Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Generering av menneskelig nese tarmepitelet Spheroids for individualisert cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator studie

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Her beskriver vi en metode for å generere tredimensjonalt formet kulturer av menneskelig nese epitelceller. Spheroids deretter stimulert til stasjonen cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR)-avhengige ion og væske sekresjon, kvantifisere endringen i spheroid luminal størrelsen som en proxy for CFTR funksjon.

Abstract

Mens innføring av cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator (CFTR) modulator narkotika har revolusjonert omsorg i cystisk fibrose (CF), har genotype rettet terapi modellen er i bruk flere begrensninger. Første, sjeldne eller lite studert mutasjon grupper utelates fra definitive kliniske studier. Videre, som ekstra modulator narkotika inn markedet, vil det bli vanskelig å optimalisere modulator valgene for en enkelt emne. Begge disse problemene er adressert med bruk av pasient-avledede, individualisert prekliniske modellsystemer av CFTR funksjon og modulering. Menneskelige nese epitelceller (HNEs) er en lett tilgjengelig åndedretts vev for slik modell. Her beskriver vi generering av en tredimensjonal spheroid modell av CFTR funksjon og moduleringshjul bruker primære HNEs. HNEs er isolert fra fag i en minimalt invasiv måte, utvidet i betinget omprogrammering forhold, og sådd i spheroid kulturen. Innen 2 uker til såing, formet kulturer generere HNE spheroids som stimuleret med 3', 5'-sykliske adenosin monofosfat (cAMP)-generere agonister aktiverer CFTR-funksjonen. Spheroid hevelse er deretter kvantifisert som en proxy av CFTR aktivitet. HNE spheroids kapitalisere på minimal invasiv, men åndedretts opprinnelsen til nasal celler til å generere en tilgjengelig, personlige modell relevant for en epitel reflekterer sykdom sykelighet og dødelighet. Sammenlignet med luft-flytende grensesnitt HNE kulturer, er spheroids relativt rask modne, noe som reduserer den totale forurensning hastigheten. I sin nåværende form, er modellen begrenset av lav overføringshastighet, men dette er oppveid av relativt enkel vev oppkjøpet. HNE spheroids kan brukes til å pålitelig kvantifisere og karakterisere CFTR aktivitet på individnivå. En pågående studie å knytte denne kvantifisering i vivo narkotika svar vil avgjøre hvis HNE spheroids er en sann prekliniske prediktor for pasient svar CFTR modulering.

Introduction

Cystisk fibrose (CF) er en dødelig, autosomalt recessiv sykdom påvirker over 70.000 mennesker over hele verden1. Dette livet-forkorte genetisk sykdom er forårsaket av mutasjoner i den cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator protein (CFTR)2. CFTR er medlem av adenosin trifosfat bindende kassett familien, og funksjoner som en ion kanal tillater bevegelse av klorid og bikarbonat over apikale membraner av flere polarisert epithelia inkludert mage-tarmkanalen, svette kjertel, og respiratoriske treet, blant annet3,4. Som sådan, fører dysfunksjonelle CFTR til multisystem epithelial dysfunksjon, med de fleste dødelighet stammer fra luftveissykdommer1. I CF lungene, tap av CFTR-drevet airway overflaten flytende (Oh) regulering og Slim release fører til tykkere slim, luftveisobstruksjon, kronisk infeksjon, og progressiv airway remodeling og tap av lunge funksjonen1,5.

Til tross for identifisering av CFTR dysfunksjon som forårsaker sykdom terapi i CF tradisjonelt fokusert på klimatiltak symptomer (f.eks, bukspyttkjertelen enzym erstatning terapi, airway klaring terapi)1. Denne tilnærmingen ble nylig revolusjonert av advent av romanen therapeutics, kalt "CFTR modulatorer," som direkte mot dysfunksjonelle CFTR. Denne tilnærmingen har flyttet klinisk landskapet fra symptom ledelse til endring av sykdom omsorg men bærer flere begrensninger6,7,8,9,10. Modulator aktivitet er spesifikke for protein feilen følger hvert CFTR mutasjon og begrenset å velge genetiske bestander11. Denne begrensningen er drevet av heterogene natur protein defekter, men også av upraktisk av kliniske studier i sjeldne mutasjon grupper. I tillegg emner med godt studert genotyper (f.eksF508del/F508del CFTR, den vanligste CFTR mutasjonen), er det bred variasjon i sykdom byrde og modulator svar6,7,8 ,9,11.

For å overvinne begge disse problemene, har etterforskere foreslått bruk av personlige modeller for prekliniske tester12. Dette konseptet benytter pasient-spesifikke vev for å generere en individualisert ex vivo modellsystem for sammensatte testing, forutsi i vivo emnet respons på behandling på en personlig måte. Når godkjent, kan slik modell brukes av klinikere å kjøre presisjon terapi uansett pasientens underliggende CFTR genotype.

Menneskelige bronkial (HBE) epitelceller innhentet fra explant vev ved lungetransplantasjon etablert muligheten for slik modell for CF13,14. HBEs dyrket ved et luft-flytende grensesnitt (ALI) tillate funksjonelle CFTR kvantifisering direkte gjennom electrophysiologic testing, eller indirekte gjennom tiltak ASL homeostase13,15. Denne modellen har vært avgjørende for å forstå CFTR biologi og var en sentral pådriver i utviklingen av CFTR modulatorer16. Dessverre er HBE modeller ikke troverdig som en personlig modell invasiv art på (lungetransplantasjon eller bronkial penselen) og mangel på prøver for de med sjeldne mutasjoner eller mild sykdom. Derimot kan tarmen tissue, fra endetarms eller duodenal biopsi prøver, brukes for intestinal gjeldende måling (ICM) eller en hevelse-baserte organoid analysen for å studere individualisert CFTR funksjonen17,18, 19. Organoid analyser, spesielt er svært følsomme modeller av CFTR aktivitet20,21,22. Begge modellene er begrenset av vev kilden (tarmen tissue, mens de fleste sykdom patologi er åndedretts) og semi invasiv metode for oppkjøpet. Eventuelt har flere etterforskere studert menneskelige nese (HNE) epitelceller modell CFTR restaurering23,24,25. HNEs kan høstes trygt med pensel eller utskrapning i fag i alle aldre og når kultivert i ALI, recapitulate mange egenskaper HBEs25,26,27,28. HNE monolayer kulturer har tradisjonelt vært begrenset av plateepitel transformasjon og lang tid forfall29. Dessuten rapporterte kortslutt gjeldende mål i HNEs er mindre enn de i HBEs, foreslå et mindre vindu å oppdage terapeutiske effekten25.

Gitt behovet for en personlig, ikke-invasiv, luftveier vev kultur modell av CFTR funksjonen, forsøkte vi å flette følsomheten til en hevelse-basert, organoid analysen med HNEs ikke-invasiv og respiratoriske natur. Her beskriver vi vår metode generere 3-dimensjonale "formet" kulturer av HNEs for individuell CFTR studier i en hevelse-baserte analysen30. HNE spheroids polarize pålitelig med epithelial apex mot sfære senter, eller lumen. Denne modellen viser mange kjennetegner en nedre luftveier epitel og modnes raskere enn ALI kulturer. Som en funksjonell analysen kvantifisere HNE spheroids pålitelig en rekkevidde av CFTR funksjonen, samt moduleringshjul i godt studert mutasjon grupper (f.eksF508del CFTR). Denne hevelse-baserte analysen kapitaliserer på ion/salt transport egenskapene for CFTR, indirekte måle væske tilstrømningen til formet som vann følger apikale salt middelklasseinnbyggere. På denne måten, stimulert spheroids med funksjonell CFTR svelle robust, mens de med dysfunksjonelle CFTR hovne mindre eller krymper. Dette er kvantifisert gjennom bildeanalyse av før og 1 time etter stimulering spheroids, måler luminal området og bestemme prosent endre. Dette tiltaket kan deretter sammenlignes over eksperimentell grupper til skjermen for narkotika bioactivity på en pasient-spesifikk måte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HNE prøver ble anskaffet fra fag rekruttert gjennom Cincinnati Children's Hospital Medical Center CF Research Center. Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Review Board (IRB) til Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Skriftlig samtykke ble innhentet fra alle fag før testing.

1. klargjør utvidelse medier og antibiotika medier

  1. Samle media-komponentene som er oppført i tabell 1. Tine frossen materialer ved romtemperatur og foreta nødvendige lager løsninger som vist i tabell 1 under "Utvidelse medier".
    Merk: Vær forsiktig når du håndterer kolera gift, som er giftig ved svelging, og er en hud, øyne og luftveier irriterende. Kontroller og kombinere alle løsninger og media ren vilkår i biosikkerhet kabinett.
  2. Bruker en 50 mL serologiske pipette, fjerne og kast 50 mL av base medium (Dulbecco endret Eagle Medium/F12) fra en beholder å kompensere for tillegg av andre materialer. Hell alle base medier for hånd i en autoklaveres 1 L glassflaske.
  3. Bruker en 50 mL serologiske pipette eller 1 mL pipette avhengig, overføre alle resterende komponentene fra delen "Utvidelse medier" i tabell 1 i autoklaveres glassflaske med media. Forsiktig swirl flasken hånd å blande.
  4. Filtrere media i en frisk og sterile 1 L, 0.22 µm polyethersulfone (PES) filter kolbe bruker produsentens instruksjoner og kommentere med "Utvidelse medier" og dato.
  5. Forberede antibiotika Media. Gjøre nødvendige antibiotika lager løsninger som vist i tabell 1 under "Antibiotika Media."
    1. Bruke en 50 mL serologisk pipette, overføre 150 mL utvidelse medier til en frisk 250 mL autoklaveres glassflaske.
    2. Bruker en 1 mL pipette, legge til alle komponenter fra delen "Antibiotika Media" i tabell 1 i autoklaveres glassflaske med media. Virvel hånd for å blande til media er uniform inne opptreden.
    3. Filtrere media i en frisk og sterile 250 mL, 0.22 µm PES filter kolbe bruker produsentens instruksjoner og kommentere med "Antibiotika Media" og dato.
  6. Lagre media på 4 ° C for opptil en måned, forkaster hvis skyet, tyder forurensning.

2. Forbered differensiering Media

  1. Samle media-komponentene som er oppført i tabell 2. Tine frossen materialer ved romtemperatur og foreta nødvendige lager løsninger som vist i tabell 2.
    Merk: Vær forsiktig når du håndterer retinsyre, som er en reproduktive giftstoffer, kan være giftig svelging, og fører hudirritasjon. Gjøre, aliquot, og kombinerer alle løsninger og media ren vilkår i biosikkerhet kabinett.
  2. Fjerne og slette 52 mL base medium fra en beholder å kompensere for tillegg av andre materialer. Hell alle base medier i en autoklaveres 1 L glassflaske.
  3. Bruker en 25 mL serologisk pipette eller 1-mL pipette avhengig, overføre alle resterende komponentene fra tabell 2 til autoklaveres glassflaske med media og virvel forsiktig hånd å blande.
  4. Filtrere media i en frisk og sterile 1 L, 0.22 µm polyethersulfone (PES) filter kolbe bruker produsentens instruksjoner og kommentere med "Differensiering Media" og dato.
  5. Lagre media på 4 ° C for opptil en måned, forkaster hvis skyet, tyder forurensning.

3. frakk kultur retter og tallerkenen mater fibroblaster

Merk: Utfør alle trinnene under ren i biosikkerhet kabinett.

  1. Bland 0,5 mL av kollagen lager og 37,5 mL sterilt vann i et 50 mL konisk rør.
  2. Pipetter 4-5 mL av kollagen løsning i hver ren P100 kultur parabol, sikrer hele overflaten er dekket.
  3. Dekker retter med lokk og ruge over natten på 37 ° C og 5% CO2.
  4. I fravær av smittefarlige stoffer skap, fjerne alle parabolen lokk. Swirl løsning å dekke parabolen, så Sug opp.
  5. Sterilisere ved eksponering for ultrafiolett (UV) lys for 1 h. sted dekslene tilbake på rettene, stabel og dekke retter med aluminiumsfolie.
  6. Store belagt retter på 4 ° C i 3-6 måneder, nytt sterilisering under UV-lys 15-30 min før celle kultur bruk.
  7. 24 timer før de kan få en HNE prøve, sterilisere en pre belagt parabol og etiketten som mus embryonale Fibroblast (MEF) og datoen.
  8. Legge til utvidelse medier for å dekke platen (ca 5 mL) med en serologiske pipette.
  9. Tine ampuller med 2 x 106 bestrålt MEFs i en 37 ° C waterbath. Så snart MEFs er tint, Legg halvparten av ampullen (ca. 106 celler) til parabolen med en 1-mL pipette, virvlende for hånd for å spre.
  10. Ruge på 37 ° C og 5% CO2 overnatter i forberedelse til HNE kultur.
    Merk: Om nødvendig trinn 3.7-3.10 kan utføres så sent som 60 min før plating celler, om natten er ideelt.

4. få og behandle HNE Sample

  1. Sikre IRB-godkjent samtykke/samtykke er innhentet for alle fag.
  2. Har pasienten blåse nesen fjerne løs slim.
  3. Visualisere mindreverdig Concha ved hjelp av en rhinoscope. Sikre ingen lesjonene eller polypper er gave som kan utelukke prøvetaking.
  4. Samle nasal celler fra det første neseboret utskrapning eller børsting.
    1. Utskrapning: Bend curette ved midtpunktet å lage en liten, ~ 135° vinkel med toppen fra VM curette. Curette inn i neseboret og fremme curette koppen under underlegen Concha. Forsiktig trykker curette cupen mot dårlig Concha og skrape den Concha ved å trekke curette fremover, gjentatt 3 - 4 ganger totalt.
    2. Pensel: Pass til Cytologi pensel nedenfor underlegen Concha, deretter snu og flytte penselen inn litt 4 - 5 ganger, uten å avslutte neseboret.
  5. Sted curette/pensel i en 15 mL konisk fylt med antibiotika Media. Gjenta trinn 4.3-4,4 for det andre neseboret, plassere curette/penselen i samme konisk rør.
  6. Lagre konisk på is til du er klar for behandling. Sikre at behandlingen skjer innen 4 h av prøven oppkjøp men kan oppstå så sent som 24 timer etter oppkjøpet hvis nødvendig.

5. prosessen og utvide HNE celler i retter

Merk: Utfør alle trinnene under ren i biosikkerhet kabinett.

  1. Bruke en 1-mL pipette og media fra prøven koniske, vask alle celler av curettes/cytologi børster i samme konisk rør. Når rene, forkaste curettes / børster.
  2. Sentrifuge konisk på 360 x g og 4 ° C i 5 minutter.
  3. Sug opp nedbryting, å ta vare ikke å forstyrre celle pellets.
  4. Nytt avbryte celle pellet 3 mL celle avdeling løsning, pipettering med 1 mL tips til homogenize blandingen.
  5. Sentrifuge konisk på 360 x g og 4 ° C i 5 minutter.
  6. Gjenta trinn 5.3-5.5 en gang.
  7. Sug opp gjenværende nedbryting, ta vare ikke for å forstyrre celle pellets.
  8. Å avbryte pellet 1 mL av antibiotika Media og telle celler med en hemocytometer.
  9. Bruker en 1-mL pipette, plate celler dropwise på bestrøket, fibroblast-seeded parabolen utarbeidet i trinn 3.10. Legge til antibiotika medier for å fullt ut dekke fatet og spre cellene over overflaten. Merk parabolen med innholdet og dato og ruge på 37 ° C og 5% CO2.
  10. Etter 48 timer, kontroller at cellene er knyttet til kultur parabolen. Sug opp media, og Erstatt med nok frisk antibiotika mediene til å dekke platen.
  11. Endre media 3 x ukentlige, aspirating gamle medier med vakuum linje og Pasteur pipette, og erstatte med nok frisk mediene til å dekke platen. Endre media til utvidelse medier, fortsetter å erstatte tre ganger ukentlig etter 5 dager på antibiotika.
    Merk: Forurenses er høy i første uke av kultur. Holde frisk prøver i en separat inkubator å minimere risikoen for kryss-kontaminering.
  12. Sjekk cellevekst flere ganger ukentlig. Når cellene er ca 70-80% confluent, fortsette å passering celler.

6. passasje HNE celler

  1. Forberede 0,1% Trypsin løsning ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
    Merk: Vær forsiktig håndtering trypsin, som er en hud, luftveier, og øyet irriterende.
    1. Vei 15 mg av trypsin fra svin bukspyttkjertelen i et konisk rør.
    2. Veie 56 mg av EDTA i et separat konisk rør.
    3. I biosikkerhet kabinettet, overføre trypsin og EDTA i en autoklaveres 250 mL glassflaske. Bruk en liten aliquot sterilt fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) skylle trypsin/EDTA rør for å sikre fullstendig overføring.
    4. Legge til sterilt PBS å ta løsningen totale til 150 mL. Lukk lokket tett.
    5. Inkuber trypsin løsningen i en 37 ° C waterbath til fullt ut oppløst. Kontroller hvert 15 min og fjern umiddelbart når oppløst.
      Merk: Ikke la ukontrollert lengre tid (f.eks over natten) trypsin i løsningen vil denature hvis oppvarmet for lenge.
    6. Rengjør flasken med 2-3 spray med 70% etanol og gå tilbake til fravær av smittefarlige stoffer skap.
    7. Filtrere 0,1% Trypsin-EDTA løsning i en frisk og sterile 250 mL, 0.22 µm PES filter kolbe bruker produsentens instruksjoner og kommentere innholdet og dato.
    8. Lagre trypsin-EDTA løsning på 4 ° C for opptil en måned, forkaster hvis skyet.
  2. Bringe differensiering Media, 0,1% Trypsin-EDTA løsning og sterile PBS til romtemperatur over 30 min. rene med 70% etanol og overføre til en ren biosafety kabinett.
  3. I fravær av smittefarlige stoffer skap, kan du bruke et vakuum linje og Pasteur pipette Sug opp og kaste media fra vev kultur parabol. Vask rett ved å legge til, virvlende og aspirating 5 mL av PBS med en ren serologisk pipette.
  4. Bruker en 5-mL serologisk pipette, legge til 5 mL 0,1% Trypsin-EDTA løsning vev kultur parabol og tilbake til inkubator på 37 ° C og 5% CO2 i 5 min.
  5. Visualisere celler i en invertert mikroskopet på 4-10 X. Kontroller at cellene koble fra parabolen, bli runde og flyter. Forsiktig Trykk på siden av kultur retten dislodge celler, og/eller å ruge for en ytterligere 5 minutter til de fleste celler, kobles.
    Merk: Ta forsiktig å raskt fjerne celler når løsrevet fra kultur parabol; langvarig eksponering for 0,1% Trypsin-EDTA vil svekke celle levedyktighet.
  6. Bruker en 10 mL serologisk pipette, legge til 5 mL utvidelse medier fatet og samle alle flytende innholdet (10 mL totalt) i en merket, sterile 50 mL konisk rør.
  7. Hvis celler forblir tilhenger til kultur parabol, Gjenta trinn 6,4 gjennom 6.6 til to ganger, samle innholdet i samme konisk rør.
    1. Hvis celler forblir tilhenger til kultur rett etter tre runder Trypsin løsning eksponering, bruk en steril celle skraper fjerner resten. Etter skrape fatet, vask skraper og parabolen med 5 mL utvidelse medier og samle i samme merket konisk rør.
      Merk: Hvis passaging til spheroids, endre denne fremgangsmåten for å utføre en differensiell trypsinization. Etter tilføyer trypsin løsning (trinn 6.4.), kontroller parabolen ofte til fibroblaster har enebolig (vanligvis 1-2 min), forlater bare mangekantet epitelceller knyttet til parabolen. Samle og sette dette supernatant, som kan være passaged frem for ekspansjon. Gjenta 6.4-6.6 bruke samme trypsin løsningen, og samle bare gjenværende epitelceller for spheroid kultur.
  8. Sentrifuge konisk 360 x g for 5 min og 4 ° C. Sug opp medier fra konisk.
  9. Resuspend celle pellet i 1 mL av utvidelse medier og antall celler ved hjelp av en hemacytometer.
  10. Når kvantifisert, celler kan inndeles eventuelt og passaged frem til en ny kultur parabol (inkludert utarbeidelse av fibroblast co kultur, trinn 3, og plating celler for ekspansjon, trinn 5.9-5,12) eller kultivert som spheroids (trinn 7).
    Merk: Hvis passaging til en ny kultur parabol for ekspansjon, en seeding tetthet med 0,5-1 × 106 celler i P100 parabol anbefales.

7. seeding celler for HNE Spheroid kulturer

Merk: Utfør alle prosedyrer i dette trinnet enn sentrifugering, i en ren biosafety kabinett.

  1. Tine kjelleren membran matrix på is per produsentens instruksjoner (100 µL per spheroid godt).
    Merk: Overvei sterilt 500 µL dele kjelleren membran matrisen mot; Dette beløpet vil frø en enkelt 4-vel-plate.
  2. Skille et passende antall ulikt trypsinized, passaged celler (fra trinn 6,9) for en siste konsentrasjon av 500.000 celler per mL av matrix. For en 4-vel plate, kan du bruke 200.000 celler. Samle i en 1,5 mL tube.
  3. Sentrifuge cellen og media blanding på 360 x g i 5 min på 4 ° C. Helt, men nøye Sug opp og forkaste medier med en 1 mL pipette, ta vare ikke for å forstyrre celle pellets.
  4. Bruker et 1 mL pipette tips, legge 100 µL per planlagt godt av kjelleren membran matrix til de 1,5 mL tuben som inneholder cellene. Holde røret på is.
  5. Pipetter opp og ned til nøye og grundig resuspend celler i kjelleren membran matrisen. Flytte raskt å unngå herding av matrix. Unngå fullstendig tømming pipette spissen å sikre luftbobler ikke er introdusert i matrisecelle/blandingen.
  6. Frø 100 µL matrix dele i hver brønn av en 4-vel IVF kultur plate.
    1. Med en ren saks, klippe av den distale 3-4 mm en 200 µL pipette tips.
    2. Bruker trimmet spissen, nøye Pipetter 100 µL av cellen/matrise blandingen i midten av hver brønn. Pipetter sakte, med mål om å gjøre en enkelt matrise "drop" midt i hver brønn. Slipp bør forbli sfærisk, og bør ikke berøres sidene av brønnen. Når du flytter platen, må du være forsiktig å unngå forstyrre disse dråper.
    3. Inkuber kjelleren membran matrix dråper på 37 ° C og 5% CO2 i 30 min, til solid.
    4. Nøye Pipetter 500 µL av differensiering Media i hver brønn, ta vare ikke for å forstyrre matrix drop. Kontroller at media bare dekke matrix slipp og legge mer om nødvendig.

8. skille og modne HNE Spheroids

  1. Bruker et 1 mL pipette tips, forsiktig Sug opp alle medier fra bra; unngå aspirating the matrix, som vil ødelegge spheroids i den delen av matrisen, selv om noen spheroids igjen kan være levedyktig.
  2. Bruker en fersk 1 mL pipette tips, forsiktig legge til 500 µL av differensiering media brønnen rundt matrix. Ikke trykk matrisen med pipette og unngå forstyrre matrix drop.
  3. Returner spheroids til inkubator på 37 oC og 5% CO2 for pågående vekst. Gjenta trinn 8.1 gjennom 8.3 tre ganger ukentlig.
  4. Evaluere spheroid morfologi daglig under en invertert mikroskop på 20 X. Spheroids skulle danne innen 3-5 dager plating og nå modenhet i ca 10 dager.

9. pretreat, stimulere og Image HNE Spheroids for analyse

  1. Pretreat spheroids som ønsket før bildebehandling som beskrevet tidligere30.
    Merk: For VX809 forbehandling, legge 3 µM av VX809 til media for 48-72 h før bildebehandling. Bland 1 µL av 10 mM VX809 lager (se Materialer tabell) i 3.3 mL av medier for denne konsentrasjonen.
  2. Endre hver brønn av spheroids til 1 mL av fersk differensiering medier, inkludert forbehandling (trinn 8.1-8.3) før imaging spheroids.
  3. Forberede frisk stimulering narkotika løsninger (Forskolin, 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], VX770 og CFTR Inhibitor 172 [Inh172]) fra aksjer (se Materialer tabell). For forskolin/IBMX, legge til 1 µL av hver aksje 98 µL av sterilt vann i en enkelt merket 1,5 mL tube. VX770 og Inh172, legge til 1 µL av hver aksje 99 µL av sterilt vann i separate merket 1,5 mL rør. Gjør et totalt volum gir 50 µL av løsning for hver godt testet. Utarbeide løsninger under sterile forhold i biosikkerhet kabinett.
  4. Overføre spheroid plate til en inkubert kammer 37 ° C og 5% CO2, montert på en invertert mikroskop utstyrt med elektronisk bilde fange programvare og en mekanisk scene for XY justering. Slå på mikroskopet og kameraet, samt tenkelig maskinen.
  5. Ta opprinnelige bilder av spheroids i en brønn.
    1. Åpne bildet fange programvare (Slidebook 5.5 for instruksjonene nedenfor). Når initialisert, kan du åpne en ny fil ved å klikke "Fil", deretter "Ny". Gi filen deretter og klikk "Lagre".
    2. Nøye fjerne kultur plate lokket og center en matrise dråpe over målet.
    3. Starter på toppen av matrix drop, gå i et rutenett for å finne spheroids på 20 x forstørrelse med i mikroskopet okularet. Fokusere opp og ned for å fange området på bredeste. Kommentere plasseringen av hver spheroid på et kart over matrix slippe til å identifisere etter bildebehandling.
    4. Klikk "Image-fange" i programvaren. For eksponering, velg "Manuelt" og angi 50 ms. sikre andre innstillinger som gjelder (Bin faktor: 1 x 1, W: 512, H: 512, X og Y-forskyvning: 0). Angi et passende navn for hvert bilde i "Navn"-boksen (f.eks Spheroid 1 planlagt). Klikk "Start" for å vise et levende bilde og "Lagre" for å få opprinnelige bildet.
    5. Gjenta trinn 9.5.1-9.5.4 til målet er nådd, eller hele matrix slipp er fotografert.
      Merk: Gruppe forskjeller kan oppdages med så lite som 3-5 spheroids per betingelse, men det har blitt vår praksis å image 10 eller flere spheroids per betingelse for å øke kraften. Variasjonen av analysen er vist i figur 2 i delen "Representant resultater" med prøver av 8-10 spheroids per emne som et eksempel.
  6. Stimulere spheroids.
    1. Bruker en 200 µL pipette, legge til 50 µL av aktuelle stimulering i media i brønnen, ta vare ikke for å forstyrre matrix.
      Merk: Etter denne 10 ganger fortynning (50 µL til 500 µL av media), den siste narkotika konsentrasjonen vil være: forskolin 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. For leiren bare, legge bare forskolin/IBMX.
    3. CAMP + VX770, legge til forskolin/IBMX først, deretter VX770 etter 2 min.
    4. Hemmet forhold, legge Inh172 første, så forskolin/IBMX etter 2 min.
  7. Umiddelbart etter stimulering, overvåke spheroid hevelse av timelapse tenkelig 1t. Klikk "Image-fange" i programvaren. Klikk "Timelapse", og angi intervallet 30 s, med en varighet på 60 min. gå inn et passende navn og klikk "Lagre" starte timelapse.
    Merk: Standard timelapse er å ta bilder av en enkelt-formet hvert 30 å sikre en høy kvalitet video. Eventuelt utføre lavere forstørrelse erobringen av hele brønnen (f.eks, 4 X) og færre bilder tatt hvis ønskelig. Hvis et automatisert Stadium, utføre timelapse av alle spheroids ved hjelp av forhåndsdefinerte koordinater; ellers bruk timelapse av et delsett av spheroids å gi en kvalitativ vurdering av hevelse og at ingen systematiske problemer oppstå under imaging (f.eks matrix løsgjøring fra brønnen).
  8. Ta umiddelbart etter stimulering bilder av alle spheroids (pr. trinn 9.5) ved ferdigstillelse av 1t timelapse bildet, bruker kart opprettet i trinn 9.5.3.
    1. Se pre stimulering bilder samme flyet av fokus brukes for oppfølging bilder (fokal kvaliteten på omkringliggende celler, spheroids eller rusk sterkt denne prosessen).
    2. Lagre filene med et par merknader fra trinn 9.5.4 (f.eks Spheroid 1 etter stimulering).
      Merk: fullfører dette trinnet umiddelbart etter timelapse, slik spheroids kan fortsette å svelle.
  9. Erstatte medier i den fotografert med fersk differensiering Media.
  10. Gjenta 9.5 gjennom 9,9 for hver brønn/tilstand, justere stimulering narkotika som indikert for eksperimentelle forhold.
  11. Når alle tenkelig er fullført, kan du returnere spheroids til inkubator på 37 ° C og 5% CO2.
    Merk: Avhengig av sterilitet av inkubert mikroskop kammeret, etter stimulering forurensning av spheroids kan være ganske vanlig. Enten beholde fotografert spheroids i en separat inkubator, minimere kryssforurensning risiko, eller kaste spheroids umiddelbart etter bildebehandling.

10. analysere HNE Spheroid bilder

  1. Eksportere alle bildene til et format som er kompatibelt med analyseprogramvare. Klikk "Se", hover over "Export", i programvaren, og velg "Standard visninger av alle bilder som TIFF...". Lagre på harddisken eller en flash-stasjon for analyse.
    Merk: en kommersiell analyseprogramvare (Tabell for materiale) og TIFF-filer gir gode resultater og er beskrevet her, selv om analyse kan også utføres ved hjelp av andre plattformer. Ved navngiving av filer, bør ansatte analysere bilder være blendet til eksperimentelle forhold, men over der bildene er sammenkoblet (før og etter stimulering) for å sikre tilsvarende analyse.
  2. Bruke analyseprogramvare, avgrense luminal området hvert spheroid bilde og eksportere til en dataanalyse programvare.
    1. Åpne analyseprogramvare. Klikk "Fil", deretter "åpne" og gå til mappen filen som inneholder spheroid bilder. Velg alle bilder for analyse og klikk "Åpne".
    2. Klikk "Tiltak" og velg "Regionen mål". I dialogboksen regionen målinger, Velg droptab "Configuration" og sikre "Image navnet" og "Området" er sjekket.
    3. Klikk "Log" og velg "Åpne Data Log". Klikk "OK" på Data dialog box og navnet loggfilen tilsvarende (f.eks, tilstand X, dato). Dette vil overføre alle målene til et regneark.
    4. Velg "Trace Region" verktøyet og nøye spore lumen av formet i det første bildet for analyse. Klikk "loggdata" for å logge målingen til Excel i dialogboksen regionen måling.
    5. Gjenta trinn 10.2.2-10.2.4 inntil alle spheroids er analysert.
  3. Beregner prosentvis endring (100 * [Post-stim - planlagte] ÷ planlagt) i luminal området fra grunnlinjen for hver individuelle spheroid image par og samle data for analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HNEs bør festes til kultur parabol og danner små øyene celler innen 72 timer av frø; Eksempler på god og dårlig øya formasjon på en uke er vist i figur 1A og 1B, henholdsvis. Disse øyene bør utvides til å dekke parabolen i løpet av 15-30 dager. Små eller suboptimal kan ta lengre tid, og ofte vil ikke gi nyttig spheroids. Forurensning med smittestoffer er dokumentert av dyp gul/skyet media, svikt i cellene knytte til kultur parabol, og/eller direkte visualisering av sopp/bakterier. Noen forurenset kulturer bør umiddelbart forkastes for å unngå kryss-kontaminering.

Innen 3-4 dager kultur i kjelleren membran matrix, skal små cystisk strukturer begynne å danne i matrisen. Dette vil modne over ca 10 dager i intakt spheroids viser en tynn vegg og en luminal overflate. Hvis belagt på beskrevet tetthet, inneholder vellykkede kulturer 50-100 spheroids per matrix slipp. Lumen kan være relativt klart (figur 1 c) eller fylt med mobilnettet rusk og Slim (figur 1 d); førstnevnte er mer vanlig i spheroids med vill-type CFTR (wtCFTR), og sistnevnte i CF spheroids. Maskering for å avgrense luminal området spheroids i figur 1 c og 1 D er demonstrert i figur 1E og 1F, henholdsvis. Eksempler på dårlig dannet/mislykket spheroid kulturer finnes i figur 1G og 1 H.

Representant funksjonelle data for wild type og F508del CFTR homozygous HNE spheroids vist i figur 2A og 2B. disse dataene er representant for > 10 unike HNE prøver i vill type og F508del CFTR homozygous fag30. Kort sagt, spheroids med funksjonell CFTR hovne opp, mens de med dysfunksjonelle CFTR svelle betydelig mindre, eller kan krympe. Spesielt spheroids fra fag med wtCFTR bør svulmer over en time når stimulert, og bør hovne mindre eller krymper hvis stimulert i nærvær av den CFTR inhibitor Inh172. Derimot spheroids fra et emne homozygous for F508del CFTR skal enten krype eller svelle veldig lett med økt hevelse (eller mindre krympende) når farmakologisk korrigert med CFTR modulatorer VX809 og VX770. Tidligere analyser av spheroid pålitelighet både innenfor og mellom fag av samme genotype demonstrere funksjonelle segregering av CFTR genotyper og beskjeden variasjon i gjentatte measures30.

Media-komponenter Lagerløsning Beløp Lagring
Utvidelse medier
DMEM / F-12 næringsstoff blanding "Base Media" Bruk som er 2 x 500 mL beholdere Lagre på 4 ºC til produsenten utløpsdato
Fosterets bovin Serum Bruk som er 50 mL Lagre på-20 º c til produsenten utløpsdato
Kolera gift 10 mg i 1 mL av sterilt vann 1 ΜL Lagre lager i-20 º c opp til seks måneder
Epidermal vekstfaktor 500 µg i 1 mL av sterilt vann 20 ΜL Lagre lager i-20 º c opp til seks måneder
Hydrocortisone 0,4 mg i 400 µL av sterilt vann Hele 400 µL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver ved romtemperatur til produsenten utløpsdato
Adenine 24 mg i 1 mL av sterilt vann Hele 1 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver ved romtemperatur til produsenten utløpsdato
Y-27632 3.2 mg i 1 mL av sterilt vann Hele 1 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på-20 º c til produsenten utløpsdato
Antibiotika Media
Amfotericin B Bruk som er 1.2 mL Lagre på 4 ºC til produsenten utløpsdato
Ceftazidime 15 mg i 1 mL av sterilt vann Hele 1 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på-20 º c til produsenten utløpsdato
Tobramycin 15 mg i 1 mL av sterilt vann Hele 1 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på-20 º c til produsenten utløpsdato
Vancomycin 15 mg i 1 mL av sterilt vann Hele 1 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på-20 º c til produsenten utløpsdato

Tabell 1: Komponenter ekspansjon og antibiotikaresistens.

Media-komponenter Lagerløsning Beløp Lagring
DMEM / F-12 næringsstoff blanding "Base Media" Bruk som er 2 x 500 mL beholdere Lagre på 4 ºC til produsenten utløpsdato
Ultroser-G 20 mL sterilt vann i en enkelt, 20 mL flaske lyofilisert Ultroser-G Hele 20 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på 4 ºC til produsenten utløpsdato
Fosterets klone II Bruk som er 20 mL Lagre på-20 º c til produsenten utløpsdato
Penn Strep Bruk som er 10 mL Lagre på-20 º c til produsenten utløpsdato
Storfe hjernen ekstrakt Bruk som er 2.48 mL Lagre på-20 º c til produsenten utløpsdato
Transferrin Bruk som er 250 ΜL Lagre på-20 º c til produsenten utløpsdato
Insulin Bruk som er 250 ΜL Lagre på-20 º c til produsenten utløpsdato
Ethanolamine Bruk som er 15 ΜL Lagre ved romtemperatur til produsenten utløpsdato
Adrenalin 2,75 mg i 1 ml av sterilt vann Hele 1 mL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på 4 ºC til produsenten utløpsdato
Triiodothyronine 8.4 mg i 50 µL av DMSO Hele 50 µL aliquot Gjør frisk med hvert parti. Lagre pulver på-20 º c til produsenten utløpsdato
Hydrocortisone 7.24 mg i 1 mL av etanol 1 ΜL Lagre lager i-20 º c opp til seks måneder
Phsophoryletheanolamine 35.25 mg i 1 mL av sterilt vann 1 ΜL Lagre lager i-20 º c opp til seks måneder
Retinsyre 3 mg i 1 mL av DMSO 1 ΜL Lagre lager i-20 º c opp til seks måneder

Tabell 2: Komponenter av differensiering Medium.

Figure 1
Figur 1 : HNE ekspansjon og strukturelle karakteristikker av HNE Spheroids. Brightfield bilder av HNE ekspansjon kulturer tatt syv dager etter plating demonstrere vellykket (hvit pil, panelet A) og mislykket (panel B) HNE kolonien formasjon på materen fibroblast bakgrunn. Vellykket wtCFTR og F508del homozygous spheroids vises i paneler C og D, henholdsvis. Maskering for å avgrense luminal området spheroids fra C/D er gitt i paneler E og F, henholdsvis. Mislykket spheroid kulturer er preget av små, uorganisert mobilnettet rusk (panel G) og/eller uorganisert klumper av celler (panel H). Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Funksjonelle egenskaper av HNE Spheroids. Representant funksjonelle svar av wtCFTR spheroids fra en enkelt donor, når stimulert med forskolin/IBMX med/uten tilstedeværelse av den CFTR inhibitor Inh172 vises i panelet (A) hvert punkt representerer svaret i en enkelt-formet. Representant funksjonelle svar av F508del homozygous spheroids fra en enkelt donor, når stimulert med forskolin/IBMX med/uten tilstedeværelse av VX809 og VX770 vises i panelet (B). Feilfelt = SEM. ** p < 0.01; p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledede nese formet cellekulturer kunne produsere en individualisert, bestemt modell av CFTR-funksjonen. Det er flere viktige trinn i prosessen som skal være tett deltok for å unngå problemer. Først er en god prøven oppkjøp fra pasientens nesen. Et godt eksempel bør ha > 50 000 celler, begrenset Slim/rusk, og være klar for behandling innen 4 timer (men suksess er også lett oppnåelig med overnatting shipping på is). Praksis å anskaffe prøver med curette eller børste av studien personale er nødvendig, som er tilrettelagt av fokus tidlig prøven oppkjøp i hendene av ett eller to leverandører å maksimere deres komfort. Andre, god ren/steril teknikk i alle vev kultur trinn er viktig. Den primære modusen for svikt, i vår erfaring, for alle HNE kulturer er bakterier og sopp forurensning, som kan komplisere både primære utvalget og andre voksende kulturer i inkubator. Denne risikoen øker bare med kulturer av pasienter med kronisk infeksjon (f.eksCF), derfor suksess hengsler hovedsak på evnen til å holde kulturer rent og separat. Vår praksis er å holde en inkubator separat for infeksjon utsatt kulturer innen 5-7 dager, beskytte eldre, vellykkede kulturer fra utilsiktet forurensning. For det tredje er det viktig å nøye se celler i fasen for ekspansjon og unngå overconfluence. Hvis cellene er nå full samløpet på tallerkenen, er det en risiko for at kulturen vil enten bli senescent eller celler vil begynne å dø og koble. Til slutt, når plating celler som spheroids, er det viktig å grundig spre cellene til matrisen og plate en randomisert prøve. Enten over - eller under - population matrix dråper vil føre til kultur feil, og store klumper av celler produserer ikke vellykket spheroids.

Når du gjennomfører denne protokollen, støte etterforskere på noen vanlige problemer. Forurensning, er som nevnt ovenfor, best unngås ved å skaffe en god første prøve uten mucus og ren kultur teknikker. Hvis kulturer er vellykket gjennom utvidelse, men ingen differensiert kuler er dannet, kan det ha oppstått flere problemer. Hvis matrisen vises stort sett tomme, er det mest sannsynlig at cellene var frø på for lavt til en tetthet; øke seeding tettheten av påfølgende forsøk med ca 20%. Omvendt, hvis matrise synes å være "skitne" med store celle rusk, er det sannsynlig at cellene var frø på for høyt av en tetthet og påfølgende forsøk bør bruke en seeding tetthet redusert med ca 20%. En vanlig komplikasjon av post seeding fôring og vedlikehold er brøkdel av matrix fra kultur fartøyet. Dette er forårsaket av aggressiv media utveksling kan unngås ved å forsiktig og manuelt endre media med en 1-mL pipette, ikke veggen sugekraft. Hvis, kan kuler fortsatt stimulert og fotografert, selv om dette kan være vanskelig hvis matrix "flyter" i godt under bildebehandling, nødvendiggjør forsiktig kartlegging av spheroids i brønnen.

Etterforskerne forfølge flere endringer i protokollen, avhengig av deres lab behov. Ved høyere oppløsning avbildning av spheroids, har vi tidligere erstattet 4-vel platene med optisk glass alternativer, inkludert 35 mm glass bunn retter eller kammer lysbilder. Dette gir høy oppløsning, levende bilder av spheroids, men kan redusere gjennomstrømming. Alternativt for å øke gjennomstrømming, kan mindre dele celler i matrisen bli sådd i andre fartøy (f.eks 24-brønnen plater). I vår erfaring vokser spheroids med matrix i en "slippverktøy" form i motsetning danner et ark på bunnen av brønnen; som sådan, har vi hatt best suksess med dråper av minst 25 µL. etterforskerne kan ønske å endre tettheten av matrix fortynne med media. Dette reduserer den totale mengden matrix nødvendig, forbedre kostnaden for analysen. Dette kan imidlertid også endre spheroid sammensetningen. I våre tidligere erfaringer, lave konsentrasjoner av kjelleren membran matrix føre til endret formet struktur, med enten delvis eller fullstendig dannelsen av spheroids i en "celle-apex-out" morfologi. Slik bør spheroids generert gjennom noen protokoll endringer i matrix konsentrasjon forsiktig vurderes for morfologi før funksjonstesting forsøkes. Til slutt, ulike stimulerende eller hemmende narkotika eller ulike konsentrasjoner av disse stoffene, kan brukes. Forskolin, IBMX og Inh172 ble valgt for våre studier i disse konsentrasjoner basert på tidligere erfaringer i ALI kulturer31. Bruk av andre stoffer (f.eks isoproterenol for stimulering, GlyH101 for hemming) kan bedre søke en etterforsker studie. På samme måte bruker ulike konsentrasjoner av forskolin, IBMX eller Inh172 kan endre det dynamiske utvalget av analysen, men vi har ikke systematisk testet disse alternativene.

Gitt antall eksisterende ex vivo pasient-avledede CFTR analyser, er beskrevet modellen flere viktige grunner. Først kapitaliserer det på nese celler som en enkelt innhentet åndedretts vev. HNE innkjøp gjøres trygt med minimal trening under nesten alle forhold (klinikk, OR forskning besøk) i alle aldersgrupper25. Dette forenkler robust utvalg innkjøp og gjenta prøvetaking om nødvendig på grunn av vekst problemer eller forurensning. Sammenlignet med intestinal organoids, HNE spheroids kjennetegnes mindre bra og vises har en mindre dynamisk område i den nåværende form, men, av luftveiene i stedet for å GI vev kan være en viktig fordel, som flere CF sykdom drivere (f.eks mucociliary klaring, epithelial natrium kanal uttrykk) er ikke det samme i tarmen. I motsetning til plan, ALI kulturer HNE celler, spheroids er vokst raskere og kan være mer representativt for i vivo forhold, måle en fysiologiske prosess (væske homeostase) som kan være mer relevant enn elektrofysiologi alene32. Ved å forbedre tiden fra eksempel innkjøp til testing, reduseres forurensning potensielle, dermed økte sannsynligheten for kultur suksess. Til slutt kan 3-dimensjonale natur modellen være mottakelig til Roman og/eller komplementære linjer med forskning i airway utvikling eller morfologi som ikke gjennomførbart i ALI kulturer (f.eks, luminal Slim sporing, rask studier av differensiering, etc.).

Det er flere viktige begrensninger HNE spheroids som en analyse av CFTR-funksjonen. Først denne analysen er fortsatt relativt lav gjennomstrømming. Bruker gjeldende metoder, bildeopptak tar over en time for hver kultur-betingelse, og analyse tar en ytterligere 20-30 minutter per betingelse. Dette blir vanskeliggjort av graden av overlapping mellom visse betingelser (som vist i figur 2A), som nødvendiggjør et større antall mål (denne overlappingen i seg selv kan også utgjøre en begrensning av sensitivitet av denne analysen). Som sådan, krever et enkelt eksperiment med 4-6 forhold nesten to dager for ferdigstillelse. Gjennomstrømning kan forbedres ved å bruke automatiserte bildebehandling og analyse; slike tilpasninger er for øyeblikket pågår. For det andre, denne modellen krever mye matrix, som kan bli dyrt. Som nevnt ovenfor, kan bidra til å overvinne denne barrieren fortynning av matrix, men det må tas med forsiktighet, som endringer i den vekst matrise vil sannsynligvis føre endringer i spheroid morfologi. Tredje avhengig denne modellen spheroid målinger i en XY fly bare og ignorerer hevelse i Z-fly, som kan introdusere bias. Mens tidligere reproduserbarhet analyser har vært betryggende, kan dette brist overvinnes ved bruk av automatiserte bildebehandling med Z-fly skanning for å beregne volumet30. Til slutt, og viktigst, er omfattende arbeid å knytte spheroid Svar å personlige emnet i vivo narkotika-respons ennå skal fullføres. I fravær av denne sammenhengen er den logiske verdien av modellen - mens lovende - uklart.

Generasjon og analyse av HNE spheroids tillate ex vivo analyse av individuelle CFTR aktivitet og modulering, som kan til slutt være nyttig som en pre-klinisk modell av narkotika-respons. Videre, gitt omfattende variasjon i CF sykdommens alvorlighetsgrad, slik en individualisert modell kan gi innsikt i et fag unike airway microenvironment. På denne måten kan slik modell være nyttig for studier av bredere CFTR biologi og hjelp i å forstå sykdom heterogenitet. Fremtidig bruk av denne modellen, i tillegg til andre lignende modeller av tilpassede CFTR-funksjonen, holder løftet om å forstå CFTR biologi i laboratoriet, og personlig og presisjon medisin i klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av cystisk fibrose Foundation Therapeutics, gi nummer CLANCY14XX0 og gjennom cystisk fibrose Foundation, gi nummer CLANCY15R0. Forfatterne ønsker å takke Kristina Ray for henne hjelp i pasient rekruttering og regulatoriske forglemmelse. Forfatterne også ønsker å takke HNE working group, støttet av cystisk fibrose Foundation, som hjalp i generasjon av HNE kultur: Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, G. Marty Salomo og Katherine Tuggle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Tube USA Scientific  4036-3204
150 mL Filter Flask Midsci  TP99150 To filter Media
15 mL Conical Tube Midsci  TP91015
1 L Filter Flask Midsci  TP99950 To filter Media
35 mm Glass-Bottom Dish MatTek Corporation P35G-0-20-C Optional
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) Fisher Scientific  AC228420010  Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO
50 mL Conical Tube Midsci   TP91050
Accutase Innovative Cell Technologies, Inc. AT-104 Cell detachment solution
Adenine Sigma-Aldrich A2786-25G See Table 1
Amphotericin B Sigma-Aldrich A9528-100MG See Table 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL) Lonza  CC-4098 See Table 2
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich C3809-1G See Table 1
Cell Scrapers 20 cm  Midsci  TP99010
CFTR Inh172 Tocris Bioscience 3430 Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) Sigma-Aldrich C8052-.5MG See Table 1
CYB-1 Medical Packaging Corporation CYB-1 Cytology brush
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes  Life Technologies  11330-057 Base Medium; See Tables 1 and 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) Thermo Fisher Scientific PHG6045 See Table 1
Epinephrine Sigma-Aldrich E4250-1G See Table 2
Ethanol Fisher Scientific  2701
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135-500ML 16.6 mM solution; See Table 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) TCI America  E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) Invitrogen  10082147 See Table 1
Forskolin Sigma-Aldrich F6886-50 Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO
Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 356231 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) Advanced BioMatrix 5007-A Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)  GE Healthcare  SH30066.03HI See Table 2
Hydrocortisone StemCell Technologies 07904 See Tables 1 and 2
Insulin, human recombinant, zinc solution Life Technologies  12585014 4 mg/mL solution; see Table 2
IVF 4-Well Dish, Non-treated NUNC (via Fisher Scientific) 12566350 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate
MEF-CF1-IRR Globalstem GSC-6001G Irradiated murine embryonic fibroblasts
Metamorph 7.7 Molecular Devices Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote
Olympus IX51 Inverted Microscope Olympus Corporation Discontinued Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  for a quote
Pen Strep Life Technologies  15140122 See Table 2
Phsophoryletheanolamine Sigma-Aldrich P0503-5G See Table 2
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625-50MG See Table 2
Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. 96-0905 Nasal curette
Slidebook 5.5 3i, Intelligent Imaging Innovations Discontinued Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 20012050
Sterile Water Sigma-Aldrich W3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100 Techno Plastic Products 93100 Tissue culture dish for expansion
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG See Table 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza  CC-4205 See Table 2
Triiodothryonine Sigma-Aldrich T6397-1G 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; See Table 2
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma-Aldrich T4799-10G
Ultroser-G Crescent Chemical (via Fisher Scientific) NC0393024 20 mL lypophilized powder; See Table 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis Sigma-Aldrich V2002-5G See Table 1
VX770 Selleck Chemicals S1144 Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO
VX809 Selleck Chemicals S1565 Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO
Y-27632 Dihydrochloride  ROCK inhibitor  Enzo LifeSciences  ALX-270-333-M025  See Table 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rowe, S. M., Miller, S., Sorscher, E. J. Cystic fibrosis. N Engl J Med. 352 (19), 1992-2001 (2005).
  2. Rommens, J. M., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and jumping. Science. 245 (4922), 1059-1065 (1989).
  3. Anderson, M. P., et al. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel. Cell. 67 (4), 775-784 (1991).
  4. Boucher, R. C. Human airway ion transport. Part one. Am J Respir Crit Care Med. 150 (1), 271-281 (1994).
  5. Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: an inherited disease affecting mucin-producing organs. Int J Biochem Cell Biol. 52, 136-145 (2014).
  6. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with cystic fibrosis and the G551D-CFTR mutation. N Engl J Med. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  7. De Boeck, K., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis and a non-G551D gating mutation. J Cyst Fibros. 13 (6), 674-680 (2014).
  8. Moss, R. B., et al. Efficacy and safety of ivacaftor in patients with cystic fibrosis who have an Arg117His-CFTR mutation: a double-blind, randomised controlled trial. Lancet Respir Med. 3 (7), 524-533 (2015).
  9. Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in Patients with Cystic Fibrosis Homozygous for Phe508del CFTR. N Engl J Med. , (2015).
  10. Brewington, J. J., McPhail, G. L., Clancy, J. P. Lumacaftor alone and combined with ivacaftor: preclinical and clinical trial experience of F508del CFTR correction. Expert Rev Respir Med. 10 (1), 5-17 (2016).
  11. CFTR2 Database. , www.cftr2.org (2017).
  12. Mou, H., Brazauskas, K., Rajagopal, J. Personalized medicine for cystic fibrosis: establishing human model systems. Pediatr Pulmonol. 50 Suppl 40, S14-S23 (2015).
  13. Randell, S. H., Fulcher, M. L., O'Neal, W., Olsen, J. C. Primary epithelial cell models for cystic fibrosis research. Methods Mol Biol. 742, 285-310 (2011).
  14. Whitcutt, M. J., Adler, K. B., Wu, R. A biphasic chamber system for maintaining polarity of differentiation of cultured respiratory tract epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 24 (5), 420-428 (1988).
  15. Worthington, E. N., Tarran, R. Methods for ASL measurements and mucus transport rates in cell cultures. Methods Mol Biol. 742, 77-92 (2011).
  16. Van Goor, F., et al. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18843-18848 (2011).
  17. Hug, M. J., Tummler, B. Intestinal current measurements to diagnose cystic fibrosis. J Cyst Fibros. 3 Suppl 2, 157-158 (2004).
  18. van Barneveld, A., Stanke, F., Ballmann, M., Naim, H. Y., Tummler, B. Ex vivo biochemical analysis of CFTR in human rectal biopsies. Biochim Biophys Acta. 1762 (4), 393-397 (2006).
  19. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).
  20. Dekkers, J. F., et al. Optimal correction of distinct CFTR folding mutants in rectal cystic fibrosis organoids. Eur Respir J. 48 (2), 451-458 (2016).
  21. Dekkers, R., et al. A bioassay using intestinal organoids to measure CFTR modulators in human plasma. J Cyst Fibros. 14 (2), 178-181 (2015).
  22. Zomer-van Ommen, D. D., et al. Limited premature termination codon suppression by read-through agents in cystic fibrosis intestinal organoids. J Cyst Fibros. , (2015).
  23. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cell Dev Biol. 27a (9), 684-686 (1991).
  24. Di Lullo, A. M., et al. An "ex vivo model" contributing to the diagnosis and evaluation of new drugs in cystic fibrosis. Acta Otorhinolaryngol Ital. 37 (3), 207-213 (2017).
  25. Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Sci Rep. 7 (1), 7375 (2017).
  26. Devalia, J. L., Davies, R. J. Human nasal and bronchial epithelial cells in culture: an overview of their characteristics and function. Allergy Proc. 12 (2), 71-79 (1991).
  27. Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respir Med. 84 (4), 303-312 (1990).
  28. Thavagnanam, S., et al. Nasal epithelial cells can act as a physiological surrogate for paediatric asthma studies. PLoS One. 9 (1), e85802 (2014).
  29. Jorissen, M., Van der Schueren, B., Van den Berghe, H., Cassiman, J. J. The preservation and regeneration of cilia on human nasal epithelial cells cultured in vitro. Arch Otorhinolaryngol. 246 (5), 308-314 (1989).
  30. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. J Cyst Fibros. , (2017).
  31. Sun, H., et al. Tgf-beta downregulation of distinct chloride channels in cystic fibrosis-affected epithelia. PLoS One. 9 (9), e106842 (2014).
  32. Boucher, R. C. Evidence for airway surface dehydration as the initiating event in CF airway disease. J Intern Med. 261 (1), 5-16 (2007).

Tags

Medisin problemet 134 cystisk fibrose CFTR Precision medisin Organoid Spheroid Nasal celle cellekultur
Generering av menneskelig nese tarmepitelet Spheroids for individualisert cystisk fibrose Transmembrane konduktans Regulator studie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., … More

Brewington, J. J., Filbrandt, E. T., LaRosa III, F. J., Moncivaiz, J. D., Ostmann, A. J., Strecker, L. M., Clancy, J. P. Generation of Human Nasal Epithelial Cell Spheroids for Individualized Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Study. J. Vis. Exp. (134), e57492, doi:10.3791/57492 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter