5) mit Hilfe der Karte im Schritt 9.5.3 erstellt.
    1. Beziehen sich auf Pre-Stimulation Bilder um sicherzustellen, dass die gleichen Fokusebene für Follow-up-Bilder (die fokale Qualität der umgebenden Zellen, Sphäroide oder Fremdkörper erheblich erleichtern diesen Vorgang) verwendet wird.
    2. Speichern von Dateien mit einer gekoppelten Annotation aus Schritt 9.5.4 (z. B. Sphäroid 1 Post-Stimulation).
      Hinweis: führen Sie diesen Schritt sofort nach der Timelapse Sphäroide weiterhin anschwellen können.
  9. Ersetzen Sie Medien in der abgebildeten gut mit frischen Differenzierung Medien.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 9,5 bis 9,9 für jede gut/Bedingung, Anpassung der Stimulation Drogen wie für experimentellen Bedingungen angegeben.
  11. Nach Abschluss aller Bildgebung Sphäroide zurück in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
    Hinweis: Abhängig von der Sterilität der inkubierten Mikroskop Kammer kann nach Stimulation-Kontamination der Sphäroide durchaus üblich sein. Behalten Sie abgebildeten Sphäroide in einem separaten Inkubator, Cross-Kontamination Risikominimierung oder verwerfen Sie Sphäroide sofort nach dem Imaging.

10. analysieren Sie HNE Sphäroid Bilder

  1. Exportieren Sie alle aufgenommenen Bilder in ein Format kompatibel mit Bildanalyse-Software. Klicken Sie in der Software auf "Ansicht", bewege den Mauszeiger über "Export", und wählen Sie "Standard-Ansichten von alle Bilder als TIFF...". Speichern Sie auf der Festplatte oder ein Flash-Laufwerk für die Analyse.
    Hinweis: eine kommerzielle Analyse-Software (Table of Materials) und TIFF-Dateien gut durchzuführen und werden hier beschrieben, obwohl Analyse auch mit anderen Plattformen durchgeführt werden kann. Beim Benennen von Dateien sollte Personal Analyse von Bildern zu den Versuchsbedingungen geblendet, sondern bewusst welche Bilder (Pre- und Post-Stimulation) gekoppelt sind, um entsprechende Analyse sicherzustellen.
  2. Mit Analysesoftware der luminalen Bereich eines jeden Bildes Sphäroid abzugrenzen und in einer Datenanalyse-Software exportieren.
    1. Offene Analyse-Software. Klicken Sie auf "Datei", dann "Öffnen" und navigieren Sie zu der Dateiordner mit Sphäroid Bildern. Wählen Sie alle Bilder für die Analyse, und klicken Sie auf "Öffnen".
    2. Klicken Sie auf "Messen" und wählen Sie "Region Messungen". Wählen Sie im Dialogfeld Region Messungen der Droptab "Konfiguration aus" und sicherstellen Sie, dass "Bildname" und "Bereich" Kontrollkästchen aktiviert sind.
    3. Klicken Sie auf "Anmelden" und wählen Sie "Open Data Log". Klicken Sie "OK" auf die Data Log-Dialog Box und Namen Datei entsprechend (z. B.Zustand X, Datum). Dadurch werden alle Messwerte in eine Tabelle übertragen.
    4. Wählen Sie "Trace-Region" Tool-Button und verfolgen Sie sorgfältig das Lumen der Sphäroid in das erste Bild für die Analyse. Klicken Sie in der Region Messung Dialogbox auf "Log-Daten" um die Messung in Excel zu protokollieren.
    5. Wiederholen Sie Schritte 10.2.2-10.2.4, bis alle Sphäroide analysiert werden.
  3. Berechnen Sie die prozentuale Veränderung (100 * [Post-Stim - Baseline] ÷ Baseline) im Bereich luminalen vom Ausgangswert für jedes einzelne Sphäroid paar Bild und Daten für die Analyse zu kompilieren.

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Representative Results

HNEs sollte der Kulturschale beimessen und bilden kleine Inseln von Zellen innerhalb 72 h nach Aussaat; Beispiele für gute und schlechte Insel Formation in einer Woche werden in Abbildung 1A und 1 b, bzw. angezeigt. Diese Inseln sollte erweitert und um das Gericht im Laufe von 15-30 Tagen zu decken. Kleine oder suboptimale Proben können länger dauern und werden oft nicht sinnvoll Sphäroide Ausbeute. Kontamination mit Krankheitserregern wird durch tief gelb/bewölkt Medien, Nichtbeachtung der Zellen in der Kulturschale zu befestigen und/oder direkte Visualisierung der Pilze/Bakterien nachgewiesen. Alle kontaminierten Kulturen sollten sofort entsorgt werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.

Innerhalb der ersten 3-4 Tage Kultur in der Basalmembran Matrix sollten kleine zystische Strukturen in der Matrix zu bilden beginnen. Diese werden in ca. 10 Tagen zu intakt Sphäroide demonstrieren eine dünne Wand und einer luminalen Oberfläche heranreifen. Wenn die beschriebenen Dichte beschichtet, werden erfolgreiche Kulturen 50-100 Sphäroide pro Matrix Tropfen enthalten. Die Lumen ist möglicherweise relativ deutlich (Abbildung 1) oder voller zelltrümmer und Schleim (Abbildung 1); Ersteres ist häufiger bei Sphäroide mit Wildtyp CFTR (WtCFTR), und die letzteren in CF Sphäroide. Maskierung um luminalen Bereich der Sphäroide in Figur 1 und 1D abzugrenzen ist in Abbildung 1E und 1F, bzw. demonstriert. Beispiele von schlecht gebildet/erfolglosen Sphäroid Kulturen in Figur 1 und 1 H.

Repräsentative Funktionsdaten für Wildtyp und F508del CFTR homozygot HNE Sphäroide Figur 2A und 2 b, bzw. zeigt; Diese Daten sind repräsentativ für > 10 einzigartige HNE Samples in Wildtyp und F508del CFTR homozygot Themen30. Kurzum, Sphäroide mit funktionellen CFTR anschwellen, während diejenigen, die mit deutlich weniger dysfunktionalen CFTR-Swell oder schrumpfen können. Insbesondere sollte Sphäroide aus Fächern mit WtCFTR über eine Stunde aufquellen wenn stimuliert, und sollte weniger anschwellen oder schrumpfen, wenn im Beisein der CFTR-Inhibitor Inh172 angeregt. Umgekehrt Sphäroide aus einem Fach homozygot für F508del CFTR sollte entweder schrumpfen oder Wellengang sehr leicht mit erhöht, Schwellungen (oder weniger Schrumpfung) Wenn pharmakologisch mit der CFTR-Modulatoren, VX809 und VX770 korrigiert. Frühere Analysen der Sphäroid Zuverlässigkeit sowohl innerhalb als auch zwischen Personen des gleichen Genotyps demonstrieren Funktionstrennung von CFTR-Genotypen und bescheidener Variabilität in Messwiederholungen30.

Media-Komponente Stammlösung Betrag Lagerung
Ausbau-Medien
DMEM / F-12 Nährstoff-Mischung "Base Medien" Verwendung als 2 x 500 mL Behälter Lagerung bei 4 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Fetale Rinderserum Verwendung als 50 mL Lagerung bei-20 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Cholera-Toxin 10 mg in 1 mL sterilem Wasser 1 ΜL Lager bei-20 º c bis zu sechs Monaten zu speichern
Epidermalen Wachstumsfaktor 500 µg in 1 mL sterilem Wasser 20 ΜL Lager bei-20 º c bis zu sechs Monaten zu speichern
Hydrocortison 0,4 mg in 400 µL steriles Wasser Ganze 400 µL aliquoten Machen Sie mit jeder Charge frisch. Shop-Pulver bei Raumtemperatur bis zu Hersteller-Ablaufdatum
Adenin 24 mg in 1 mL sterilem Wasser Gesamte Aliquote 1 mL Machen Sie mit jeder Charge frisch. Shop-Pulver bei Raumtemperatur bis zu Hersteller-Ablaufdatum
Y-27632 3,2 mg in 1 mL sterilem Wasser Gesamte Aliquote 1 mL Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei-20 º c bis Verfallsdatum Hersteller
Antibiotika-Medien
Amphotericin B Verwendung als 1,2 mL Lagerung bei 4 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Ceftazidim 15 mg in 1 mL sterilem Wasser Gesamte Aliquote 1 mL Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei-20 º c bis Verfallsdatum Hersteller
Tobramycin 15 mg in 1 mL sterilem Wasser Gesamte Aliquote 1 mL Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei-20 º c bis Verfallsdatum Hersteller
Vancomycin 15 mg in 1 mL sterilem Wasser Gesamte Aliquote 1 mL Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei-20 º c bis Verfallsdatum Hersteller

Tabelle 1: Komponenten der Expansion und antibiotische Medien.

Media-Komponente Stammlösung Betrag Lagerung
DMEM / F-12 Nährstoff-Mischung "Base Medien" Verwendung als 2 x 500 mL Behälter Lagerung bei 4 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Ultroser-G 20 mL steriles Wasser in einer einzigen, 20 mL Flasche von lyophilisierten Ultroser-G Ganze 20 mL aliquoten Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei 4 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Fetale Klon II Verwendung als 20 mL Lagerung bei-20 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Stift-Strep Verwendung als 10 mL Lagerung bei-20 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Bovine Brain-Extrakt Verwendung als 2,48 mL Lagerung bei-20 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Transferrin Verwendung als 250 ΜL Lagerung bei-20 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Insulin Verwendung als 250 ΜL Lagerung bei-20 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Ethanolamin Verwendung als 15 ΜL Lagerung bei Raumtemperatur bis zum Ablaufdatum der Hersteller
Epinephrin 2,75 mg in 1 ml sterilem Wasser Gesamte Aliquote 1 mL Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei 4 ° c bis Verfallsdatum Hersteller
Trijodthyronins 8,4 mg in 50 µL von DMSO Ganze 50 µL aliquoten Machen Sie mit jeder Charge frisch. Speichern Sie Puder bei-20 º c bis Verfallsdatum Hersteller
Hydrocortison 7,24 mg in 1 mL ethanol 1 ΜL Lager bei-20 º c bis zu sechs Monaten zu speichern
Phsophoryletheanolamine 35,25 mg in 1 mL sterilem Wasser 1 ΜL Lager bei-20 º c bis zu sechs Monaten zu speichern
Retinsäure 3 mg in 1 mL DMSO 1 ΜL Lager bei-20 º c bis zu sechs Monaten zu speichern

Tabelle 2: Bestandteile der Differenzierung Medium.

Figure 1
Abbildung 1 : HNE Expansion und Strukturmerkmalen der HNE Sphäroide. Hellfeld Bilder HNE Erweiterung Kulturen sieben Tage nach der Beschichtung zeigen erfolgreiche (weißen Pfeil, Panel A) und erfolglos (Gruppe B) HNE Kolonie Bildung auf einem Feeder Fibroblasten Hintergrund. Erfolgreiche WtCFTR und F508del homozygot Sphäroide werden in Platten C und Dangezeigt. Maskierung um luminalen Bereich der Sphäroide aus C/D abzugrenzen ist in Platten E und F, jeweils vorgesehen. Erfolglose Sphäroid Kulturen zeichnen sich durch kleine, ungeordnete zelltrümmer (Gruppe G) und/oder unorganisiert Klumpen von Zellen (Tafel H). Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Funktionelle Eigenschaften von HNE Sphäroide. Repräsentative funktionale Antworten von WtCFTR Sphäroide von einem einzelnen Spender, wenn Sie angeregt mit Forskolin/IBMX mit/ohne die Anwesenheit des CFTR-Inhibitors Inh172 werden im Bedienfeld "(A) jeder Punkt angezeigt stellt die Antwort in einem einzigen Sphäroid. Repräsentative funktionale Antworten der F508del homozygot Sphäroide von einem einzelnen Spender, wenn Sie mit Forskolin/IBMX mit/ohne das Vorhandensein von VX809 und VX770 angeregt werden im Bedienfeld "(B) angezeigt. Fehlerbalken = SEM. ** p < 0,01; p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Generation des Patienten abgeleitet nasale Sphäroid Zellkulturen in der Lage, eine individuelle, spezifische Modell der CFTR-Funktion zu produzieren. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Prozess, der eng anwesend sein sollten, um Schwierigkeiten zu vermeiden. Zunächst ist eine gute Probe Akquisition von der Nase des Patienten. Eine gute Probe hätte > 50.000 Zellen begrenzt Schleim/Schutt, und seien Sie bereit für die Verarbeitung innerhalb von 4 h (wenn auch Erfolg mit Übernachtung auf dem Eis Versand auch einfach zu erreichen ist). Praxis Erwerb von Proben mit Kürette oder einer Bürste durch Studie Personal ist notwendig, das wird erleichtert durch die Konzentration der frühzeitigen Erwerb der Probe in die Hände von ein oder zwei Anbieter um ihren Komfort zu maximieren. Zweite, guter zu reinigen/sterile Technik in allen Schritten der Gewebekultur ist unerlässlich. Der primäre Modus des Scheiterns, nach unserer Erfahrung für alle HNE Kulturen ist bakterielle oder Pilzinfektionen Kontamination, die Einzelprobe und anderen wachsenden Kulturen im Brutschrank erschweren können. Dieses Risiko steigt nur mit Kulturen von Patienten mit chronischen Infektionen (z.B., CF), daher Erfolg hängt weitgehend von der Fähigkeit zu Kulturen sauber und getrennt zu halten. Unsere Praxis ist ein Inkubator nur für Infektionen anfällig Kulturen innerhalb der ersten 5-7 Tage trennen ältere, erfolgreiche Kulturen vor unbeabsichtigten Kontamination zu schützen. Drittens ist es wichtig, eng sehen Zellen während der Expansionsphase und Overconfluence zu vermeiden. Wenn die Zellen volle Zusammenfluss auf der Platte zu erreichen dürfen, besteht die Gefahr, die die Kultur wird entweder seneszenten oder Zellen beginnen zu sterben und zu lösen. Schließlich, wenn Zellen als Sphäroide Plattieren, ist es wichtig, gründlich die Zellen durch die Matrix zu zerstreuen und eine gleichmäßig verteilte Probe Platte. Entweder über - oder unter - population der Matrix Tropfen führt zum Kultur scheitern, und große Klumpen von Zellen erzeugt keine erfolgreiche Sphäroide.

Während der Durchführung des Protokolls, können die Ermittler ein paar gemeinsame Probleme auftreten. Verunreinigungen, ist wie oben erwähnt, am besten vermieden durch Beschaffung eine gute erste Probe ohne Schleim und saubere Techniken. Wenn Kulturen erfolgreich durch Erweiterung sind, aber keine differenzierten Sphären entstehen, sind möglicherweise einige Probleme aufgetreten. Wenn die Matrix meist leer zu sein scheint, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Zellen ausgesät wurden bei zu niedrig Dichte; die Aussaatdichte nachfolgende Versuche um ca. 20 % zu erhöhen. Umgekehrt, wenn die Matrix zu "schmutzig" mit reichlich zellenrückstand zu sein scheint, ist es wahrscheinlich, dass die Zellen ausgesät wurden bei zu hoher Dichte und nachfolgende Versuche verwenden eine Aussaatdichte um ca. 20 % gesenkt. Eine häufige Komplikation der Post-Aussaat, Fütterung und Pflege ist die Loslösung von der Matrix aus dem Kulturgefäß. Dies entsteht durch übermäßig aggressive Medien Austausch und vermieden werden, indem Sie vorsichtig und manuell ändern Medien mit einer 1-mL-Pipette, nicht Wand absaugen. Wenn gefunden, können Kugeln noch angeregt und abgebildet, obwohl dies möglicherweise schwierig, wenn die Matrix "im Brunnen während der Bildgebung, erfordern vorsichtige Kartierung der Sphäroide innerhalb der Brunnen schwimmt".

Die Ermittler können mehrere Änderungen des Protokolls, je nach den Bedürfnissen ihrer Labor verfolgen. Für höhere Auflösung Belichtung der Sphäroide haben wir vorher 4-Well-Platten mit optischem Glas-Optionen, einschließlich 35-mm-Glasboden Gerichte oder Kammer Folien ersetzt. Dies ermöglicht eine hochauflösende, live-Darstellung der Sphäroide, sondern Durchsatz verringern kann. Alternativ können zur Erhöhung des Durchsatzes, kleinere Aliquote von Zellen in der Matrix in andere Gefäße (z. B. Kultur 24-Well-Platten) ausgesät werden. Nach unseren Erfahrungen wachsen Sphäroide am besten mit der Matrix in eine Form von "Tröpfchen" im Gegensatz zu bilden ein Blatt an der Unterseite des Brunnens; als solche hatten wir die besten Erfolg mit Tröpfchen aus mindestens 25 µL. Ermittler möge, die Dichte der Matrix zu ändern, durch das Verdünnen mit Medien. Dies reduziert die Gesamtmenge an Matrix notwendig, die Kosten des Tests zu verbessern. Dies kann jedoch auch Sphäroid Zusammensetzung ändern. In unseren bisherigen Erfahrungen verändert niedrigere Konzentrationen der Basalmembran Matrix führen zu Sphäroid Struktur, entweder teilweise oder vollständige Bildung der Sphäroide in eine "Zelle-Apex-Out"-Morphologie. Als solche sollten Sphäroide erzeugt durch Änderungen des Protokolls in Matrix-Konzentration vorsichtig für Morphologie ausgewertet werden, bevor Funktionstests versucht wird. Zu guter Letzt könnte anders stimulieren oder hemmende Medikamente oder verschiedenen Konzentrationen dieser Medikamente eingesetzt werden. Forskolin, IBMX und Inh172 wurden für unsere Studien in diesen Konzentrationen basierend auf bisherigen Erfahrungen in ALI Kulturen31ausgewählt. Mit anderen Medikamenten (z. B. Isoproterenol zur Stimulation, GlyH101 für Hemmung) kann besser auf ein Ermittler Studie anwenden. Ebenso mit verschiedenen Konzentrationen von Forskolin, IBMX oder Inh172 kann den Dynamikbereich des Assays ändern, jedoch haben wir diese Optionen nicht systematisch getestet.

Angesichts der Zahl der vorhandenen ex Vivo Patienten abgeleitet CFTR-Assays, zeichnet sich das beschriebene Modell aus mehreren wichtigen Gründen. Erstens nutzt es nasale Zellen als Quelle der Atemwege Gewebe leicht erhalten. HNE Beschaffung mit minimalem Schulungsaufwand in fast jeder Umgebung sicher durchgeführt werden kann (Klinik, OR, Forschungsaufenthalt) in allen Altersgruppen25. Dies erleichtert robuste Probe Beschaffung, und wiederholen Sie ggf. durch Wachstum Schwierigkeit oder Kontamination die Probenahme. Im Vergleich zu Darm Organellen, HNE Sphäroide sind weniger gut charakterisiert und einen kleineren Dynamikbereich in der vorliegenden Form, aber der Atemwege statt GI Gewebe verwenden ein wesentlicher Vorteil, als mehrere CF-Krankheit-Treiber (z. B. möglicherweise angezeigt Mucociliary Clearance, epithelialen Natrium-Kanal Ausdruck) sind nicht gleichwertig im Darm. Im Gegensatz zu planar, ALI Kulturen HNE Zellen Sphäroide schneller gewachsen sind und möglicherweise mehr Vertreter der in Vivo Bedingungen messen einen physiologischen Prozess (Fluid Homöostase), der möglicherweise relevanter als Elektrophysiologie allein32. Durch die Verbesserung der Zeit von der Beschaffung der Probe zu testen, wird potentiellen Kontamination reduziert, daher erhöht die Wahrscheinlichkeit von Kultur Erfolg. Schließlich kann die 3-dimensionale Natur des Modells für den Roman und/oder ergänzende Linien der Forschung in der Entwicklung der Atemwege oder Morphologie, die nicht machbar in ALI Kulturen (z.B., luminalen Schleim tracking, schnelle Studien der Differenzierung, zugänglich sein ( etc.).

Es gibt mehrere wichtige Einschränkungen, HNE Sphäroide als ein Test der CFTR-Funktion. Erstens bleibt dieser Test relativ niedrigen Durchsatz. Mit den aktuellen Methoden, Bildaufnahme dauert über eine Stunde für jede Kultur Bedingung und Analyse nimmt eine zusätzliche 20-30 min pro Zustand. Dies wird verstärkt durch den Grad der Überschneidung zwischen bestimmten Bedingungen (wie gezeigt in Abbildung 2A), die eine größere Anzahl von Messungen erfordert (diese Überlappung an sich kann auch eine Einschränkung der Empfindlichkeit des Assays vertreten). Eine einzige Experiment mit 4-6 Bedingungen erfordert fast zwei Tage, für die Fertigstellung. Durchsatz kann verbessert werden, durch den Einsatz automatisierter Bilderfassung und Analysemethoden; solche Anpassungen sind derzeit im Gange. Zweitens erfordert dieses Modell eine große Menge an Matrix, die teuer werden kann. Wie oben erwähnt, Verdünnung der Matrix kann helfen, diese Barriere zu überwinden, aber muss mit Vorsicht, wie Veränderungen im Wachstum Matrix wird wahrscheinlich führen Änderungen in der Morphologie der Sphäroid eingenommen werden. Drittens setzt dieses Modell auf Sphäroid Messungen in einem XY-Ebene und verwirft Schwellungen in der Z-Ebene, die Vorspannung vorstellen kann. Während frühere Reproduzierbarkeit Analysen beruhigend gewesen, konnte dieses Manko durch Einsatz von automatisierten Bildgebung mit Z-Plane Scannen, um berechnen Volumen30überwunden werden. Schließlich, und vor allem ist umfangreiche Arbeit, Sphäroid Beantwortung des einzelnen Subjekts in Vivo Medikament Antwort zu binden noch nicht abgeschlossen sein. In Abwesenheit dieser Korrelation ist der prädiktive Wert des Modells - während vielversprechend - unklar.

Generierung und Analyse der HNE Sphäroide ermöglichen ex Vivo Analyse der einzelnen CFTR-Aktivität und Modulation, die letztlich als der präklinischen Modell der Medikamente hilfreich sein können. Darüber hinaus kann ein individuelles Modell angesichts die umfangreichen Variabilität in CF krankheitschwierigkeit, Einblicke in ein Thema einzigartige Atemwege Mikroumgebung bieten. Auf diese Weise kann ein solches Modell für breitere CFTR-Biologie und Hilfe beim Verständnis von Krankheit Heterogenität nützlich. Zukünftige Verwendung dieses Modells sowie andere ähnliche Modelle der individualisierten CFTR-Funktion hält Versprechen, besser zu verstehen, CFTR-Biologie im Labor und auf Laufwerk personalisiert und präzisionsmedizin in der Klinik.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Zahl CLANCY14XX0 zu gewähren und durch Cystic Fibrosis Foundation, Gewährungsnummer CLANCY15R0. Die Autoren danken Kristina Ray für ihre Unterstützung bei der Rekrutierung von Patienten und Beaufsichtigung. Die Autoren möchte auch HNE Arbeitsgruppe, unterstützt durch die Cystic Fibrosis Foundation, die Generation von HNE Kultur Funktionen unterstützt: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Solomon und Katherine Tuggle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Tube USA Scientific  4036-3204
150 mL Filter Flask Midsci  TP99150 To filter Media
15 mL Conical Tube Midsci  TP91015
1 L Filter Flask Midsci  TP99950 To filter Media
35 mm Glass-Bottom Dish MatTek Corporation P35G-0-20-C Optional
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) Fisher Scientific  AC228420010  Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO
50 mL Conical Tube Midsci   TP91050
Accutase Innovative Cell Technologies, Inc. AT-104 Cell detachment solution
Adenine Sigma-Aldrich A2786-25G See Table 1
Amphotericin B Sigma-Aldrich A9528-100MG See Table 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL) Lonza  CC-4098 See Table 2
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich C3809-1G See Table 1
Cell Scrapers 20 cm  Midsci  TP99010
CFTR Inh172 Tocris Bioscience 3430 Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) Sigma-Aldrich C8052-.5MG See Table 1
CYB-1 Medical Packaging Corporation CYB-1 Cytology brush
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes  Life Technologies  11330-057 Base Medium; See Tables 1 and 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) Thermo Fisher Scientific PHG6045 See Table 1
Epinephrine Sigma-Aldrich E4250-1G See Table 2
Ethanol Fisher Scientific  2701
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135-500ML 16.6 mM solution; See Table 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) TCI America  E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) Invitrogen  10082147 See Table 1
Forskolin Sigma-Aldrich F6886-50 Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO
Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 356231 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) Advanced BioMatrix 5007-A Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)  GE Healthcare  SH30066.03HI See Table 2
Hydrocortisone StemCell Technologies 07904 See Tables 1 and 2
Insulin, human recombinant, zinc solution Life Technologies  12585014 4 mg/mL solution; see Table 2
IVF 4-Well Dish, Non-treated NUNC (via Fisher Scientific) 12566350 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate
MEF-CF1-IRR Globalstem GSC-6001G Irradiated murine embryonic fibroblasts
Metamorph 7.7 Molecular Devices Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote
Olympus IX51 Inverted Microscope Olympus Corporation Discontinued Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  for a quote
Pen Strep Life Technologies  15140122 See Table 2
Phsophoryletheanolamine Sigma-Aldrich P0503-5G See Table 2
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625-50MG See Table 2
Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. 96-0905 Nasal curette
Slidebook 5.5 3i, Intelligent Imaging Innovations Discontinued Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 20012050
Sterile Water Sigma-Aldrich W3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100 Techno Plastic Products 93100 Tissue culture dish for expansion
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG See Table 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza  CC-4205 See Table 2
Triiodothryonine Sigma-Aldrich T6397-1G 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; See Table 2
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma-Aldrich T4799-10G
Ultroser-G Crescent Chemical (via Fisher Scientific) NC0393024 20 mL lypophilized powder; See Table 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis Sigma-Aldrich V2002-5G See Table 1
VX770 Selleck Chemicals S1144 Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO
VX809 Selleck Chemicals S1565 Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO
Y-27632 Dihydrochloride  ROCK inhibitor  Enzo LifeSciences  ALX-270-333-M025  See Table 1

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References

  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

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Medizin Ausgabe 134 Mukoviszidose CFTR Präzisions-Medizin organoide Sphäroid nasale Zelle Zellkultur
Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie
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Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., … More

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., LaRosa III, F. J., Moncivaiz, J. D., Ostmann, A. J., Strecker, L. M., Clancy, J. P. Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study. J. Vis. Exp. (134), e57492, doi:10.3791/57492 (2018).

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