Summary
ここで人間の鼻粘膜上皮細胞の三次元回転楕円体文化を生成する手法について述べる。回転楕円体は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) ドライブに刺激される-依存イオンと液分泌、「CFTR 機能のプロキシとして回転楕円体内腔サイズ変化を定量化します。
Abstract
一方、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ (CFTR) 変調器薬の導入ケア嚢胞性線維症 (CF) に革命をもたらしました、現在使用している遺伝子型指向療法モデルはいくつかの制限を持っています。最初、稀なまたは流変異グループは、決定的な臨床試験から除外されます。また、追加の変調器薬市場に参入、個々 の主題の変調器の選択を最適化することは困難になります。両方のこれらの問題は「CFTR 機能変調の患者由来、個別の前臨床モデル システムを使って解決されます。ひと鼻粘膜上皮細胞 (HNEs) は、このようなモデルのための呼吸器組織の簡単にアクセス可能なソースです。ここで、「CFTR 機能と主な HNEs を用いた変調方式の三次元回転楕円体モデルの生成について述べる.HNEs は、低侵襲のファッション、条件付きのリプログラミング条件に拡大し、回転楕円体の文化にシードの被験者から分離されています。種まきの 2 週間以内に回転楕円体の文化生成 3', 5'-環状アデノシン一リン酸 (cAMP) を刺激することができます HNE スフェロイド-アゴニスト「CFTR 機能アクティブするを生成します。回転楕円体の腫れは CFTR の活性のプロキシとして、定量化されます。HNE 回転楕円体は、低侵襲、まだ呼吸疾患の罹患率と死亡率を反映した上皮に関連するアクセス可能なパーソナライズされたモデルを生成する鼻の細胞の起源を活用します。気液界面 HNE 文化に比べると、回転楕円体は、成熟する比較的簡単な汚染率を減らします。現在の形態でモデルは組織の買収の相対的な容易さは相殺されて、低スループットによって制限されます。確実に定量化し、個々 のレベルで「CFTR 活動を特徴付ける HNE 回転楕円体を使用できます。CFTR 変調に対する患者の反応の真の臨床予測かどうか HNE 回転楕円体は、生体内で薬剤応答にこの数量を結ぶ継続的な研究を決定します。
Introduction
嚢胞性線維症 (CF) は、約 7万人の世界1に影響を与える致命的な常染色体性劣性遺伝性疾患です。この人生短縮遺伝病は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス レギュレータ蛋白質 (CFTR)2で突然変異によって引き起こされます。CFTR 胃腸、汗腺を含む複数の偏光上皮細胞の頂端膜を渡る塩化物、重炭酸塩の動きを許容するイオン チャネルとして機能や、アデノシン三リン酸結合カセット家族のメンバーであります。・呼吸器病3,4の木の他の中で。など、「CFTR 機能不全は呼吸器疾患1から生じるほとんどの死亡率と多臓器の上皮障害につながります。CFTR 駆動気道表面液体 (ASL) 規制と粘液のリリースにつながる厚く粘液、気道閉塞、慢性感染症、進行性気道リモデリングと肺機能1、5の損失は、CF の肺。
病気の原因として「CFTR 機能障害の識別、にもかかわらず CF 療法は、伝統的症状 (例えば、膵酵素補充療法、気道クリアランス療法)1軽減焦点を当てた。このアプローチは、最近「CFTR 変調」「CFTR 機能不全を直接対象すると呼ばれる新規の治療法の出現によって革命化されました。このアプローチは、疾患修飾に症状マネジメントから臨床の風景をシフトしている気が、いくつかの制限6,7,8,9,10を運ぶ。変調器の活動は各 CFTR の突然変異に伴うタンパク質の欠陥に特定、限られた遺伝的個体群11を選択します。この制限は、まれな突然変異グループでの臨床試験の実行によっても異種タンパク質の欠陥、性質によって駆動されます。さらに、よく研究遺伝子多型 (例えばF508del/F508del CFTR CFTR の最も一般的な突然変異)、被験者の間ではばらつきが大きく、疾病負担と変調器応答6,7,8 ,9,11。
両方のこれらの問題を克服するため、捜査官は前臨床試験12のパーソナライズされたモデルの使用を提案している.この概念は、パーソナライズされた方法で治療する生体内で件名応答予測複合テスト、個別前のヴィヴォモデル システムを生成する患者特有の組織を利用しています。されましたら、臨床医が患者の基になる CFTR 遺伝子型に関係なくドライブ精度療法はこのようなモデルを使用可能性があります。
人間の肺移植の時に植組織から得られた気管支の上皮 (HBE) 細胞は、CF13,14のためのようなモデルの可能性を設立しました。HBEs 気液界面 (アリ) で成長して電気生理学的検査から直接または間接的 ASL 恒常性13,15の措置を通じて機能の CFTR の定量化を可能にします。このモデルは CFTR の生物学を理解するための重要なている、CFTR 変調器16の開発の重要なドライバーだった。残念ながら、HBE モデルはこれらのまれな変異や軽度の病気 (肺移植または気管支擦過) 買収の侵襲的な性質とサンプルの不足のためのパーソナライズされたモデルとして理不尽ではありません。個別「CFTR 機能17,18,を勉強する腸内電流測定 (ICM) または腫れベースにおけるアッセイの腸組織、直腸または十二指腸生検標本から得られたを使用ことができます逆に、19. Organoid 試金、特に、CFTR 活動20,21,22の非常に機密性の高いモデルであります。両方のモデルは、組織ソース (腸組織、ほとんどの病は呼吸器) と半侵襲的買収法によって制限されます。また、いくつか調査官はモデル CFTR 復元23,24,25に人間の鼻粘膜上皮 (HNE) の細胞を研究しています。HNEs はブラシまたはあらゆる年齢層の被験者で掻爬によって安全に収穫できるし、アリで培養した場合 HBEs25,26,27,28の多くの特徴を要約するでしょう。HNE 単層培養は扁平上皮の変換と成熟度29に長い時間によって伝統的に制限されています。また、報告されて短絡 HNEs で電流の測定が治療効果の25を検出する小さいウィンドウを示唆している HBEs のそれらより小さい。
「CFTR 機能のパーソナライズされた、非侵襲的呼吸器の組織培養モデルの必要性を考える我々 は HNEs の非侵襲的・呼吸器病の自然と腫れベースにおけるアッセイの感度をマージしようとしました。ここでは、腫れを用いた測定30個別 CFTR の研究のための HNEs の 3 次元「回転楕円体」文化を生成する手法について述べる。HNE スフェロイド二極化確実に球の中心、または内腔に向かって上皮の頂点。このモデルは、下気道上皮の多数の特徴を繰り返す、アリの文化よりも早く成熟します。機能アッセイとして HNE 回転楕円体は確実に範囲の「CFTR 機能としてよく研究の突然変異のグループ (例えば、F508del CFTR) で変調を定量化します。この腫れベースの試金を直接測定されない流体流入回転楕円体に水が根尖部の塩排出を通り CFTR のイオン/塩の輸送特性における大文字します。この方法で機能的 CFTR の誘導回転楕円体膨らむ頑健、CFTR 機能不全とのそれら、うねりの少ない縮小中。これは事前のイメージ分析を通して定量化され、1 h 後刺激の回転楕円体、内腔領域を測定し、割合の決定を変更します。この測定は、患者特異的薬物活性のスクリーニング実験群間で比較できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HNE サンプル シンシナティ小児病院医療センター CF 研究センターによって募集された被験者から手に入れられました。ここで説明したすべてのメソッドは、シンシナティ小児病院医療センター制度検討委員会 (IRB) によって承認されています。書面による同意は、テストの前にすべての被験者から得られました。
1. 拡張メディアと抗生物質
- 表 1に記載されているメディア コンポーネントを収集します。部屋の温度で冷凍材料を解凍し、「拡張メディア」の下の表 1に示されているように必要な在庫ソリューション。
注: は、コレラ毒素は、摂取すると有毒、皮膚、目、呼吸器を刺激を処理するときに注意をしてください。すべてのソリューションやバイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境下でメディアを結合します。 - 50 mL の血清学のピペットを使用して、削除し、他の材料の付加を補うために 1 つのコンテナーから基本媒体 (ダルベッコ変更イーグル培地/f12 キー) の 50 mL を破棄します。オートクレーブ 1 L ガラス瓶の中に基本のすべてのメディアを手で注ぐ。
- 適切な 50 mL の血清学のピペットや 1 mL ピペットを使用して、メディアを含むオートクレーブ処理したガラス瓶の中に表 1の「拡張メディア」セクションからすべて残りコンポーネントを転送。優しく手でミックスするボトルを旋回します。
- 新鮮な滅菌 1 L、0.22 μ m ポリエーテルサルホン (PES) にフィルター メディアは、製造元の指示を使用してフラスコをフィルターし、「拡張メディア」と日付にコメントを付けます。
-
抗生物質のメディアを準備します。「抗生物質のメディア」下の表 1 に示されているように必要な抗生の貯蔵液
- 50 mL の血清ピペットを使用して、新鮮な 250 mL のオートクレーブ処理したガラス瓶に拡張メディアの 150 mL を転送します。
- 1 mL ピペットを使用して、メディアを含むオートクレーブ処理したガラス瓶の中に表 1の「抗生物質メディア」セクションからすべてコンポーネントを追加します。旋回手でメディアが外観で均一になるまで混ぜます。
- フィルター滅菌、新鮮な 250 mL、製造元の指示を使用して 0.22 μ m PES フィルター フラスコにメディアと「抗生物質メディア」と日付にコメントを付けます。
- 曇り、汚染を示唆している場合の破棄まで 1 ヶ月、4 ° C でメディアを保管します。
2. 分化メディアを準備します。
- 表 2に記載されているメディア コンポーネントを収集します。部屋の温度で冷凍材料を解凍し、表 2に示されているように必要な溶液を作る。
注: 生殖毒素であるレチノイン酸を処理する場合は注意飲み込んだ場合有害であることができます、皮膚の炎症を引き起こします。分注とすべてのソリューションとバイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境下でメディアを組み合わせます。 - 削除し、他の材料の付加を補うために 1 つのコンテナーから基本培地中の 52 mL を破棄します。ベースのすべてのメディアをオートクレーブの 1 リットルのガラス瓶に注ぐ。
- 適切な 25 mL の血清ピペット、1 mL ピペットを使用して、メディアを含むオートクレーブ処理したガラス瓶に、表 2から残りのすべてのコンポーネントを転送し、混ぜて手で優しく渦します。
- 新鮮な滅菌 1 L、0.22 μ m ポリエーテルサルホン (PES) にフィルター メディアは、製造元の指示を使用してフラスコをフィルターし、「分化メディア」と日付にコメントを付けます。
- 曇り、汚染を示唆している場合の破棄まで 1 ヶ月、4 ° C でメディアを保管します。
3. コート培養皿とフィーダー線維芽細胞をプレート
注: は、バイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境の下ですべての手順を実行します。
- 0.5 mL コラーゲン株式の 37.5 mL の 50 mL の円錐管に滅菌水を混ぜます。
- 表面全体が覆われていることを確認各クリーン P100 培養皿に 4-5 mL のコラーゲン溶液をピペットします。
- 蓋が付いている皿をカバーし、37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
- キャビネットのバイオ セーフティにおけるすべての皿の蓋を削除します。渦巻き模様の皿をカバーし、吸引するソリューション。
- Uv (紫外線) 料理に戻って 1 h. 場所蓋、アルミ箔で料理をスタック、カバーのライトへの露出によって殺菌しなさい。
- 4 ° C で 3-6 ヶ月、紫外線滅菌再コーティング店料理光セル文化使用前に 15-30 分。
- HNE サンプルを取得する前に 24 時間殺菌塗装皿とマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) と日付ラベル。
- 血清学のピペットでプレート (約 5 mL) をカバーする拡張メディアを追加します。
- 37 ° C の洗浄器の 2 × 106照射 MEFs のバイアルを解凍します。MEFs がフリーズ解除、すぐに分散させるために手で旋回 1 mL ピペットで皿にバイアル (約 10 の6セル) の半分を追加します。
- HNE 文化のための準備で一晩の 37 ° C および 5% の CO2で孵化させなさい。
注: 3.7 3.10 の手順をすることができます必要に応じて、めっきセルの前に 60 分遅く実行も一晩です。
4. 取得して HNE サンプルを処理
- すべての科目の IRB 承認承諾・同意が得られることを確認します。
- 緩やかな粘液をクリアする忍耐強い打撃鼻を持っています。
- 下かを使用して鼻甲介を視覚化します。病変やポリープにサンプル コレクションを妨げることがあります現在がないことを確認します。
-
掻爬やブラッシングによって最初の鼻孔から鼻の細胞を収集します。
- 掻爬: ベンド キュレット掻爬カップから頂点がわずか 〜 135°の角度を作成する中点で。キューレットを鼻孔に挿入し、下鼻甲介の下のキュレット カップを進めます。そっと鼻甲介下に対してキュレット カップを押すし、キューレットを引いて、鼻甲介をこすり、繰り返し 3-4 回の合計します。
- ブラシ: パス、細胞診ブラシ下の下鼻甲介、回転し、鼻孔を終了せずわずか 4-5 回、入出庫のブラシを移動します。
- 場所キュレット/ブラシ 15 mL の円錐形には、抗生物質のメディアでいっぱい。同じ円錐管にキュレット/ブラシを配置すること、他の鼻孔に 4.3 4.4 手順繰り返します。
- 氷の上の処理の準備が整うまで円錐を格納します。処理サンプルの収集の 4 時間以内に発生しますできます必要に応じて取得後 24 h として遅く発生することを確認します。
5. 処理し、料理の HNE 細胞を展開
注: は、バイオ セーフティ キャビネットのクリーンな環境の下ですべての手順を実行します。
- 同じ円錐管キュレット/細胞診ブラシのすべてのセルを洗う 1 mL ピペットと円錐形のサンプルからメディアを使用する。きれいになったら破棄用キュレット/ブラシします。
- 360 x g と 4 ° C、5 分で円錐形遠心分離機します。
- 細胞ペレットを邪魔しないように世話上清を吸引します。
- 再細胞剥離溶液、均質混合物に先端が 1 mL ピペット 3 mL の細胞ペレットを中断します。
- 360 x g と 4 ° C、5 分で円錐形遠心分離機します。
- 5.3 5.5 の手順をもう一度繰り返します。
- 細胞ペレットを邪魔しないように世話残りの上清を吸引します。
- 再抗生物質メディアと診断数セルの 1 mL にペレットを中断します。
- 3.10 準備したコーティング、線維芽細胞種の皿の上に滴下し細胞をプレート 1 mL ピペットを使用して。完全にカバー皿や分散細胞表面に抗生物質のメディアを追加します。内容と日付が付いている皿にラベルを付けるし、37 ° C、5% CO2で孵化させなさい。
- 48 時間後、細胞は培養皿に接続されていることを確認します。メディアを吸引し、プレートをカバーする十分な新鮮な抗生物質メディアに置き換えます。
- 変更するメディア 3 x の週間、真空ラインとパスツール ピペット、古いメディアを吸引し、プレートをカバーする十分な新鮮なメディアに置き換えます。抗生物質メディアの 5 日後、メディアを交換して週 3 回続けて拡張メディアに変更します。
注: 汚染リスクが高い文化の最初の週に。交差汚染のリスクを最小限に独立したインキュベーターで新鮮なサンプルを保ちます。 - 毎週数回の細胞の成長を確認してください。細胞は約 70-80% 合流、通路のセルに進みます。
6. 通路 HNE セル
-
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 0.1% トリプシン溶液を準備します。
注: は、皮膚、呼吸器、眼刺激、トリプシンを扱う注意を使用します。- 円錐管でブタ膵臓由来トリプシンの 15 mg の重量を量る。
- 別の円錐管に EDTA の 56 mg の重量を量る。
- 安全キャビネットのオートクレーブ 250 mL ガラスボトルにトリプシンおよび EDTA を転送します。完全な転送を確実にトリプシン EDTA/チューブを洗浄するのに滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の小さい因数を使用します。
- 150 mL に合計のソリューションをもたらすため滅菌 PBS を追加します。蓋をしめてください。
- 37 ° C 洗浄器に完全に溶解するまでにトリプシン溶液を孵化させなさい。15 分毎にチェックし、速やかに一度解散を削除します。
注: を放置しないでくださいオフ長期間 (例えば一晩中)、長時間加熱した場合、トリプシン溶液が変化させなさいと。 - 2-3 70% のエタノールのスプレー ボトルをきれいにしキャビネット、バイオ セーフティに戻る。
- 製造元の指示を使用して 0.22 μ m PES フィルター フラスコ 250 mL の新鮮な滅菌に 0.1% トリプシン EDTA 溶液をフィルターし、日付と内容にコメントを付けます。
- 曇り場合破棄まで 1 ヶ月、4 ° C でトリプシン EDTA 溶液を格納します。
- 室温 70% エタノールとクリーン バイオ セーフティ キャビネットへの移動には 30 分以上のクリーンに分化メディア、0.1% トリプシン-EDTA 溶液、滅菌 PBS をもたらします。
- キャビネットのバイオで吸引し、細胞培養用ディッシュからメディアを破棄する真空ラインとパスツール ピペットを使用します。追加、旋回、きれいな血清ピペットを使用して PBS の 5 mL を吸引してお皿を洗ってください。
- 5 mL の血清ピペットを使用して、細胞培養用ディッシュに 0.1% トリプシン EDTA 溶液の 5 mL を追加し、5 分で 37 ° C、5% CO2インキュベーターに戻ります。
- 4-10 X で倒立顕微鏡で細胞を可視化します。セルお皿からデタッチし、ラウンドになる、フロートをチェックしてください。細胞を遊離させるおよび/またはほとんどの細胞を取り外すまでさらに 5 分間インキュベート再培養皿の側を軽くたたきます。
注: すばやく一度培養皿; から切り離されたセルを削除する注意してください。トリプシン-EDTA が低下 0.1% への長期暴露細胞生存率。 - 10 mL の血清ピペットを使用して、皿に増殖培地 5 mL を追加し、ラベル、滅菌の 50 mL の円錐管にすべての液体の内容 (合計 10 mL) を収集します。
-
セルが残っている場合培養皿に付着、繰り返し 6.4 から 6.6 にステップ アップ 2 回、同じ円錐管の収集内容。
- セルが残っている場合トリプシン ソリューションへの露出の 3 つのラウンドを使用後、培養皿に付着無菌細胞スクレーパー軽く残りの部分を削除します。皿を削り後、スクレーパーと増殖培地 5 mL で皿を洗うし、同じラベルの付いた円錐管の収集します。
注: 回転楕円体に継は、差動 trypsinization を実行するこの手順を変更します。トリプシンを追加した後、ソリューション (手順 6.4。)、チェック料理よく線維芽細胞をデタッチ (通常 1-2 分)、までだけ多角形の上皮細胞を残して皿に接続されています。収集しておきますこの上清、拡大のため前方が継代することができます。6.4 6.6 同じトリプシン溶液を使用して手順を繰り返し、回転楕円体の文化の残りの上皮細胞のみを収集します。
- セルが残っている場合トリプシン ソリューションへの露出の 3 つのラウンドを使用後、培養皿に付着無菌細胞スクレーパー軽く残りの部分を削除します。皿を削り後、スクレーパーと増殖培地 5 mL で皿を洗うし、同じラベルの付いた円錐管の収集します。
- 遠心分離機の 5 分の 4 ° C 360 x g で円錐形円錐形からメディアを吸い出しなさい。
- 拡張メディアと数の細胞、血球を使用しての 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。
- 必要に応じて細胞を分けることができます一度、定量化し、継代 (5.9 5.12 の手順の拡張用めっきと線維芽細胞の共培養、ステップ 3 の準備を含む) 新しい培養皿に転送またはスフェロイド (ステップ 7) として培養しました。
注: 拡張、0.5-1 × 10 の播種密度の新しい培養皿に継 P100 皿に6セル推奨です。
7. HNE スフェロイド培養の細胞を播種
注: は、このステップでは、遠心分離、クリーン バイオ セーフティ キャビネットの以外のすべての手順を実行します。
- 製造元の指示 (回転楕円体よくあたり 100 μ L) あたりの氷の基底膜マトリックスを解凍します。
注: は、領収書の基底膜マトリックスの滅菌 500 μ 因数この金額は、単一 4 ウェル プレートに播きます。 - 差動トリプシン、継代細胞 (ステップ 6.9) 行列の mL あたり 500,000 セルの最終的な集中のための適切な番号を区切ります。4 ウェル プレート 200,000 セルを使用します。1.5 mL チューブに収集します。
- 4 ° C で 5 分間 360 x g でセルとメディアの混合物を遠心分離します。完全に、しかし慎重に吸引し、細胞ペレットを邪魔しないように世話 1 mL ピペットを使用してメディアを破棄します。
- 1 mL のピペット チップを使用すると、セルを含む 1.5 mL チューブに基底膜マトリックスのよく計画あたり 100 μ L を追加します。氷の上の管を保ちます。
- 上下に慎重にピペットし、基底膜マトリックス内のセルを完全に再懸濁します。行列の凝固を避けるために迅速に移動します。マトリックスのセル/ミックスに空気の泡が起きないようにピペット先端を完全に空けることは避けてください。
-
4 よく体外受精培養プレートの各ウェルに 100 μ L 行列因数をシードします。
- 200 μ L ピペット チップの遠位 3-4 mm を切り落とすハサミのきれいなペアを使用して。
- 各井戸の中心にセル/マトリックス混合物の 100 μ L をピペット慎重にトリムの先端を使用して。各ウェルの中心部の単一マトリックス「ドロップ」を作ることを目標に、ゆっくりとピペットします。ドロップは球状、残っているし、井戸の側に触れないでください。プレートを移動する場合は、これらの低下の不安を避けるためにそう慎重に行います。
- 固体まで 30 分の CO2を 37 ° C、5% で基底膜マトリックス滴を孵化させなさい。
- 慎重にピペットのマトリックス ドロップを邪魔しないように世話を各ウェルに分化メディアの 500 μ。行列は削除し、必要に応じてさらに追加のメディア カバーだけを確認します。
8. 差別化し、HNE 回転楕円体の成熟
- 井戸からすべてのメディアを優しく吸引 1 mL のピペット チップを使用して、筒先のマトリックス、任意の回転楕円体を残した可能性があります実行可能に残るが、マトリックスの部分の回転楕円体を破壊します。
- マトリックス周辺井戸に 500 μ 微分メディアを追加軽く新鮮な 1 mL のピペット チップを使用して。ピペットを持つ行列をタッチしないし、行列ドロップを妨害しません。
- 回転楕円体を 37 oC でインキュベーターと継続的な成長のための 5% CO2に戻ります。8.1 から 8.3 手順を繰り返します 3 回毎週。
- 20 X で倒立顕微鏡下での毎日の回転楕円体の形態を評価します。回転楕円体は、めっき、3-5 日以内を形成し、約 10 日以内に成熟に達する必要があります。
9. 前処理、刺激、およびイメージ HNE 回転楕円体の分析のため
- 前述の30としてのイメージングの前に必要に応じて回転楕円体を前処理します。
注: VX809 前処理としては、VX809 の 3 μ M をイメージ作成前 48-72 時間メディアに追加します。ミックス 10 mM の 1 μ L VX809 在庫 (材料表参照) この集中のためのメディアの 3.3 mL の。 - 各変更新鮮な分化などのメディア、回転楕円体のイメージングの前に前処理 (ステップ 8.1 8.3) 1 mL に回転楕円体のことをよくします。
- 新鮮な刺激薬ソリューション (フォルスコリン、3-イソブチル-1-メチルキサンチン [IBMX] VX770 と CFTR 阻害剤 172 [Inh172]) (材料表参照) にある在庫を準備します。フォルスコリン/IBMX 98 μ L の滅菌水に 1.5 mL チューブをラベル付けシングルに各銘柄の 1 μ L を追加します。VX770 と Inh172 は、独立したラベル付き 1.5 mL チューブの滅菌水の 99 μ L を各銘柄の 1 μ L を追加します。それぞれ十分にテスト用ソリューションの 50 μ L を可能にする容量を作る。バイオ セーフティ キャビネットの無菌条件下でソリューションを準備します。
- 回転楕円体のプレートを設定し 37 ° C、5% CO2の電子イメージをキャプチャ ソフトウェアと XY 調整のメカニカル ステージを搭載した倒立顕微鏡にマウントされている培養室に転送します。顕微鏡カメラと画像処理コンピューターをオンにします。
-
1 つの井戸の回転楕円体のベースライン イメージをキャプチャします。
- 画像キャプチャ ソフト (下方向の Slidebook 5.5) を開きます。初期化した後は、「ファイル」、「新しい」をクリックして新しいファイルを開きます。それに応じてファイルの名前し、「保存」をクリック。
- 慎重に文化板蓋を取り外し、中央 1 つのマトリックスのドロップ目的。
- 顕微鏡の接眼レンズで 20 倍の倍率で回転楕円体を見つけること、グリッド内の移動マトリックス ドロップの上部に開始。最も広いポイントで球をキャプチャする上下に焦点を当てます。各回転楕円体再イメージング後識別するマトリクス ドロップ地図上の場所を指定します。
- ソフトウェアで、「イメージ キャプチャ」をクリックしてします。露出、「マニュアル」を選択し、50 ms の入力その他の設定が適切なことを確認 (ビン要因: 1 x 1、w: 512、h: 512、X および Y オフセット: 0).「名」ボックスを (例えば、回転楕円体 1 基準) に各イメージの適切な名前を入力します。ライブ画像を表示して「保存」ベースライン イメージをキャプチャする「スタート」をクリックします。
- 手順 9.5.1-9.5.4 を繰り返して目標数に達するか、マトリックス全体のドロップのイメージを作成します。
注: 条件あたり 3-5 を回転楕円体として、いくつかのグループに差を検出できる、ただし、1 つの力を高めるための条件 10 以上回転楕円体を画像を当社の慣例となっています。試金の変動は「代表結果」セクションの例として主題ごとの 8-10 回転楕円体のサンプル、図 2で示されます。
-
回転楕円体を刺激します。
- 200 μ L ピペットを使用して、マトリックスを邪魔しないように世話井戸内メディアに適切な刺激薬の 50 μ L を追加します。
注: この 10 倍希釈 (500 μ L のメディアに 50 μ L) 後、最終的な薬物濃度になります: フォルスコリン 10 μ M、IBMX 100 μ M、VX770 1 μ M、Inh172 10 μ M。 - キャンプのみ、唯一フォルスコリン/IBMX を追加します。
- キャンプ + VX770 は、2 分後、フォルスコリン/IBMX 最初、VX770 を追加します。
- 抑制に対しては、Inh172 を追加、まずフォルスコリン/IBMX 2 分後。
- 200 μ L ピペットを使用して、マトリックスを邪魔しないように世話井戸内メディアに適切な刺激薬の 50 μ L を追加します。
- 刺激した直後後、回転楕円体 1 h のタイムラプス イメージングによる膨潤を監視します。ソフトウェアで、「イメージ キャプチャ」をクリックしてします。「タイムラプス」をクリックし、30 秒、持続時間 60 分適切な名を入力して「保存」をクリックして微速度撮影を開始する間隔を設定します。
注: 標準のタイムラプスはすべて 30 単一の回転楕円体の画像をキャプチャする高品質ビデオを確保するため s。また、(例えば4 X)、全体をしっかりと少ない画像必要な場合の低倍率キャプチャを実行します。自動ステージを使用する場合は、あらかじめ定義された座標を使用してすべての回転楕円体のタイムラプスを実行します。それ以外の場合、腫れの質的な見直しを提供し、体系的な問題がない (例えば、井戸から行列剥離)、イメージング中に回転楕円体のサブセットのタイムラプスを使用します。 -
すぐに 1 h タイムラプス画像が完了したら、すべての回転楕円体 (1 ステップ 9.5) あたりの後刺激画像をキャプチャ手順 9.5.3 で作成したマップを使用します。
- 前刺激画像 (セル、回転楕円体、または破片を大きく周囲の焦点の品質は、このプロセスを促進する) フォロー アップの画像の焦点の同じ平面を使用するを参照してください。
- 9.5.4 (例えば、回転楕円体 1 後刺激) のステップから対注釈ファイルを保存します。
注: 回転楕円体が膨張するのにつれ、タイムラプスの直後にこの手順を完了します。
- 新鮮な分化のメディアでも、イメージでメディアを交換してください。
- 各井戸/条件、実験条件に示されているように、刺激薬を調整する手順 9.5 9.9 を通じてを繰り返します。
- すべてのイメージングが完了すると、回転楕円体を 37 ° C、5% CO2インキュベーターに返します。
注: に応じて培養顕微鏡室の不妊、回転楕円体の後刺激汚染が非常に一般的ですることができます。交差汚染のリスクを最小限に抑えるため、別のインキュベーターでイメージ化された回転楕円体を保存するか、画像の直後に回転楕円体を破棄します。
10. HNE 回転楕円体画像を分析します。
- キャプチャされたすべての画像を画像解析ソフトと互換性のある形式にエクスポートします。ソフトウェアで、「表示」、「エクスポート」にカーソルを置きますをクリックし、「既定のビューのすべての画像を TIFF...」を選択します。ハード ディスク ドライブまたはフラッシュ ドライブ分析のために保存します。
注: A 商業分析ソフトウェア (材料表) および .tiff ファイルよく実行し、他のプラットフォームを使用して、解析を実行することができますが、ここで説明します。ファイルの名前付け、画像解析スタッフは、盲検で実験の条件が同等の分析を確保するためペア (前と後の刺激) 画像の認識する必要があります。 -
解析ソフトウェアを使用すると、各回転楕円体イメージの内腔領域を表し、データ解析ソフトウェアにエクスポートします。
- オープンな分析ソフトウェア。「ファイル」をクリックし「開く」と回転楕円体の画像を含むファイルのフォルダーに移動します。分析のためのすべての画像を選択し、「開く」をクリックします。
- 「測定」をクリックし、「地域測定」を選択します。領域測定] ダイアログ ボックス内で droptab の「設定」を選択、「イメージ名」と「地域」のボックスが確認します。
- 「ログ」をクリックし、「データ ログを開く」を選択します。ファイルをクリックして"OK"データ ログ対話ボックスと名に応じて (例えば条件 X、日付)。すべての測定値をスプレッドシートに転送されます。
- 「トレース地域」ツール ボタンを選択し、分析ため最初イメージの回転楕円体内腔慎重にトレース。領域測定ダイアログ ボックスで Excel に測定を記録する「ログ データ」をクリックしてします。
- 手順 10.2.2-10.2.4 を繰り返してすべての回転楕円体を分析します。
- 変化率を計算する (100 * [ポスト スティミュラス ベースライン] ÷ 基準) それぞれの個々 の回転楕円体のベースラインから内腔領域でペアをイメージし、分析用のデータをコンパイルします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HNEs が培養皿に添付し、細胞播種; の 72 時間以内の小さな島々 を形成それぞれ図 1 a 1 b、1 週間で良いと貧しい島形成の例のとおりです。これらの島々 を 15-30 日のコース料理をカバーするため展開する必要があります。小規模または次善のサンプルは、かかることがあり、しばしば便利な回転楕円体は得られません。感染性病原体による汚染は、深い黄色/曇りメディア、培養皿にアタッチする細胞の障害および/または菌類・細菌の直接可視化によって証明されます。任意の汚染された文化は、クロス汚染を避けるために直ちに破棄しなければなりません。
基底膜マトリックスにおける文化の最初の 3-4 日内小嚢胞構造はマトリックス内のフォームが開始されます。これらは、薄い壁と内腔表面を示すそのまま回転楕円体に約 10 日間で成熟します。前述の電力密度でメッキ、成功した文化にマトリックス ドロップあたり 50-100 回転楕円体が含まれます。ルーメン (図 1) を比較的はっきり可能性がありますまたは細胞の残骸と粘液 (図 1)。前者は野生型 CFTR (wtCFTR) を回転楕円体と CF 回転楕円体では後者の方が一般的です。図 1と1 Dの回転楕円体の内腔領域を記述するマスキング図 1Eと1 階、それぞれ示されています。悪い形成/失敗した回転楕円体の文化の例としては、図 1と1 Hで提供されます。
野生型および F508del CFTR ホモ HNE 回転楕円体の代表的な機能データはそれぞれ図 2 aおよび2 bに示すようにこのデータは、代表 > 野生型および F508del CFTR ホモ科目30の 10 のユニークな HNE サンプル。一言で言えば、「CFTR 機能と回転楕円体は、それらの少ない、機能不全の CFTR うねりうねりまたは縮小可能性があります。WtCFTR 患者から回転楕円体が 1 時間以上うねり必要があります具体的にはときとうねりの少ないか、縮小する CFTR 阻害剤 Inh172 の存在下で刺激刺激します。逆に、件名 F508del CFTR のホモから回転楕円体を縮小するべきであるかまたはうねり非常にわずかに増加した腫れ (またはより少なく縮小) 薬理 CFTR 変調器 VX809、VX770 を修正。回転楕円体信頼性両方内と同じ遺伝子型の被験者間の前の分析は、CFTR 遺伝子型と反復測定30のささやかな可変性の機能的分離を示しています。
| メディア コンポーネント | 原液 | 量 | ストレージ |
| 拡張メディア | |||
| DMEM/F-12 栄養混合物「ベース メディア」 | そのまま使用 | 2 x 500 mL 容器 | メーカー期限まで 4 ° C で保存します。 |
| ウシ胎児血清 | そのまま使用 | 50 mL | メーカー期限まで-20 ° C で保存します。 |
| コレラ毒素 | 滅菌水 1 mL に 10 mg | 1 Μ L | 6 ヶ月間に-20 ° C で在庫を蓄える |
| 表皮の成長因子 | 1 mL の滅菌水に 500 μ g | 20 Μ L | 6 ヶ月間に-20 ° C で在庫を蓄える |
| ヒドロコルチゾン | 400 μ L の滅菌水で 0.4 mg | 全体 400 μ 因数 | バッチごとに新鮮なを確認します。メーカー期限まで室温で粉体を保存します。 |
| アデニン | 1 mL の滅菌水に 24 mg | 全体 1 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。メーカー期限まで室温で粉体を保存します。 |
| Y-27632 | 1 mL の滅菌水で 3.2 mg | 全体 1 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉製造元有効期限まで-20 ° C で保存します。 |
| 抗生物質のメディア | |||
| アムホテリシン B | そのまま使用 | 1.2 mL | メーカー期限まで 4 ° C で保存します。 |
| セフタジジム | 1 mL の滅菌水に 15 mg | 全体 1 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉製造元有効期限まで-20 ° C で保存します。 |
| トブラマイシン | 1 mL の滅菌水に 15 mg | 全体 1 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉製造元有効期限まで-20 ° C で保存します。 |
| バンコマイシン | 1 mL の滅菌水に 15 mg | 全体 1 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉製造元有効期限まで-20 ° C で保存します。 |
表 1: コンポーネントの拡大と抗生物質のメディア。
| メディア コンポーネント | 原液 | 量 | ストレージ |
| DMEM/F-12 栄養混合物「ベース メディア」 | そのまま使用 | 2 x 500 mL 容器 | メーカー期限まで 4 ° C で保存します。 |
| Ultroser G | 凍結乾燥 Ultroser G のシングル、20 mL のボトルの滅菌蒸留水 20 mL | 全体 20 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉体メーカー期限まで 4 ° C で保存します。 |
| 胎児クローン II | そのまま使用 | 20 mL | メーカー期限まで-20 ° C で保存します。 |
| ペン連鎖球菌 | そのまま使用 | 10 mL | メーカー期限まで-20 ° C で保存します。 |
| 牛の脳抽出物 | そのまま使用 | 2.48 mL | メーカー期限まで-20 ° C で保存します。 |
| トランスフェリン | そのまま使用 | 250 Μ L | メーカー期限まで-20 ° C で保存します。 |
| インスリン | そのまま使用 | 250 Μ L | メーカー期限まで-20 ° C で保存します。 |
| エタノールアミン | そのまま使用 | 15 Μ L | メーカー期限まで常温で保存します。 |
| エピネフリン | 1 ml の滅菌水に 2.75 mg | 全体 1 mL 分注 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉体メーカー期限まで 4 ° C で保存します。 |
| トリヨードサイロニン | DMSO の 50 μ L で 8.4 mg | 全体の 50 μ 因数 | バッチごとに新鮮なを確認します。粉製造元有効期限まで-20 ° C で保存します。 |
| ヒドロコルチゾン | エタノール 1 mL に 7.24 mg | 1 Μ L | 6 ヶ月間に-20 ° C で在庫を蓄える |
| Phsophoryletheanolamine | 1 mL の滅菌水に 35.25 mg | 1 Μ L | 6 ヶ月間に-20 ° C で在庫を蓄える |
| レチノイン酸 | 1 ml の DMSO の 3 mg | 1 Μ L | 6 ヶ月間に-20 ° C で在庫を蓄える |
表 2: 分化培地のコンポーネント。
図 1: HNE 拡張、HNE 回転楕円体の構造特性。めっき後 7 日間を撮影 HNE 拡張文化の明視野画像を示す成功 (白い矢印パネルA) とフィーダー線維芽細胞の背景に失敗 (パネルB) HNE コロニー形成。成功した wtCFTR と F508del ホモ回転楕円体は、それぞれCとDのパネルに表示されます。C/D から回転楕円体の内腔領域を記述するマスキング パネルEおよびFでそれぞれ提供されます。失敗した回転楕円体の文化、まとまりのない小さな細胞の残骸 (パネルG) によって特徴付けられるおよび/またはセル (パネルH) の塊を解体しました。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: HNE 回転楕円体の機能特性。単一ドナー、フォルスコリン/IBMX CFTR 阻害剤 Inh172 はパネル (A) に示すように各ポイントの存在なしで刺激したときから wtCFTR 回転楕円体の代表的な機能の反応は、単一回転楕円体の応答を表します。単一ドナー、フォルスコリン/IBMX VX809、VX770 の存在有無で刺激したときから F508del ホモ回転楕円体の代表的な機能の反応は、(B) パネルに表示されます。誤差 = SEM. * * p < 0.01;p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルでは、患者由来鼻細胞スフェロイド培養「CFTR 機能個別の特定モデルを生成することができるの生成について説明します。難しさを避けるために密接に出席する必要がありますプロセスでいくつか重要な手順があります。まずは患者さんの鼻から良いサンプル集録です。良いサンプルがあるはず > 50,000 セルは、粘液/破片の限定および 4 時間以内 (ただし、成功は、一晩氷で送料も簡単に達成) を処理するために準備ができています。研究スタッフがブラシやキュレット検体身につける練習は彼らの慰めを最大にする 1 つまたは 2 つのプロバイダーの手に初期サンプルの取得に焦点を当て、促進が必要です。ティッシュ文化のすべての手順の 2 番目、良いクリーン/生殖不能の技術は不可欠です。すべて HNE 文化のため、我々 の経験で、障害が発生したプライマリ ・ モードは、主なサンプルとインキュベーターの他の成長の文化の両方を複雑にすることができます細菌や真菌の汚染です。このリスクの慢性感染症 (例えばCF) 被験者の文化とだけ増加、したがって成功ヒンジ主かつ独立した文化を維持する能力。私達の練習は不注意な汚染から成功した、古い文化を保護する最初の 5-7 日以内に感染症を起こしやすいカルチャに対してのみ別 1 インキュベーターを保つことです。第三に、密接に拡張段階で細胞を見るし、overconfluence を避けるために重要です。細胞をプレートに完全合流点に到達する許可する場合文化、か老年期、細胞が死ぬし、デタッチし始める危険性があります。最後に、回転楕円体として細胞をめっきするとき、マトリックスから細胞を分散させるため、プレートに等間隔サンプルは重要です。どちらかに- または下-population マトリックス滴の失敗につながる文化、細胞の大きな塊成功した回転楕円体は生成されません。
このプロトコルを実装しながら調べ、いくつかの一般的な問題があります。汚染、前述のように、最高粘液ときれいな培養技術なしの良い初期サンプルの調達から敬遠です。文化も拡大、成功したが、差別化された球を形作らなかったが場合、は、いくつかの問題が発生しました。空主マトリックスがある場合それはほとんどの細胞が播種密度; 低すぎます。2 回目以降の播種密度を約 20% 増します。逆に、「ダーティ」豊富な細胞の残骸とするマトリックスが表示された場合は、細胞があまりにもに播種した可能性が高密度、およびその後の播種密度を約 20% 削減を使用する必要があります。給餌とメンテナンス後の一般的な合併症は、マトリックスを培養器からの剥離です。これは過度に積極的なメディア交換によって引き起こされる、慎重にし、手動で 1 mL ピペット、壁吸引しないとメディアを変更することによって避けることができます。発生した場合、球も刺激し、イメージ、これがマトリックス「山車」井戸井戸内回転楕円体の慎重なマッピングを施行したイメージング中に困難かもしれないことができます。
捜査官が彼らのラボのニーズに応じて、プロトコルをいくつかの変更を追求しています。回転楕円体の高解像度イメージングのため我々 は以前 35 mm ガラス底培養皿またはチャンバー スライドを含む光学ガラス オプション 4-ウェル プレートを置き換えられます。これは回転楕円体、高解像度、ライブ イメージングにより、スループットを減らすことができます。また、スループットを向上させる、他の船舶 (例えば、 24 ウェル培養皿) にマトリックス内のセルの小さい因数をシードできます。我々 の経験で回転楕円体は、井戸の底にシートを形成するのではなく「液滴」の形でマトリックスと最もよく育つ私たちは最高を持っているなど、少なくとも 25 μ L. 捜査官の液滴と成功はメディアで希釈することによってマトリックスの密度を変更するかもしれません。これはアッセイのコストの改善、必要なマトリックスの合計量が減少します。また、しかし、回転楕円体組成を変更この可能性があります。以前の経験では、基底膜マトリックスの鉛の濃度は「セル アペックス アウト」形態の回転楕円体の部分的または完全な形成と、回転楕円体構造を変更。など、機能テストを試みる前に、形態マトリックス濃度の任意プロトコルによって生成された回転楕円体を慎重に評価する必要があります。最後に、異なる刺激または抑制薬、これらの薬の濃度を用いることが。フォルスコリン、IBMX、Inh172 アリ文化31の前の経験に基づいてこれらの濃度で当社の調査のために選ばれました。他の薬 (例えば、イソプロテレノール刺激を阻害する GlyH101) を使用してより良い治験責任医師の調査に適用場合があります。同様に、フォルスコリン、IBMX、または Inh172 の濃度の異なるを使用してアッセイのダイナミック レンジを変更可能性があります、しかし、我々 体系をテストしていないこれらのオプション。
既存前のヴィヴォ患者由来 CFTR の試金の数を考えると、記述されているモデルは、いくつかの主な理由の特徴です。まず、呼吸器の組織の簡単に得られるソースとして鼻の細胞を活用します。HNE 調達はほとんどあらゆる設定で最小限のトレーニングで安全に実行できます (クリニック、または、研究訪問) すべての年齢25で。これは堅牢なサンプル調達を容易にし、成長の難易度や汚染のため必要に応じてサンプリングを繰り返します。腸 organoids に比べて、HNE 回転楕円体が少なくよく特徴付けられるし、現在の形で小さいダイナミック レンジを持ちながら、GI 組織ではなく呼吸器を使用する主な利点いくつかの CF の病のドライバー (例えばとして表示されます。粘液線毛クリアランス、上皮性ナトリウム チャネル式) 腸内で同じではありません。HNE 細胞の平面、アリ ・文化に関係なく、回転楕円体は速く成長しているし、電気生理学だけで32より関連性の高いことができる生理的過程 (流体の恒常性) を測定、生体内での条件のより代表的があります。サンプル調達からテストまでの時間を改善することによって文化の成功の可能性を増加させる潜在的な汚染が減少します。最後に、モデルの 3 次元の性質は小説やアリの文化 (例えば、内腔の粘液を追跡、分化、急速な研究で実現可能ではない気道の開発または形態の研究の相補ラインに従うかもしれませんなど)。
「CFTR 機能の試金として HNE 回転楕円体複数制約があります。まず、このアッセイ比較的低スループットのままです。現在のメソッドを使用すると、画像取り込み文化条件ごとに 1 時間以上かかるし、分析は、1 つの条件でさらに 20-30 分。これは、(図 2 aに示すよう)、測定 (重複している自体では、このアッセイの感度の限界を示すことも) の大きい数を要する特定の条件間の重複の度合いによっては悪化します。そのため、4-6 条件を持つ単一の実験完了ほぼ 2 日間が必要です。自動化された画像のキャプチャと分析の手法によって、スループットを改善できます。このような適応は現在進行中です。第二に、このモデルでは、大量のマトリックスは、高価になることができますが必要です。前述したように、行列の希釈はこの障壁を克服するに役立つことがありますが、回転楕円体の形態の変化で成長マトリックスは可能性の変化として、注意して撮影する必要があります。第三に、このモデルは回転楕円体の単位のみ、XY 平面と Z 面内、バイアスを引き起こす可能性があります腫れ無視に依存しています。以前の再現性の解析は安心されているが、この欠点を自動化イメージングの使用によって克服できる Z 平面スキャン ボリューム30を計算すると。最後に、そして最も重要なは、個々 の被験者の体内薬物応答レスポンス回転楕円体をネクタイに大規模な仕事はまだ完了します。この相関関係の不在で - を約束しながら、モデルの予測値は不明です。
HNE 回転楕円体の生成・解析 CFTR の個々 の活動の変調は、薬剤応答の前臨床モデルとして有用である可能性があります最終的にex vivo解析を可能にします。さらに、CF 疾患重症度に大規模な変動を考えると、このような個別モデルは被写体のユニークな気道微小環境への洞察を提供できます。この方法でこのようなモデルは広い CFTR 生物学や疾患の多様性を理解することで援助の研究の役に立つかも個別の「CFTR 機能他同様のモデルと同様に、このモデル将来の使用、クリニックで CFTR 生物学演習では、およびパーソナライズされたドライブへ理解を深めるための約束と精密医学を保持します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、嚢胞性線維症財団治療によって支えられた、数 CLANCY14XX0 を付与し、嚢胞性線維症財団を通じて付与数 CLANCY15R0。患者の募集と規制監督で彼女の援助のクリスティーナ レイを感謝致します。また、著者は HNE ワーキング グループは、嚢胞性線維症財団、HNE 文化機能の世代の支援者に支えを感謝したい: プレストン Bratcher カルバン綿、マルティナ ・ Gentzsch、エリザベス Joseloff、マイケル ・ Myerburg、デイブ ・ ニコルズスコット ・ ランデル、スティーブ Rowe、G. マーティ ソロモン、キャサリン Tuggle。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf Tube | USA Scientific | 4036-3204 | |
| 150 mL Filter Flask | Midsci | TP99150 | To filter Media |
| 15 mL Conical Tube | Midsci | TP91015 | |
| 1 L Filter Flask | Midsci | TP99950 | To filter Media |
| 35 mm Glass-Bottom Dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | Optional |
| 3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) | Fisher Scientific | AC228420010 | Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO |
| 50 mL Conical Tube | Midsci | TP91050 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies, Inc. | AT-104 | Cell detachment solution |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786-25G | See Table 1 |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A9528-100MG | See Table 1 |
| Bovine Brain Extract (9mg/mL) | Lonza | CC-4098 | See Table 2 |
| Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | C3809-1G | See Table 1 |
| Cell Scrapers 20 cm | Midsci | TP99010 | |
| CFTR Inh172 | Tocris Bioscience | 3430 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO |
| Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) | Sigma-Aldrich | C8052-.5MG | See Table 1 |
| CYB-1 | Medical Packaging Corporation | CYB-1 | Cytology brush |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D5879-500ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes | Life Technologies | 11330-057 | Base Medium; See Tables 1 and 2 |
| Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) | Thermo Fisher Scientific | PHG6045 | See Table 1 |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4250-1G | See Table 2 |
| Ethanol | Fisher Scientific | 2701 | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E0135-500ML | 16.6 mM solution; See Table 2 |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | TCI America | E0084 | |
| Fetal Bovine Serum (high performance FBS) | Invitrogen | 10082147 | See Table 1 |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886-50 | Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO |
| Growth Factor-Reduced Matrigel | Corning, Inc. | 356231 | Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL. |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 1483 | |
| Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) | Advanced BioMatrix | 5007-A | Collagen solution |
| HyClone (aka FetalClone II) | GE Healthcare | SH30066.03HI | See Table 2 |
| Hydrocortisone | StemCell Technologies | 07904 | See Tables 1 and 2 |
| Insulin, human recombinant, zinc solution | Life Technologies | 12585014 | 4 mg/mL solution; see Table 2 |
| IVF 4-Well Dish, Non-treated | NUNC (via Fisher Scientific) | 12566350 | 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate |
| MEF-CF1-IRR | Globalstem | GSC-6001G | Irradiated murine embryonic fibroblasts |
| Metamorph 7.7 | Molecular Devices | Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote | |
| Olympus IX51 Inverted Microscope | Olympus Corporation | Discontinued | Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/ for a quote |
| Pen Strep | Life Technologies | 15140122 | See Table 2 |
| Phsophoryletheanolamine | Sigma-Aldrich | P0503-5G | See Table 2 |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | See Table 2 |
| Rhinoprobe | Arlington Scientific, Inc. | 96-0905 | Nasal curette |
| Slidebook 5.5 | 3i, Intelligent Imaging Innovations | Discontinued | Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | |
| Sterile Water | Sigma-Aldrich | W3500-6X500ML | |
| Tissue Culture Dish 100 | Techno Plastic Products | 93100 | Tissue culture dish for expansion |
| Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014-100MG | See Table 1 |
| Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) | Lonza | CC-4205 | See Table 2 |
| Triiodothryonine | Sigma-Aldrich | T6397-1G | 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt [T3]; See Table 2 |
| Trypsin from Porcine Pancreas | Sigma-Aldrich | T4799-10G | |
| Ultroser-G | Crescent Chemical (via Fisher Scientific) | NC0393024 | 20 mL lypophilized powder; See Table 2 |
| Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis | Sigma-Aldrich | V2002-5G | See Table 1 |
| VX770 | Selleck Chemicals | S1144 | Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO |
| VX809 | Selleck Chemicals | S1565 | Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO |
| Y-27632 Dihydrochloride ROCK inhibitor | Enzo LifeSciences | ALX-270-333-M025 | See Table 1 |
References
- Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
- Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
- Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
- Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
- Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
- De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
- Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
- Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
- CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
- Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
- Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
- Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
- Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
- Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
- Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
- van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
- Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
- Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
- Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
- Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
- Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
- Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
- Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
- Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).
