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Medicine

Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude

Published: April 11, 2018 doi: 10.3791/57492
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pediatrics, Division of Pulmonary Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Summary

Nous décrivons ici une méthode pour générer des cultures sphéroïde en trois dimensions des cellules épithéliales nasales humaines. Sphéroïdes sont alors stimulés au lecteur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-ion charge et sécrétion de liquide, quantifier le changement de la taille de luminal sphéroïde comme approximation de fonction CFTR.

Abstract

Alors que l’introduction de médicaments modulateur Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) a révolutionné les soins dans la fibrose kystique (FK), le modèle de thérapie axée sur le génotype en cours d’utilisation présente plusieurs limites. Groupes de mutation premier, rares ou peu étudiée sont exclus des essais cliniques définitives. En outre, comme drogues de modulateur supplémentaires entrer sur le marché, il deviendra difficile d’optimiser les choix de modulateur pour un sujet individuel. Ces deux problèmes sont abordés avec l’utilisation de systèmes individualisés, dérivé de patient modèle préclinique de fonction CFTR et modulation. Cellules épithéliales nasales humaines (HNEs) constituent une source facilement accessible du tissu respiratoire pour un tel modèle. Ici, nous décrivons la génération d’un modèle tridimensionnel sphéroïde de fonction CFTR et modulation en utilisant HNEs primaires. HNEs sont isolés des sujets de façon mini-invasive, élargi dans les conditions de reprogrammation conditionnelles et ensemencé dans la culture de l’ellipsoïde. Dans les 2 semaines des semis, cultures de sphéroïde génèrent des sphéroïdes HNE qui peuvent être stimulés avec 3', 5'-l’adénosine monophosphate cyclique (AMPc)-générer des agonistes pour activer la fonction CFTR. Gonflement de sphéroïde est ensuite quantifié comme indicateur d’activité CFTR. Sphéroïdes HNE capitaliser sur l’origine peu invasive, mais respiratoire de cellules nasales pour générer un modèle accessible, personnalisé, pertinent à un épithélium reflétant la mortalité et la morbidité de la maladie. Par rapport aux cultures HNE interface air-liquide, sphéroïdes sont relativement rapides à maturité, ce qui réduit le taux global de contamination. Dans sa forme actuelle, le modèle est limité par un débit faible, mais cela est compensé par la facilité d’acquisition de tissu. Sphéroïdes HNE permet de quantifier et de caractériser l’activité CFTR au niveau individuel de façon fiable. Une étude en cours de lier cette quantification à in vivo la réaction aux médicaments déterminera si les sphéroïdes HNE sont un vrai prédicteur préclinique de la réponse du patient à la modulation de CFTR.

Introduction

Fibrose kystique (FK) est une maladie récessive autosomique fatale affectant plus de 70.000 personnes dans le monde1. Cette maladie génétique de la vie-raccourcissement est dû à des mutations la Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) de protéines2. CFTR est membre de la famille de triphosphate d’adénosine-binding cassette et fonctions comme un canal ionique permettant le mouvement du chlorure et du bicarbonate à travers les membranes apicales de l’épithélium polarisé multiples, y compris le tube digestif, glandes sudoripares, respiratoire et des arbres, entre autres3,4. À ce titre, dysfonctionnelle CFTR entraîne multisystémique dysfonction épithéliale, avec la mortalité découlant de la maladie respiratoire1. Dans le poumon CF, perte du CFTR-conduit des voies respiratoires surface liquide (ASL) Règlement et du mucus libération conduit à mucus épaissi, obstruction des voies respiratoires, infection chronique et remodelage des voies aériennes progressive et poumon fonction1,5.

Malgré l’identification des dysfonctionnement CFTR comme étant la cause de la maladie, thérapies dans FC traditionnellement concentré sur l’atténuation des symptômes (par exemple, thérapie de remplacement d’enzymes pancréatiques, thérapies de dégagement des voies respiratoires)1. Cette approche a été récemment révolutionnée par l’apparition de nouveaux médicaments, appelés « Modulateurs CFTR, » qui ciblent directement dysfonctionnelle CFTR. Cette approche a changé le paysage clinique de gestion des symptômes de modificateurs de la maladie en charge, mais comporte plusieurs limites6,7,8,9,10. Activité de modulateur est spécifique à la défectuosité de la protéine qui accompagne chaque mutation CFTR et limité à sélectionner en génétique des populations,11. Cette limitation est entraînée par l’hétérogénéité des défauts de la protéine, mais aussi par l’impraticabilité des essais cliniques dans les groupes de mutation rare. En outre, chez les sujets présentant des génotypes bien étudiés (par exemple, F508del/F508del CFTR, la mutation CFTR la plus courante), il est grande variabilité en maladie fardeau et modulateur réponse6,7,8 ,9,11.

Pour résoudre ces deux problèmes, les chercheurs ont proposé l’utilisation de modèles personnalisés pour les essais précliniques12. Ce concept utilise des tissus spécifiques au patient pour générer un système de modèle individualisé ex vivo pour les essais en enclos, prédiction en vivo sujet réaction aux traitements de façon personnalisée. Une fois validé, un tel modèle pourrait servir par les cliniciens à la thérapie de précision lecteur quel que soit le génotype CFTR sous-jacent du patient.

Humaine (HBE) les cellules épithéliales bronchiques provenant du tissu de l’explant au moment de la transplantation pulmonaire a créé la possibilité d’un tel modèle pour CF13,14. HBEs cultivées à l’interface air-liquide (ALI) permettant de quantification fonctionnelle de CFTR directement par des tests électrophysiologiques, ou indirectement par le biais de mesures d’ASL homéostasie13,15. Ce modèle a été essentiels à la compréhension de la biologie CFTR et a été un facteur clé dans le développement de CFTR modulateurs16. Malheureusement, les modèles d’HBE ne sont pas tenable comme un modèle personnalisé en raison de la nature invasive de l’acquisition (transplantation pulmonaire ou brossage bronchique) et des échantillons pour ceux qui ont des mutations rares ou maladie bénigne. À l’inverse, tissu intestinal, obtenu à partir des spécimens de biopsie rectale ou duodénal, peut être utilisé pour la mesure de courant intestinale (ICM) ou une analyse axée sur l’enflure organoïde pour étude individualisée CFTR fonction17,18, 19. organoïde essais, en particulier, sont des modèles très sensibles du CFTR activité20,21,22. Les deux modèles sont limités par la source de tissu (tissu intestinal, tandis que la plupart pathologie de la maladie est respiratoire) et la méthode semi-invasive de l’acquisition. Par ailleurs, plusieurs chercheurs ont étudié nasale (HNE) les cellules épithéliales humaines au modèle CFTR restauration23,24,25. HNEs peuvent être récoltées en toute sécurité au pinceau ou curetage chez les sujets de tout âge et, lorsqu’il est cultivé dans la région ALI, récapituler beaucoup de caractéristiques de HBEs25,26,27,28. Des cultures monocouches HNE ont traditionnellement été limités par transformation squameuse et beaucoup de temps à maturité29. En outre, indiqué de court-circuit mesurer le courant dans HNEs est plus petits que ceux de HBEs, suggérant une petite fenêtre pour détecter l’efficacité thérapeutique25.

Compte tenu de la nécessité d’un modèle de culture de tissus personnalisés, non invasif, respiratoire de fonction CFTR, nous avons cherché à fusionner la sensibilité d’un gonflement, organoïde test avec le caractère non invasif et respiratoire de HNEs. Nous décrivons ici, notre méthode de production de cultures 3 dimensions « sphéroïde » de HNEs pour étude individualisée de CFTR dans un essai gonflement30. Sphéroïdes HNE polarisent de manière fiable avec l’apex épithélial vers le centre de la sphère, ou lumen. Ce modèle reprend de nombreuses caractéristiques d’un épithélium respiratoire inférieur et arrive à maturité plus rapidement que les cultures d’ALI. Comme un test fonctionnel, sphéroïdes HNE quantifient fiablement une fonction plage de CFTR, mais aussi modulation dans les groupes de mutation bien étudiés (par exemple, F508del CFTR). Cette analyse axée sur l’enflure capitalise sur les propriétés de transport des ions/sel de CFTR, mesurer indirectement afflux fluide dans l’ellipsoïde comme l’eau suit l’efflux sel apicale. De cette façon, des sphéroïdes stimulées avec CFTR entièrement fonctionnel gonflent robuste, tandis que ceux avec dysfonctionnelle CFTR moins gonflent ou rétrécissement. C’est quantifiée par analyse d’image des prébiotiques et sphéroïdes de stimulation après 1 h, zone luminale de mesure et de déterminer le pourcentage de changement. Cette mesure peut alors être comparée à travers des groupes expérimentaux à l’écran pour la bioactivité de la drogue de façon spécifique au patient.

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Protocol

Échantillons de l’HNE ont été achetés auprès de sujets recrutés par le Cincinnati Children Hospital Medical Center CF Research Center. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) de Cincinnati Children Hospital Medical Center. Consentement a été obtenu de tous les sujets avant le test.

1. préparer les médias de l’Expansion et antibiotiques

  1. Rassembler les composantes médias énumérés au tableau 1. Décongeler des surgelés matériaux à température ambiante et faire des solutions courantes nécessaires comme indiqué au tableau 1 en vertu de le « Expansion Media ».
    Remarque : Faites attention lorsque vous manipulez la toxine cholérique, qui est toxique si ingéré et est une peau, des yeux et irrite les voies respiratoires. Faire et combiner toutes les solutions et les médias dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.
  2. À l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL, retirez et jetez 50 mL de milieu de base (Dulbecco Modified Eagle Medium/F12) d’un conteneur à compenser l’addition d’autres matières. Verser tous les supports de base à la main dans une bouteille en verre 1 L autoclavés.
  3. En utilisant une pipette sérologique de 50 mL ou une pipette 1 mL selon le cas, transférer tous les composants restants de l’Expansion section « médias » du tableau 1 dans la bouteille en verre stérilisé contenant les médias. Doucement agiter la bouteille à la main pour mélanger.
  4. Masses filtrantes dans un frais, stérile, 1 L, 0,22 µm polyéthersulfone (PES) flacon de filtre en utilisant les instructions du fabricant et d’annoter avec « Expansion Media » et la date.
  5. Préparer les milieux antibiotiques. Faire des solutions mères antibiotiques nécessaires comme il est indiqué dans le tableau 1 sous « Médias antibiotique ».
    1. À l’aide d’une pipette sérologique de 50 mL, transférer 150 mL d’Expansion Media dans une bouteille de verre stérilisés à l’autoclave de fraîches 250 mL.
    2. À l’aide d’une pipette 1 mL, ajouter tous les composants de l’antibiotique section « médias » du tableau 1 dans le flacon de verre stérilisé contenant les médias. Agiter à la main pour mélanger jusqu'à ce que le support soit uniform en apparence.
    3. Masses filtrantes dans une fraîche et stérile 250 mL, 0,22 µm du fiole filtrante du PSE en utilisant les instructions du fabricant et d’annoter avec « Antibiotique Media » et la date.
  6. Entreposer le milieu à 4 ° C pendant environ un mois, ignorant si nuageux, ce qui suggère de contamination.

2. préparer les milieux de la différenciation

  1. Rassembler les composantes médias figurant au tableau 2. Décongeler des surgelés matériaux à température ambiante et faire des solutions courantes nécessaires tel qu’indiqué dans le tableau 2.
    Remarque : Soyez prudent lorsque vous manipulez l’acide rétinoïque, qui est un toxique pour la reproduction, peut être toxique si avalé et provoque une irritation cutanée. Réaliser, aliquote et combiner toutes les solutions et les médias dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.
  2. Retirez et jetez les 52 mL de milieu de base d’un conteneur à compenser l’addition d’autres matières. Verser tous les supports de base dans une bouteille en verre 1 L autoclavés.
  3. En utilisant une pipette sérologique de 25 mL ou une pipette 1 mL le cas échéant, transférer tous les éléments restants du tableau 2 à la bouteille en verre stérilisé contenant les médias et agiter doucement à la main pour mélanger.
  4. Masses filtrantes dans un frais, stérile, 1 L, 0,22 µm polyéthersulfone (PES) flacon de filtre en utilisant les instructions du fabricant et d’annoter avec « Différenciation des médias » et la date.
  5. Entreposer le milieu à 4 ° C pendant environ un mois, ignorant si nuageux, ce qui suggère de contamination.

3. manteau Pétri et blanc sur plaque de fibroblastes Feeder

Remarque : Effectuez toutes les étapes dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.

  1. Mélangez 0,5 mL de stock de collagène et 37,5 mL d’eau stérile dans un tube conique de 50 mL.
  2. Pipetter 4 à 5 mL de solution de collagène dans chaque boîte de Petri propre P100, assurer que la totalité de la surface est couverte.
  3. Couvrir les plats avec des couvercles et incuber une nuit à 37 ° C et 5 % de CO2.
  4. Dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, supprimer tous les couvercles de plat. Agiter la solution pour couvrir le plat, puis aspirer.
  5. Stériliser à l’exposition aux ultraviolets (UV) pour couvercles Place 1 h. retour sur les plats, plats pile et couvrir avec du papier aluminium.
  6. Plats de magasin couché à 4 ° C pendant 3 à 6 mois, re-stérilisation sous exposition aux UV light 15-30 min avant utilisation de la culture des cellules.
  7. 24 h avant d’obtenir un échantillon HNE, stériliser un plat revêtu et étiquette que les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) et la date.
  8. Ajouter le support d’Expansion pour couvrir la plaque (environ 5 mL) avec une pipette sérologique.
  9. Décongeler un flacon de 2 x 106 irradiés MEFs dans un bain-marie à 37 ° C. Dès le MEF est décongelés, ajouter la moitié du flacon (environ 106 cellules) dans le plat avec une pipette de 1 mL, agitant à la main pour disperser.
  10. Incuber à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant la nuit en préparation pour la culture de l’HNE.
    Remarque : Si nécessaire, mesures 3,7-3.10 peuvent être réalisé plus tard que 60 min avant électrodéposition cellules, bien que du jour au lendemain est idéal.

4. obtenir et traiter l’échantillon HNE

  1. Assurer le consentement approuvés par la CISR est obtenue pour tous les sujets.
  2. Ont le nez coup patient pour dégager le mucus lâche.
  3. Visualiser les cornets à l’aide d’un rhinoscope inférieure. Assurer aucune lésions ou des polypes ne sont présent qui peut empêcher le prélèvement de l’échantillon.
  4. Prélever des cellules nasales de la narine première par curetage ou brossage.
    1. Curetage : Curette virage à mi-parcours pour créer une légère, angle ~ 135° avec l’apex de la coupe de la curette. Insérez la curette dans la narine et de faire progresser la coupe curette sous le cornet inférieur. Doucement appuyer sur la coupe de la curette contre l’inférieure cornet et gratter le cornet en tirant la curette avance, répétition total des 3 - 4 fois.
    2. Brosse : Pass la cytologie brosse ci-dessous l’inférieure cornet, puis tourner et déplacer la brosse-and-out légèrement 4 - 5 fois, sans sortir de la narine.
  5. Place curette/pinceau dans un 15 mL conique rempli de médias aux antibiotiques. Répétez les étapes 4.3-4.4 pour l’autre narine, plaçant la curette/brosse dans le même tube à fond conique.
  6. Magasin conique sur la glace jusqu’au moment de la transformation. S’assurer que le traitement se produit moins de 4 h de l’acquisition de l’échantillon, mais peut survenir aussi tard que 24h après acquisition si nécessaire.

5. traiter et développez l’HNE des cellules dans les plats

Remarque : Effectuez toutes les étapes dans des conditions propres à la biosécurité du cabinet.

  1. À l’aide d’une pipette 1 mL et les médias de l’échantillon conique, laver toutes les cellules de brosses curettes/cytologie dans le même tube conique. Une fois propre, jetez curettes / pinceaux.
  2. Centrifuger conique à 360 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  3. Aspirer le surnageant, en veillant à ne pas déranger le culot cellulaire.
  4. Resuspendre le culot dans 3 mL de solution de détachement cellulaire, pipette avec une pointe de 1 mL à homogénéiser le mélange.
  5. Centrifuger conique à 360 x g et 4 ° C pendant 5 min.
  6. Répétez les étapes 5,3 à 5,5 fois.
  7. Aspirer le surnageant restant, en prenant soin de ne pas pour déranger le culot cellulaire.
  8. Resuspendre le culot dans 1 mL de médias antibiotique et comte de cellules avec un hémocytomètre.
  9. À l’aide d’une pipette 1 mL, plaque de cellules goutte à goutte sur le plat enduit, des fibroblastes graines préparées à l’étape 3.10. Ajouter des éléments multimédias aux antibiotiques pour couvrir le plat entièrement et de disperser les cellules sur la surface. Plat avec le contenu et la date de l’étiquette et incuber à 37 ° C et 5 % de CO2.
  10. Après 48 h, faire en sorte que les cellules soient attachées à la boîte de Pétri. Aspirer les médias et remplacer avec les médias antibiotique assez frais pour couvrir la plaque.
  11. Changer de média 3 x par semaine, aspirer les anciens médias avec une ligne vide et la pipette Pasteur et remplaçant assez supports neufs pour couvrir la plaque. Après 5 jours sur support d’antibiotique, remplacez les médias médias Expansion, continuant à remplacer trois fois par semaine.
    Remarque : Risque de Contamination est élevé dans la première semaine de la culture. Conserver les échantillons frais dans un incubateur distinct afin de minimiser le risque de contamination croisée.
  12. Vérifier la croissance de la cellule plusieurs fois par semaine. Une fois que les cellules sont environ 70-80 % anastomosé, procéder aux cellules de passage.

6. passage des cellules HNE

  1. Préparer la solution de trypsine de 0,1 % en acide tétraacétique (EDTA).
    Remarque : Soyez prudent trypsine, qui est un irritant des yeux peau, respiratoire, de la manutention.
    1. Peser 15 mg de trypsine du pancréas de porc dans un tube à fond conique.
    2. Peser 56 mg d’EDTA dans un tube conique distinct.
    3. Dans le cabinet de prévention des risques biotechnologiques, transférer la trypsine et EDTA dans une bouteille en verre stérilisés à l’autoclave de 250 mL. Utiliser une petite aliquote de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS) pour rincer les tubes de la trypsine/EDTA afin d’effectuer le transfert.
    4. Ajouter PBS stérile pour porter la solution totale à 150 mL. Fermer le couvercle hermétiquement.
    5. Incuber les solution de trypsine dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que complètement dissous. Vérifier toutes les 15 min et retirer rapidement une fois dissous.
      Remarque : Ne pas laisser décochée pendant de longues périodes de temps (par exemple, du jour au lendemain), comme la trypsine dans solution va dénaturer lorsqu’elles sont chauffées pendant trop longtemps.
    6. Nettoyer la bouteille avec 2-3 pulvérisations d’éthanol à 70 % et revenir à la biosécurité du cabinet.
    7. Filtrer les 0,1 % solution de trypsine-EDTA dans un frais, stérile 250 mL, 0,22 µm du fiole filtrante du PSE en utilisant les instructions du fabricant et annoter avec le contenu et la date.
    8. Stocker la solution de trypsine-EDTA à 4 ° C pendant environ un mois, jeter si nuageux.
  2. Apporter la différenciation Media, 0,1 % solution de trypsine-EDTA et PBS stérile à température ambiante pendant 30 min Clean avec 70 % d’éthanol et transfert dans une armoire de biosécurité propre.
  3. Dans la prévention des risques biotechnologiques armoire, utilisez une ligne vide et la pipette Pasteur pour aspirer et jeter des supports de culture de tissu plat. Laver le plat en ajoutant, en tourbillonnant et en aspirant les 5 mL de PBS à l’aide d’une pipette propre sérologique.
  4. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, ajouter 5 mL de solution de trypsine-EDTA 0,1 % dans le plat de culture de tissus et revenir à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 5 min.
  5. Visualiser les cellules sur un microscope inversé à 4-10 X. Vérifiez que les cellules se détachent de la capsule, devient rondes et flottent. Tapotez doucement le côté de la boîte de Pétri pour déloger les cellules, et/ou ré-incuber pendant un 5 min supplémentaire jusqu'à ce que la plupart des cellules sont détachés.
    Remarque : Prendre des précautions pour enlever rapidement les cellules une fois détachés de la boîte de Petri ; une exposition prolongée à 0,1 % trypsine-EDTA nuira viabilité cellulaire.
  6. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, ajouter 5 mL d’Expansion Media au plat et recueillir tout le contenu liquid (10 mL au total) dans un tube conique étiquetées, stérile de 50 mL.
  7. Si les cellules restent adhérentes à la boîte de Petri, répétez les étapes 6,4 6,6 à vers le haut à deux reprises, collecte de matières dans le même tube conique.
    1. Si les cellules restent adhérentes à la boîte de Petri, après trois tours de l’exposition de solution de trypsine, utilisez un grattoir de cellules stériles enlever délicatement le reste. Après avoir enlevé le plat, lavez le grattoir et plat avec 5 mL d’Expansion Media et s’accumuler dans le même tube conique étiqueté.
      Remarque : Si le passage à sphéroïdes, modifier cette procédure pour effectuer la trypsinisation d’une différentielle. Après avoir ajouté la trypsine solution (point 6.4), vérifiez le plat fréquemment jusqu'à ce que les fibroblastes ont détaché (généralement 1-2 min), laissant les cellules épithéliales seulement polygonales attaché au plat. Recueillir et mettre de côté ce surnageant, qui peuvent être repiquées avec impatience pour l’expansion. Répétez les étapes à l’aide de la même solution de trypsine de 6,4 à 6,6 et recueillir seulement les cellules épithéliales restants pour la culture de sphéroïde.
  8. Centrifuger conique à 360 x g pendant 5 min et 4 ° C. Aspirer les médias de la conique.
  9. Resuspendre le culot dans 1 mL d’Expansion médias et nombre de cellules en utilisant un Hémacytomètre.
  10. Une fois quantifiés, les cellules se divisent si nécessaire et repiquées en avant sur une autre boite de culture (y compris la préparation de co-culture de fibroblastes, étape 3 et bordé de cellules pour l’expansion, étapes 5,9-5.12) ou cultivées comme sphéroïdes (étape 7).
    Remarque : Si, passage à une nouvelle boîte de Pétri pour l’expansion, une densité de semis de 0,5 à 1 × 106 cellules dans un plat de P100 est recommandé.

7. ensemencement de cellules pour Cultures de sphéroïde HNE

NOTE : Effectuer toutes les procédures dans cette étape, autres que de centrifugation, dans une armoire de biosécurité propre.

  1. Dégelez la matrice de la membrane basale sur la glace selon les instructions du fabricant (100 µL par puits sphéroïde).
    Remarque : Pensez à faire stérile 500 µL d’extraits de la matrice de la membrane basale à la réception ; ce montant sèmerai une seule plaque de 4 puits.
  2. Séparer un nombre adéquat de cellules différentiellement trypsinisés, repiquées (de l’étape 6,9) pour une concentration finale de 500 000 cellules / mL de la matrice. Pour une plaque de 4 puits, utilisez 200 000 cellules. Rassembler dans un tube de 1,5 mL.
  3. Centrifuger le mélange cellulaire et les médias à 360 x g pendant 5 min à 4 ° C. Complètement, mais soigneusement aspirer et jeter les média à l’aide d’une pipette 1 mL, en prenant soin de ne pas pour déranger le culot cellulaire.
  4. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, ajouter 100 µL par prévu bien de la matrice de la membrane basale dans le tube de 1,5 mL contenant les cellules. Maintenir le tube sur la glace.
  5. Pipeter monte et descend à soigneusement et complètement remettre en suspension les cellules dans la matrice de la membrane basale. Se déplacer rapidement pour éviter la solidification de la matrice. Éviter de vider complètement la pipette pour s’assurer que les bulles d’air ne sont pas introduites dans le mélange de la cellule de la matrice /.
  6. Dans chaque puits d’une plaque de culture de FIV 4 puits de graines 100 µL d’extraits matrice.
    1. À l’aide d’une propre paire de ciseaux, coupez la partie distale 3-4 mm d’une pointe de pipette de 200 µL.
    2. À l’aide de la pointe taillée, soigneusement Pipetter 100 µL du mélange cellule/matrice dans le centre de chaque puits. Pipetter lentement, dans le but de faire une seule matrice « goutte » au centre de chaque puits. La baisse devrait rester sphérique et ne doit pas toucher les côtés du puits. Lors du déplacement de la plaque, le faire avec tant de soin quant à ne pas perturber ces gouttes.
    3. Incuber les gouttes de matrice de membrane basale à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 30 min, jusqu'à ce que solide.
    4. Soigneusement Pipeter 500 µL de différenciation médias dans chaque puits, prenant soin de ne pas pour déranger la chute de la matrice. S’assurer que la couverture de quelques médias la matrice drop et en rajouter si nécessaire.

8. faire la différence et d’âge mûr sphéroïdes HNE

  1. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL, aspirez doucement tous les médias du puits ; éviter d’aspirer de la matrice qui détruira les sphéroïdes dans cette partie de la matrice, bien que n’importe quel sphéroïdes laissés pour compte peuvent demeurer viables.
  2. À l’aide d’une pointe de pipette frais 1 mL, doucement ajouter 500 µL de médias de différenciation dans le puits autour de la matrice. Ne pas toucher la matrice à l’aide de la pipette et éviter de déranger la chute de la matrice.
  3. Retour sphéroïdes à l’incubateur à 37 oC et 5 % de CO2 pour la croissance en cours. Répétez les étapes 8,1 8,3 à trois fois par semaine.
  4. Évaluer la morphologie sphéroïde quotidiennement sous un microscope inversé à 20 X. Sphéroïdes devraient former dans les 3-5 jours de placage et atteignent la maturité dans les 10 jours environ.

9. Prétraitez, stimuler et Image HNE sphéroïdes pour analyse

  1. Prétraitez les sphéroïdes comme vous le souhaitez avant l’imagerie comme décrit précédemment30.
    Remarque : Pour le prétraitement VX809, ajouter 3 µM de VX809 aux médias pendant 48 à 72 h avant l’imagerie. Mélanger 1 µL de 10 mM VX809 stock (voir Table des matières) à 3,3 mL des médias pour cette concentration.
  2. Chacun changer bien des sphéroïdes à 1 mL de supports neufs de différenciation, y compris le prétraitement (étapes 8.1-8,3) avant d’imagerie sphéroïdes.
  3. Préparer une stimulation douce drogue (la forskoline, 3-isobutyl-1-méthylxanthine [IBMX], VX770 et CFTR inhibiteur 172 [Inh172]) provenant des stocks (voir Table des matières). Pour la forskoline/IBMX, ajouter 1 µL de chaque stock à 98 µL d’eau stérile dans un seul marqué tube 1,5 mL. Pour VX770 et Inh172, ajouter 1 µL de chaque stock à 99 µL d’eau stérile dans des tubes distincts étiquetés 1,5 mL. Faire un volume total permettant 50 µL de solution pour chaque puits testés. Préparer des solutions dans des conditions stériles dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
  4. Transfert en plaque ellipsoïde à une chambre couvée, affectez à 37 ° C et 5 % CO2, monté sur un microscope inversé équipé du logiciel de capture d’image électronique et une platine mécanique d’ajustement XY. Allumez le microscope et caméra, ainsi que l’imagerie informatique.
  5. Capturer des images de base des sphéroïdes dans un puits.
    1. Ouvrez le logiciel de capture d’image (5,5 Slidebook pour les instructions ci-dessous). Une fois initialisé, ouvrez un nouveau fichier en cliquant sur « Fichier », puis « Nouveau ». Nommez le fichier en conséquence, puis cliquez sur « Enregistrer ».
    2. Avec précaution, retirez le couvercle de plaque de culture et centrer une matrice goutte sur l’objectif.
    3. Commençant par le haut de la chute de la matrice, se déplacer dans une grille de trouver des sphéroïdes grossissement 20 x avec l’oculaire du microscope. L’accent haut et en bas pour capturer la sphère à son point le plus large. Annoter à l’emplacement de chaque ellipsoïde sur une carte de la chute de la matrice à identifier de nouveau après l’imagerie.
    4. Dans le logiciel, cliquez sur « Capture d’Image ». Pour l’exposition, choisissez « Manuel » et entrez 50 m s’assurer que les autres paramètres sont appropriés (facteur Bin : 1 x 1, Tél : 512, H: 512, X et Y de décalage : 0). Entrez un nom approprié pour chaque image dans la zone « Nom » (p. ex. sphéroïde 1 Baseline). Cliquez sur « Start » pour afficher une image en direct et « Enregistrer » pour capturer une image de référence.
    5. Répétez les étapes 9.5.1-9.5.4 jusqu'à ce que le nombre de but est atteint, ou chute de la matrice entière est imagé.
      Remarque : Les différences de groupe peuvent être détectés avec aussi peu que 3-5 sphéroïdes par condition, cependant, il est devenu notre pratique à 10 ou plusieurs sphéroïdes par condition d’augmenter la puissance de l’image. Variabilité du dosage est illustrée dans la Figure 2 de la section « Résultats représentant », avec des échantillons des sphéroïdes de 8-10 par sujet, par exemple.
  6. Stimuler les sphéroïdes.
    1. À l’aide d’une pipette de 200 µL, ajouter 50 µL de la drogue de stimulation approprié dans les médias dans le puits, en prenant soin de ne pas pour déranger la matrice.
      NOTE : Après cette dilution de 10 fois (50 µL dans 500 µL de médias), la concentration du médicament final sera : la forskoline 10 µM, IBMX 100 µM, VX770 1 µM, Inh172 10 µM.
    2. Pour le cAMP seulement, ajouter seulement la forskoline/IBMX.
    3. Pour le cAMP + VX770, ajouter la forskoline/IBMX premier, puis VX770 après 2 min.
    4. Pour des conditions inhibées, ajouter Inh172 d’abord, puis la forskoline/IBMX après 2 min.
  7. Immédiatement après la stimulation, surveiller sphéroïde gonflement par imagerie timelapse pendant 1 h. Dans le logiciel, cliquez sur « Capture d’Image ». Cliquez sur « Timelapse » et définissez l’intervalle à 30 s, d’une durée de 60 min. Entrez un nom approprié et cliquez sur « Enregistrer » pour démarrer le timelapse.
    Remarque : Timelapse Standard consiste à capturer des images d’un sphéroïde unique toutes les 30 s pour assurer une haute qualité vidéo. Vous pouvez également exécuter capture faible grossissement du puits entière (par exemple, 4 X) et moins d’images capturées si vous le souhaitez. Si une étape automatique est utilisée, effectuez timelapse des sphéroïdes tous à l’aide de coordonnées prédéfinies ; Sinon, utilisez timelapse d’un sous-ensemble des sphéroïdes de procéder à un examen qualitatif de gonflement et d’assurer qu'aucun problème systématique ne surviennent au cours de l’imagerie (par exemple, détachement de matrice du puits).
  8. Immédiatement après avoir terminé l’image de timelapse de 1 h, capturer des images après stimulation des sphéroïdes tous (par étape 9,5) à l’aide de la carte, créée à l’étape 9.5.3.
    1. Renvoient à des images de stimulation préalable pour assurer que le même plan de mise au point est utilisé pour les images suivis (la qualité focale d’entourant les cellules, les sphéroïdes ou débris grandement faciliter ce processus).
    2. Enregistrer les fichiers avec une annotation appariée de l’étape 9.5.4 (p. ex. sphéroïde 1 après Stimulation).
      Remarque : remplir cette étape immédiatement après le timelapse, comme sphéroïdes peuvent continuer à gonfler.
  9. Remplacer le support dans la représentation bien avec les supports neufs de différenciation.
  10. Répétez les étapes 9,5 par l’intermédiaire de 9,9 pour chaque puits/condition, médicaments de stimulation de réglage comme indiqué pour des conditions expérimentales.
  11. Une fois que toute l’imagerie est terminé, retour sphéroïdes à l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.
    Remarque : Selon la stérilité de la chambre de microscope couvés, contamination après stimulation des sphéroïdes peut être assez fréquente. Laissez les sphéroïdes imagés dans un incubateur distinct, pour minimiser les risques de contamination croisée, ou jeter des sphéroïdes immédiatement après l’imagerie.

10. analyser les Images de sphéroïde HNE

  1. Exporter toutes les images dans un format compatible avec l’analyse d’images. Dans le logiciel, cliquez sur « View », survolez « Export » et sélectionnez « Default vues de toutes les Images sous TIFF... ». Enregistrer sur le disque dur ou un lecteur flash pour l’analyse.
    Remarque : une analyse commerciale logiciel (Table des matières) et des fichiers .tiff bons résultats et sont décrits ici, bien que l’analyse peut également être effectuée en utilisant d’autres plates-formes. Lorsque vous nommez des fichiers, personnel, analyse d’images doit être aveugle aux conditions expérimentales, mais conscient de quelles images sont jumelés (avant et après stimulation) afin d’assurer une analyse équivalente.
  2. À l’aide de logiciels d’analyse, délimiter la zone luminale de chaque image de sphéroïde et exporter dans un logiciel d’analyse de données.
    1. Logiciel d’analyse ouverte. Cliquez sur « Fichier », puis « ouvrir » et naviguez jusqu’au dossier de fichiers contenant des images de sphéroïde. Sélectionnez toutes les images pour l’analyse, puis cliquez sur « Ouvrir ».
    2. Cliquez sur « Mesure » et sélectionnez « Région Measurements ». Dans la boîte de dialogue région mesures, sélectionnez le droptab « Configuration » et vérifiez « Image Name » et « Espace » cases correspondantes sont cochées.
    3. Cliquez sur « Log » et sélectionnez « Open Data Log ». Cliquez sur « OK » sur le fichier de nom et boîte de dialogue données Log en conséquence (par exemple, Condition X, Date). Cela va transférer toutes les mesures dans une feuille de calcul.
    4. Sélectionnez « Trace région » outil bouton et tracer avec soin le lumen de l’ellipsoïde dans la première image pour analyse. Dans la boîte de dialogue région mesure, cliquez sur « Log Data » pour enregistrer la mesure dans Excel.
    5. Répétez les étapes 10.2.2-10.2.4 jusqu'à ce que tous les sphéroïdes sont analysés.
  3. Calculer la variation en pourcentage (100 * [Post-stim - Baseline] ÷ Baseline) dans la zone luminale de ligne de base pour chaque sphéroïde individuel paire d’images et de compiler des données pour analyse.

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Representative Results

HNEs devrait fixer à la boîte de Petri et forment des îlots de cellules dans les 72 h d’ensemencement ; exemples de formation de l’île de bonne et mauvaise à une semaine sont présentés dans la Figure 1bis et 1 b, respectivement. Ces îles doivent se développer pour couvrir le plat au cours de 15 à 30 jours. Petits ou sous-optimal des échantillons peuvent prendre plus de temps et souvent ne donneront pas utiles sphéroïdes. Contamination par des agents infectieux est attestée par les médias profond jaune/nuageux, insuffisance des cellules pour fixer à la boîte de Petri, et/ou la visualisation directe des champignons/bactéries. Les cultures contaminées doivent être jetés immédiatement pour éviter la contamination croisée.

Dans les premiers 3-4 jours de culture dans la matrice de la membrane basale, petites structures kystiques devraient commencer à se former dans la matrice. Ceux-ci viendront à échéance pendant environ 10 jours en sphéroïdes intacts démontrant une paroi mince et une surface luminale. Si plaqué à la densité décrite, cultures réussies contiendra des sphéroïdes de 50-100 par goutte de matrice. Les lumières peuvent être relativement clair (Figure 1) ou remplis de débris cellulaires et du mucus (Figure 1) ; la première est plus fréquente chez les sphéroïdes avec sauvage CFTR (wtCFTR) et le second en sphéroïdes CF. Masquage pour délimiter la zone luminale des sphéroïdes Figure 1 et D 1 est illustrée dans la Figure 1E et 1F, respectivement. Des exemples de cultures mal formé/infructueuse sphéroïde figurent dans la Figure 1 et 1 H.

Données fonctionnelles représentatives pour le type sauvage et homozygotes sphéroïdes HNE F508del CFTR sont montrées dans la Figure 2 a et 2 b, respectivement ; ces données sont représentant de > 10 échantillons HNE uniques dans le type sauvage et CFTR F508del sujets homozygotes30. En bref, les sphéroïdes avec CFTR fonctionnel gonflent, tandis que ceux avec houle CFTR dysfonctionnel significativement plus faible, ou peuvent rétrécir. Plus précisément, sphéroïdes de sujets souffrant de wtCFTR devraient gonfler plus d’une heure lorsque stimulé et devrait moins gonfler ou rétrécir si stimulée en présence de l’inhibiteur CFTR Inh172. À l’inverse, sphéroïdes d’un sujet homozygote pour F508del CFTR devraient soit rétrécir ou houle très légèrement, avec augmenté gonflement (ou moins craintive) lorsque pharmacologiquement corrigé avec les modulateurs CFTR VX809 et VX770. Les analyses antérieures de fiabilité sphéroïde au sein et entre les sujets du même génotype démontrent la séparation fonctionnelle des génotypes CFTR et modeste variabilité des mesures répétées30.

Composant de médias Solution mère Montant Stockage
Médias de l’expansion
DMEM / F-12 mélange nutritif « milieux de Base » Utilisation comme c’est contenants de 2 x 500 mL Conserver à 4 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Sérum de veau fœtal Utilisation comme c’est 50 mL Conserver à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Toxine cholérique 10 mg dans 1 mL d’eau stérile 1 ΜL Stock à-20 ºC de stocker jusqu'à six mois
Facteur de croissance épidermique 500 µg dans 1 mL d’eau stérile 20 ΜL Stock à-20 ºC de stocker jusqu'à six mois
Hydrocortisone 0,4 mg dans 400 µL d’eau stérile Toute quantité de 400 µL Faire des frais à chaque lot. Poudre de magasin à la température ambiante jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Adénine 24 mg dans 1 mL d’eau stérile Toute portion 1 mL Faire des frais à chaque lot. Poudre de magasin à la température ambiante jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Y-27632 3,2 mg dans 1 mL d’eau stérile Toute portion 1 mL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Média d’antibiotique
Amphotéricine B Utilisation comme c’est 1,2 mL Conserver à 4 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Ceftazidime 15 mg dans 1 mL d’eau stérile Toute portion 1 mL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Tobramycine 15 mg dans 1 mL d’eau stérile Toute portion 1 mL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Vancomycine 15 mg dans 1 mL d’eau stérile Toute portion 1 mL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant

Tableau 1 : Composants d’Expansion et de médias aux antibiotiques.

Composant de médias Solution mère Montant Stockage
DMEM / F-12 mélange nutritif « milieux de Base » Utilisation comme c’est contenants de 2 x 500 mL Conserver à 4 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Ultroser-G 20 mL d’eau stérile dans un flacon de 20 mL seul, lyophilisée Ultroser-g Toute portion 20 mL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à 4 ºC jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Fœtale Clone II Utilisation comme c’est 20 mL Conserver à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Stylo Strep Utilisation comme c’est 10 mL Conserver à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Extrait de cerveau de boeuf Utilisation comme c’est 2,48 mL Conserver à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Transferrine Utilisation comme c’est 250 ΜL Conserver à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Insuline Utilisation comme c’est 250 ΜL Conserver à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Éthanolamine Utilisation comme c’est 15 ΜL Conserver à température ambiante jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Épinéphrine 2,75 mg dans 1 ml d’eau stérile Toute portion 1 mL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à 4 ºC jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Triiodothyronine 8,4 mg dans 50 µL de DMSO Toute quantité de 50 µL Faire des frais à chaque lot. Stocker la poudre à-20 ° c jusqu'à la date d’expiration de fabricant
Hydrocortisone 7,24 mg dans 1 mL d’éthanol 1 ΜL Stock à-20 ºC de stocker jusqu'à six mois
Phsophoryletheanolamine 35,25 mg dans 1 mL d’eau stérile 1 ΜL Stock à-20 ºC de stocker jusqu'à six mois
Acide rétinoïque 3 mg dans 1 mL de DMSO 1 ΜL Stock à-20 ºC de stocker jusqu'à six mois

Tableau 2 : Composants du milieu de la différenciation.

Figure 1
Figure 1 : HNE Expansion et les caractéristiques structurales des sphéroïdes HNE. Images de fond clair de cultures d’expansion HNE pris sept jours après l’ensemencement démontrent avec succès (flèche blanche, panneau A) et formation de colonies HNE infructueuse (groupe B) sur un fond de fibroblaste de mangeoire. WtCFTR réussie et les homozygotes sphéroïdes F508del figurent dans les séries C et D, respectivement. Masquage pour délimiter la zone luminale des sphéroïdes de C/D est fourni dans les séries E et F, respectivement. Cultures de sphéroïde infructueux sont caractérisées par des petits, désorganisé les débris cellulaires (groupe G) et/ou désorganisé les amas de cellules (groupe H). Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Caractéristiques fonctionnelles des sphéroïdes HNE. Réponses fonctionnelles représentant des sphéroïdes wtCFTR provenant d’un donneur unique, quand ils sont stimulés par la forskoline/IBMX avec ou sans la présence de l’inhibiteur CFTR Inh172 apparaissent dans le panneau (A) chaque point représente la réponse à un sphéroïde unique. Réponses fonctionnelles représentant des sphéroïdes homozygotes F508del provenant d’un donneur unique, quand ils sont stimulés par la forskoline/IBMX avec ou sans la présence de VX809 et VX770 figurent dans le groupe (B). Barres d’erreur = SEM. ** p < 0,01 ; p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ce protocole décrit la génération dérivé de patient nasal sphéroïde de cultures de cellules capables de produire un modèle de fonction CFTR individualisé, spécifique. Il y a plusieurs étapes clés dans le processus qui doit être étroitement assisté pour éviter les difficultés. Tout d’abord est une acquisition bon échantillon du nez du patient. Doit avoir un bon échantillon > 50 000 cellules, limitée glaire/débris et être prêt pour le traitement de moins de 4 h (même si le succès est aussi facilement réalisable avec nuit en refuge d’expédition sur la glace). Pratique l’acquisition d’échantillons avec une curette ou un pinceau par le personnel de l’étude est nécessaire, qui est facilitée par la mise au point d’une acquisition précoce d’échantillon entre les mains d’un ou deux fournisseurs afin de maximiser leur confort. Deuxièmement, bonne technique nettoyer/stérile dans toutes les étapes de culture tissulaire est essentielle. Le principal mode de défaillance, dans notre expérience, pour toutes les cultures d’HNE est contamination bactérienne ou fongique, ce qui peut compliquer l’échantillon principal et autres cultures croissants dans l’incubateur. Ce risque n’augmente avec les cultures des sujets présentant une infection chronique (p. ex., CF), donc le succès repose en grande partie sur la capacité de maintenir les cultures propre et distincte. Notre pratique consiste à séparer un incubateur uniquement pour les cultures sujettes à une infection dans les premiers jours de la 5-7, protégeant les cultures anciennes, réussies d’une contamination accidentelle. En troisième lieu, il est important de regarder des cellules au cours de la phase d’expansion de près et éviter overconfluence. Si les cellules sont autorisés à rejoindre la confluence complet sur la plaque, il y a un risque que la culture va devenir sénescentes ou cellules commenceront à mourir et à détacher. Enfin, lorsque les cellules comme sphéroïdes de placage, il est important pour bien disperser les cellules par l’intermédiaire de la matrice et à un échantillon uniformément distribué sur plaque. Soit plus - ou moins - population des gouttes matrice conduira à l’échec de la culture, et grands amas de cellules ne produira pas des sphéroïdes réussies.

Mise en œuvre de ce protocole, les enquêteurs pourraient rencontrer quelques problèmes communs. Contamination, tel que mentionné plus haut, vaut mieux éviter en procurant un bon échantillon initial sans mucus et des techniques de culture propre. Si les cultures sont réussies grâce à l’expansion, mais aucun sphères différenciées ne sont formés, plusieurs questions ont pu. Si la matrice apparaît plus souvent vide, il est fort probable que les cellules ont été injectées à trop faible de densité ; augmenter la densité de semis de tentatives ultérieures d’environ 20 %. À l’inverse, si la matrice semble être « sale » avec des débris de cellules abondantes, il est probable que les cellules ont été injectées à trop haute d’une densité et les tentatives suivantes devrait utiliser une densité de semis réduite d’environ 20 %. Une complication fréquente des semis après l’alimentation et l’entretien est le détachement de la matrice du récipient de culture. Cela est causé par l’échange des médias trop agressive et peut être évité en prudemment et manuellement changeant des médias avec une pipette de 1 mL, pas mur d’aspiration. Panne, sphères peuvent encore être stimulées et imagés, bien que cela peut être difficile si la matrice « flotte » dans le puits au cours de l’imagerie, nécessitant la cartographie prudente des sphéroïdes dans le puits.

Les enquêteurs peuvent poursuivre plusieurs modifications au protocole, selon les besoins de leur laboratoire. Pour l’imagerie haute résolution des sphéroïdes, que nous avons précédemment substitué les plaques de 4 puits avec des options de verre optique, y compris le fond en verre 35 mm plats ou des diapositives de la chambre. Cela permet d’imagerie à haute résolution, vivre des sphéroïdes, mais peut réduire le débit. Sinon, pour augmenter le débit, plus petites parties aliquotes de cellules dans la matrice peuvent être semés dans les autres vaisseaux (p. ex., les plaques de culture de 24 puits). Dans notre expérience, les sphéroïdes poussent mieux avec la matrice sous forme de « goutte » par opposition à la formation d’une feuille sur le fond du puits ; par conséquent, nous avons eu le meilleur succès avec des gouttelettes au moins 25 µL. enquêteurs voudra peut-être modifier la densité de la matrice en diluant avec les médias. Cela réduit le montant total de matrice nécessaire, améliorer le coût du test. Cela peut aussi, toutefois, modifier la composition de sphéroïde. Dans notre expérience antérieure, des concentrations plus faibles de la membrane basale matrice conduisent à changé structure de sphéroïde, avec formation soit partielle ou complète des sphéroïdes dans une morphologie « cell-apex-out ». Par conséquent, sphéroïdes générées par les modifications de protocole dans la concentration de la matrice doivent être évalués de prudemment pour morphologie avant tentative de tests fonctionnels. Enfin, autre stimulant ou médicaments inhibiteurs ou différentes concentrations de ces médicaments, pourraient être employées. La forskoline, IBMX et Inh172 ont été choisis pour nos études à ces concentrations basées sur l’expérience acquise à l’ALI cultures31. D’autres médicaments (p. ex., l’isoprotérénol stimulation, GlyH101 pour l’inhibition) peut mieux s’appliquent à l’étude de l’enquêteur. De même, à l’aide de différentes concentrations de forskoline, IBMX ou Inh172 peut modifier la plage dynamique du test, cependant, nous n’avons pas systématiquement testé ces options.

Compte tenu du nombre existant ex vivo dérivé de patient CFTR tests, le modèle décrit est remarquable pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord, il capitalise sur les cellules nasales comme une source facilement obtenue du tissu respiratoire. Achat HNE peut être effectuée en toute sécurité avec une formation minimale dans presque tous les milieux (clinique, OR, visite de recherche) dans tous les groupes d’âge25. Cela facilite l’approvisionnement de l’échantillon solide et répéter d’échantillonnage si nécessaire en raison des difficultés de croissance ou de contamination. Par rapport à organoïdes intestinal, sphéroïdes HNE sont moins bien caractérisés et apparaissent ont une gamme dynamique plus petite dans le présent formulaire, cependant, utiliser des voies respiratoires au lieu de tissus GI peut être un avantage clé, comme plusieurs pilotes de maladie CF (par exemple clairance mucociliaire, expression du canal sodium épithélial) ne sont pas équivalents dans le tube digestif. Par opposition aux cultures d’ALI planes, des cellules HNE, sphéroïdes poussent plus vite et peuvent être plus représentatif des conditions de in vivo , mesurer un processus physiologique (l’homéostasie des liquides) qui peut être plus pertinent que l’électrophysiologie seul32. En améliorant le temps de l’approvisionnement de l’échantillon à tester, contamination potentielle est réduite, ce qui accroît les chances de succès de la culture. Enfin, la nature 3 dimensions du modèle peut-être être propices au roman et/ou lignes complémentaires de la recherche en développement des voies respiratoires ou la morphologie qui ne sont pas réalisables dans les cultures de ALI (p. ex., mucus luminale suivi, études rapides de la différenciation, etc.).

Il y a plusieurs limitations principales de sphéroïdes HNE comme un test de fonction CFTR. Tout d’abord, ce test reste relativement faible débit. En utilisant les méthodes actuelles, acquisition d’images plus d’une heure pour chaque condition de culture, et analyse prend un supplémentaire de 20-30 min par condition. Cela est aggravé par le degré de chevauchement entre certaines conditions (tel que démontré dans la Figure 2 a), qui nécessite un plus grand nombre de mesures (ce chevauchement en soi peut également représenter une limitation de la sensibilité de ce test). Ainsi, une seule expérience avec 4-6 conditions nécessite près de deux jours pour l’achèvement. Débit peut être amélioré en employant des méthodes de capture d’image automatique et d’analyse ; ces adaptations sont en cours. Deuxièmement, ce modèle exige une grande quantité de matrice, qui peut devenir coûteux. Comme mentionné ci-dessus, la dilution de la matrice peut aider à surmonter cet obstacle, mais doit être prise avec prudence, comme les altérations de la croissance matrice entraînera probablement des altérations dans la morphologie de l’ellipsoïde. Troisièmement, ce modèle s’appuie sur sphéroïde mesures dans un plan XY uniquement et ne tient pas compte de gonflement dans le plan Z, qui peut introduire un biais. Alors que les analyses antérieures de reproductibilité ont été rassurants, cette lacune pouvait être compensée par l’utilisation de l’imagerie automatisée avec Z-plane de numérisation pour calculer le volume30. Enfin et surtout, beaucoup de travail pour attacher les réponses du sujet individuel en vivo drug réponse sphéroïde est encore à compléter. En l’absence de cette corrélation, il ignore la valeur prédictive du modèle - tout en promettant.

Génération et analyse des sphéroïdes HNE permettent ex vivo analyse de l’activité individuelle de CFTR et modulation, qui pourrait servir en fin de compte un modèle préclinique de la réaction aux médicaments. En outre, étant donné la grande variabilité dans la gravité de la maladie CF, un tel modèle individualisé peut donner un aperçu de microenvironnement des voies aériennes unique du sujet. De cette façon, un tel modèle peut être utile pour l’étude des termes biologie CFTR et aide à comprendre l’hétérogénéité de la maladie. Utilisation future de ce modèle, mais aussi d’autres modèles similaires de la fonction CFTR individualisée, détient la promesse de mieux comprendre CFTR biologie en laboratoire et au lecteur personnalisé et de la médecine de précision dans la clinique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, octroyer le numéro CLANCY14XX0 et par le biais de la Fondation de la fibrose kystique, octroyer le numéro CLANCY15R0. Les auteurs tiennent à remercier Kristina Ray pour son aide dans le recrutement de patients et de la surveillance réglementaire. Les auteurs tiennent également à remercier le groupe de travail HNE, soutenu par la Fondation de la fibrose kystique, qui ont aidé à la génération des capacités de culture HNE : Preston Bratcher, Calvin Cotton, Martina Gentzsch, Elizabeth Joseloff, Michael Myerburg, Dave Nichols, Scott Randell, Steve Rowe, g. Salomon Marty et Katherine Tuggle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf Tube USA Scientific  4036-3204
150 mL Filter Flask Midsci  TP99150 To filter Media
15 mL Conical Tube Midsci  TP91015
1 L Filter Flask Midsci  TP99950 To filter Media
35 mm Glass-Bottom Dish MatTek Corporation P35G-0-20-C Optional
3-Isobutyl-1-Methylxanthine (IBMX) Fisher Scientific  AC228420010  Prepare a 100 mM stock solution of 22.0 mg in 1 mL of DMSO
50 mL Conical Tube Midsci   TP91050
Accutase Innovative Cell Technologies, Inc. AT-104 Cell detachment solution
Adenine Sigma-Aldrich A2786-25G See Table 1
Amphotericin B Sigma-Aldrich A9528-100MG See Table 1
Bovine Brain Extract (9mg/mL) Lonza  CC-4098 See Table 2
Ceftazidime hydrate Sigma-Aldrich C3809-1G See Table 1
Cell Scrapers 20 cm  Midsci  TP99010
CFTR Inh172 Tocris Bioscience 3430 Prepare a 10 mM stock solution of 4.0 mg in 1 mL of DMSO
Cholera Toxin B (From Vibrio cholerae) Sigma-Aldrich C8052-.5MG See Table 1
CYB-1 Medical Packaging Corporation CYB-1 Cytology brush
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D5879-500ML
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12 Hepes  Life Technologies  11330-057 Base Medium; See Tables 1 and 2
Epidermal Growth Factor (Recombinant Human Protein, Animal-Origin Free) Thermo Fisher Scientific PHG6045 See Table 1
Epinephrine Sigma-Aldrich E4250-1G See Table 2
Ethanol Fisher Scientific  2701
Ethanolamine Sigma-Aldrich E0135-500ML 16.6 mM solution; See Table 2
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) TCI America  E0084
Fetal Bovine Serum (high performance FBS) Invitrogen  10082147 See Table 1
Forskolin Sigma-Aldrich F6886-50 Prepare a 10 mM stock solution of 4.1 mg in 1 mL of DMSO
Growth Factor-Reduced Matrigel Corning, Inc. 356231 Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free, 10 mL.
Hemacytometer Hausser Scientific 1483
Human Collagen Solution, Type I (VitroCol; 3 mg/mL) Advanced BioMatrix 5007-A Collagen solution
HyClone (aka FetalClone II)  GE Healthcare  SH30066.03HI See Table 2
Hydrocortisone StemCell Technologies 07904 See Tables 1 and 2
Insulin, human recombinant, zinc solution Life Technologies  12585014 4 mg/mL solution; see Table 2
IVF 4-Well Dish, Non-treated NUNC (via Fisher Scientific) 12566350 4-well plate for spheroids; similar well size to a 24-well plate
MEF-CF1-IRR Globalstem GSC-6001G Irradiated murine embryonic fibroblasts
Metamorph 7.7 Molecular Devices Analysis Software; https://www.moleculardevices.com/systems/metamorph-research-imaging/metamorph-microscopy-automation-and-image-analysis-software for a quote
Olympus IX51 Inverted Microscope Olympus Corporation Discontinued Imaging Microscope. Replacment: Olympus IX53, https://www.olympus-lifescience.com/pt/microscopes/inverted/ix53/  for a quote
Pen Strep Life Technologies  15140122 See Table 2
Phsophoryletheanolamine Sigma-Aldrich P0503-5G See Table 2
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625-50MG See Table 2
Rhinoprobe Arlington Scientific, Inc. 96-0905 Nasal curette
Slidebook 5.5 3i, Intelligent Imaging Innovations Discontinued Imaging Software. Replacement: Slidebook 6, https://www.intelligent-imaging.com/slidebook for a quote
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 20012050
Sterile Water Sigma-Aldrich W3500-6X500ML
Tissue Culture Dish 100 Techno Plastic Products 93100 Tissue culture dish for expansion
Tobramycin Sigma-Aldrich T4014-100MG See Table 1
Transferrin (Human Transferrin 0.5 mL) Lonza  CC-4205 See Table 2
Triiodothryonine Sigma-Aldrich T6397-1G 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt  [T3]; See Table 2
Trypsin from Porcine Pancreas Sigma-Aldrich T4799-10G
Ultroser-G Crescent Chemical (via Fisher Scientific) NC0393024 20 mL lypophilized powder; See Table 2
Vancomycin hydrochloride from Streptomyces orientalis Sigma-Aldrich V2002-5G See Table 1
VX770 Selleck Chemicals S1144 Prepare a 1 mM stock solution of 0.4 mg in 1 mL of DMSO
VX809 Selleck Chemicals S1565 Purchase or prepare a 10 mM stock solution of 4.5 mg in 1 mL of DMSO
Y-27632 Dihydrochloride  ROCK inhibitor  Enzo LifeSciences  ALX-270-333-M025  See Table 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Médecine numéro 134 fibrose kystique CFTR médecine Precision organoïde sphéroïde cellule nasale Culture cellulaire
Génération de cellules épithéliales nasales humaines sphéroïdes pour mucoviscidose individualisé Transmembrane Conductance Regulator étude
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