Summary
Эта статья описывает подробная методология для случайных мутагенеза целевого гена в деления дрожжей. В качестве примера мы нацелены на rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, и экран для мутации, которые дестабилизируют гетерохроматина.
Abstract
Случайные мутагенеза целевого гена обычно используется для выявления мутаций, которые дают желаемого фенотип. Из методов, которые могут быть использованы для достижения случайных мутагенеза, ошибкам ПЦР является удобной и эффективной стратегии для генерации совокупность разнообразных мутантов (т.е., мутант библиотека). Ошибкам ПЦР является методом выбора, когда исследователь стремится мутировать предопределенных региона, например кодирвоания гена оставляя других регионах геномной не влияет. После того, как мутант библиотека усиливается ошибкам ПЦР, это должны клонироваться в подходящей плазмиду. Размер библиотеки, генерируемых ошибок ПЦР ограничивается эффективность клонирования шаг. Однако в деления дрожжи, Делящиеся дрожжи, клонирования шаг можно заменить с помощью высокоэффективных Одношаговая фьюжн ПЦР для создания конструкций для преобразования. Мутанты желаемый фенотипы могут быть выбраны с помощью соответствующих журналистам. Здесь мы опишем эту стратегию в деталях, взяв в качестве примера, репортер, вставляются в прицентромерного гетерохроматина.
Introduction
Форвард генетика является классическим методом, в котором исследователи стремятся естественным мутантов, которые отображают особое фенотип и генетического анализа. В обратной генетики мутации вводятся в ген интереса и изучены фенотипа. В последнем случае случайные мутагенеза целевого гена часто используется для создания пула мутантов, которые впоследствии выбраны для желаемый фенотипы, такие как чувствительность температуры или изменены ферментативную активность. Различные методы могут использоваться для достижения случайных мутагенеза, включая ошибкам ПЦР1; УФ облучения2; Химические мутагены, таких как этиловый метансульфонат (EMS) или азотистой кислоты3; использование временных мутатора штаммов, например чрезмерной выражая mutD5 4; и5Перетасовка ДНК.
Здесь мы описываем реверс генетика стратегия, в которой мы используем ошибкам ПЦР для создания мутантных бассейны для целевых генов в деления дрожжей. Как один догадаться из названия, этот метод создает мутаций, умышленно внося ошибки во время ПЦР. В отличие от других методов мутагенеза ошибкам ПЦР позволяет пользователю определять области, чтобы быть mutagenized. Это делает его особенно полезным в усилия для изучения функции белка/домена интерес.
Для демонстрации этой процедуры случайного мутагенеза, мы здесь использовать rpt4 +, которая кодирует Субблок 19S протеасомы, в качестве примера. Rpt4 было показано, что Протеолиз независимые функции в организмах Кроме деления дрожжевой6,,78,9, и дефект в протеолиза может вызвать косвенные эффекты изменяя белки уровнях. Мы, таким образом, для мутантов, которые вызвали протеолиза независимые изменения, с целью изучения функции протеасомы на гетерохроматина.
Ошибкам ПЦР может применяться к любому региону гена, настроив расположение, в котором праймеры привязки. Мутантов, которые демонстрируют желаемого фенотипические изменения могут быть идентифицированы с соответствующим журналистам. Здесь, мы использовали ade6 + репортер вставлены в центромер 1 внешний Повторите региона (otr)10. Учредительный гетерохроматин формируется в этом регионе11, поэтому ade6 + репортер замолчать в состоянии дикого типа; Это обозначается красным колоний10. Мутации, что дестабилизирует учредительного гетерохроматин на центромер приведет к выражению ade6 + репортер, который визуализируется как белых колоний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка носителя
- Подготовьте экстракт дрожжей с добавками (да), да без аденин (да низкий Аде), средний Pombe глутамата (PMG12) и PMG без аденин (PMG-Ade) путем смешивания компонентов, как описано в таблице 1. Да-Аде (низкий Аде) и PMG-фасадные плиты имеют все те же компоненты, но аденин опущен из последнего.
- Используйте следующие запас соли (50 x): 52,5 г/Л MgCl2·6H2O, 2 г/Л CaCl2·2H2O, 50 г/Л хлористого калия, 2 г/Л Na2,4 в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
- Используйте следующие витамин (1, 000 x) складе: 1 г/Л пантотенат, никотиновая кислота 10 г/Л, инозитола 10 г/Л, 10 мг/Л биотина в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
- Используйте следующие минеральные (10, 000 x) складе: кислоты борной 5 г/Л, 4 г/Л MnSO4, 4 г/Л ZnSO4·7H2O, 2 г/Л FeCl2·4H2O, 0,4 г/Л MoO3, 1 г/Л ки, 0,4 г/Л CuSO4·5H2O , 10 г/Л лимонной кислоты в дистиллированной воде. Фильтр стерилизации с помощью фильтра размер пор 0,22 мкм и хранить при 4 ° C.
Примечание: Да жидкой среды могут быть сделаны исключения агар.
- Автоклав среднего и охладите его до 60 ° C при перемешивании с баром перемешать со скоростью 200 об/мин.
- Для пластин да + G418 (geneticin) добавьте раствор 1 мл/Л G418 да среднего.
- Используйте следующие G418 (1, 000 x) складе: 100 мг/мл G418 в дистиллированной воде. Фильтр стерилизовать, используя фильтр размер пор 0,22 мкм, аликвота 1,5 мл пробирок, и хранить при температуре-20 ° C.
- Перемешать еще 5-10 мин и Алиготе СМИ в Петри 90 мм (1 Л средних аликвоты для примерно 40 чашек Петри. Хранить пластины при 4 ° C.
2. клонирование rpt4 + и его 5' / 3' необычных
- Выполнять ПЦР праймеры p1 и p2 (рис. 1A) с помощью деления дрожжевой геномной ДНК (геномная ДНК) как шаблон в суммарный объем 50 мкл (~ 1 мкг ДНК, 20 U фермента, 1 x реакции буфера), и применение циклов реакции, описанные в таблице 2 для усиления 3,315-база пара (bp) фрагмент, состоящий из rpt4 + и его 5' / 3' необычных. Очищайте продукт PCR, используя комплект для очистки13 как указано заводом-изготовителем (рис. 1A).
- Дайджест pBlueScript KS(-) вектор14 и усиленные фрагмент ДНК, содержащие rpt4 + с его 5' / 3' необычных с BamH1 и Xho1 в общем объеме 20 мкл (~ 1 мкг ДНК, 20 U фермента, 1 x буфер пищеварения) при 37 ° C в водяной бане для 16-18 h (рис. 1B).
- Гель Очистить переваривается вектор (1,2% геля агарозы) и ДНК вставить, выполняя TAE-основе геля агарозы (100 V, 1 h), вырезание ДНК полос желаемых размеров и изоляции ДНК с гель добыча комплект15.
- Перевязать вектор и вставка ДНК с помощью T4 ДНК лигаза, выполнив реакции перешнуровки 20 мкл, содержащих 50-100 ng вектора ДНК, ~ вывозимому Молярная избыток Вставка ДНК, 400 U T4 ДНК лигаза и 1 x лигирование буфера. Инкубируйте эту смесь на 18 ° C для 16-18 ч.
- Превратить 100 мкл E. coli DH5α перевязаны ДНК путем применения теплового шока для 70 s при 42 ° C. Добавьте 1 mL фунта и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C для восстановления. Выполнять центрифугирования (13800 x g), выбросьте пластину супернатанта, все преобразованные E. coli клетки на тарелках LB-ампициллин (LA) и инкубировать при 37 ° C для 16 h.
- Выбрать 4-8 колоний с зубочистками и расти на ночь при 37 ° C в 3 мл Ла-среде.
- Изолировать плазмид с16 плазмида комплект очистки используется согласно протоколу производителя и выполнять аналитические энзима ограничения пищеварения с 5 мкл изолированных плазмид, 5 U каждого энзима ограничения (BamH1 и Xho1) и 1 x ограничение буфера. Инкубируйте реакционной смеси при 37 ° C в водяной бане для 3 h. подтверждение клонирования путем виртуализации кандидат плазмид.
3. Введение немого мутации (Xho1 ограничение сайта)
- Дизайн пары праймеров 33-bp (p3 и p4), которые содержат желаемого мутации в противном случае дополнительные последовательности.
- Выполнять ПЦР с высокой точностью полимеразы17 (рис. 1 c) в общем объеме 25 мкл (10 нг клонирования плазмиды, 2 мкл 10 пмоль грунтовка микс, 2 U фермента, 1 x реакции буфера) с помощью Велоспорт параметров, перечисленных в таблице 3.
- Дайджест шаблон плазмида с Dpnя в общем объеме 20 мкл (20 U фермента, буфер 1 x пищеварения) при 37 ° C в воде ванны для 1 h.
- Преобразование, распространять, изолировать и последовательности плазмида, содержащий немого мутации, как описано в шагах 2.5-2.7.
Примечание: Молчаливый мутации могут быть введены с помощью клонирования метод, который позволяет для объединения нескольких фрагментов ДНК в одном реакция18.
4. случайные мутагенеза rpt4 + ошибкам ПЦР
- Выполнить-ошибкам PCR, используя плазмида с немого мутации (сайтXho1 ) как шаблон, грунтовки p5 и p6, суммарный объем 50 мкл (количество шаблон, определенный на шаге 4.1.1, 2 мкл 10 пмоль грунтовка микс, 2,5 U фермента, 1 x реакции буфера) , и специальные полимеразы, предназначенный для создания высокой ошибка оценить19 (рис. 1 d). Выполните ПЦР, как описано в таблице 2.
- Используйте 4-5 мкг шаблоне плазмиды для управления частотой мутаций 1 bp/КБ (kilobase).
Примечание: Высокой концентрации (> 500 нг/мкл) плазмида, который может быть получен с помощью мини-prep комплект20, не требуется.
- Используйте 4-5 мкг шаблоне плазмиды для управления частотой мутаций 1 bp/КБ (kilobase).
- Для подтверждения продукт PCR 2670 bp (1,2% геля агарозы) используйте гель-электрофорез. Гель очистить этот продукт PCR, как описано в пункте 2.5.
5. Подготовка Fusion ПЦР фрагментов (Кан, 3' УТР)
- Выполнять ПЦР с помощью pFA6a-KANMX621 как шаблон, грунтовки p7 и p8, и условий, перечисленных в таблице 4 для получения фрагмента маркер (Кан). Гель Очистить результирующий фрагмент 1480 bp, как описано в шаге 2,5 (Рисунок 1E).
- Проверьте, если остановка кодон целевых для кодирования региона прилегающих гена и мутации гена, разделенных более чем 500 bp. Эндогенные Терминатор не могут быть использованы, когда этот регион является менее 500 bp; скорее ADH -Терминатор должны использоваться вместо эндогенного Терминатор. Протокол изменений, необходимых для использования ADH -Терминатор представлены в таблице 5.
Примечание: Эти изменения применяются только когда Терминатор АДГ , которая доступна в pFA6a-3га KANMX6 плазмиды, используется вместо эндогенного Терминатор.
- Проверьте, если остановка кодон целевых для кодирования региона прилегающих гена и мутации гена, разделенных более чем 500 bp. Эндогенные Терминатор не могут быть использованы, когда этот регион является менее 500 bp; скорее ADH -Терминатор должны использоваться вместо эндогенного Терминатор. Протокол изменений, необходимых для использования ADH -Терминатор представлены в таблице 5.
- Выполнять ПЦР с клонированной rpt4 +-содержащие вектор как шаблонов и капсюли p9 и p10 в суммарный объем 50 мкл (20 нг клонирования плазмиды, 2 мкл 10 пмоль грунтовка микс, 2 U фермента, 1 x реакции буфера), с помощью условий, представлены в таблице 6. Гель Очистить полученные 506-ВР 3' УТР фрагмента (Рисунок 1E).
6. поколение конструкции преобразования сплавливанием ПЦР (Рисунок 1E)
- Подготовьте 3 фрагменты (mutagenized rpt4 +, Кан и 3' УТР) на 50 нг/мкл.
- Выполните слияние, которое ПЦР из трех фрагментов с помощью грунтовки p11 и p12, как описано в таблице 7. (Протокол для синтеза ПЦР является модификацией оригинальный протокол22). Очищает основной продукт PCR 4398 ВР.
- Использовать rpt4 +: KAN:3' УТР фрагменты в соотношении 1:3:1 для получения оптимальных результатов.
Примечание: Общее количество дна вставки не должна превышать 500 нг. Рекомендуемое количество rpt4 +: KAN:3' УТР-50 нг ng:50 ng:150. Mutagenized регион составляет примерно 1,6 КБ, поэтому минимальное количество дрожжей колоний, которые будут учитывать для всех возможных комбинаций каждой базы мутировал трех других 1600 x 3 = 4800 колоний. Потому что один преобразование реакции обычно дает 400-500 колоний, необходима по крайней мере 10 реакции сплавливания построить ПЦР стоит. Эта потребность может удовлетворяться путем простого увеличения суммы реакции (то есть, количество трубок ПЦР) по десять раз.
- Использовать rpt4 +: KAN:3' УТР фрагменты в соотношении 1:3:1 для получения оптимальных результатов.
7. Преобразование деления дрожжевой путем электропорации (Рисунок 1F)
- Прививать дрожжей до 10 мл да средней насыщенности, инкубации для более чем 16 h.
- Разбавить клетки оптическая плотность 600 Нм (600OD) 0,2 в 200 мл среды да и Инкубируйте на 30 ° C с встряхивания в течение 5-6 ч, ОД600 = 0,6 - 0,8.
- Концентрат клетки ОД600 = 30, обойтись в четыре 50 мл конические трубы и холод на льду за 10 мин.
- Урожай клетки, выполняя центрифугирования в 1050 x g 3 мин при 4 ° C. Место труб и 10 электро кюветы на льду. Выполните 7.3-7,8 на льду.
- Отменить супернатант и добавляют 15 мл 1,2 М сорбитол. Осторожно встряхните трубы для Ресуспензируйте клетки.
- Центрифуга клетки на 1050 x g 3 мин при 4 ° C.
- Повторите шаги 7.4 и 7.5. Выбросите супернатант. Добавить 500 мкл сорбитол 1,2 М в каждую пробирку, Ресуспензируйте клетки и собирать все ячейки в одном 15 мл конические.
- Добавить сорбитол 1,2 М до 2,4 мл (OD600 = 10 на 0,2 мл). Держите трубку на льду.
- Добавить 200 мкл сорбитол приостановлено клеток (убедитесь, что они являются полностью приостановлены) EP, тубы фьюжн ПЦР построить, хорошо перемешать и передать образец электро кювета.
- Electroporate клетки со следующими параметрами: грибки, СХС (2.00kV, 1 импульса).
- 600 мкл сорбитол 1,2 М для каждой электро кювета для общего объема 800 мкл, а затем распространилась клетки на четырех да пластины (200 мкл/плита). Десять электро кюветы будет обойтись 40 да пластины.
- Инкубируйте пластины на 30 ° C в течение 24 ч.
- Выполните реплики покрытие для да + G418 и инкубировать пластины при 30 ° C в течение 3 дней.
8. Выбор дестабилизирующих гетерохроматин мутантов и проверка на ложных срабатываний
- Для каждой пластины да + G418 выполняют реплики обшивка да-Аде (низкий Аде) и плиты PMG-Аде (No Аде). Инкубируйте реплики пластины для 1-2 дня при температуре 30 ° C, до тех пор, пока некоторые из колоний на тарелках да-Аде Показать красную окраску (рис. 1 g).
- Сравните да-Аде и PMG-Аде пластины и выберите клетки, которые показывают розовый или белый на пластину да-Аде и также растут на пластину PMG-Аде. Не выбирайте колонии без роста на PMG-Аде, как они ложных срабатываний (например, отражающие учет Кан кассеты на сайте непромысловых других в геноме).
- Выберите примерно 1 х 105 клетки от каждой колонии и инкубировать в 10 мкл СЗЗ раствора, содержащего zymolyase 100 Т 2,5 мг/мл при 37 ° C для по крайней мере 30 минут использования 1 мкл этого решения для выполнения как отправной шаблон для колонии PCR (рис. 1 H).
- Сделайте СЗЗ (50 мл), смешивая 30 мл 2 M сорбитола, 4.05 мл 1 M Na2HPO4, 0,95 мл NaH2PO4 и 15 мл дистиллированной воды (окончательный рН, 7.5). Образцы (5 мл) можно дополнить zymolyase и хранятся в 500 мкл аликвоты при-20 ° C до использования.
- Выполняйте гель-электрофорез (1,2% агарозном геле, 180V, 20 мин) для визуализации результатов + колонии PCR. Выберите реакций, которые exhibit диапазоны PCR правильного размера и дайджест 5 мкл каждого продукта реакции с Xho(4 U фермента, 1 x пищеварение буфера, Ванна воды 37 ° C, 1 h) для отсеивания ложных срабатываний (рис. 1 H).
- Выполняйте электрофорез геля для визуализации сборники XhoI (1.2% агарозном геле, 180 V, 20 мин). Марк колоний, чьи продукты PCR разрезаются на XhoIи пропатчить их да + G418 пластин (Рисунок 1I).
- Изолировать геномная ДНК от деления клеток дрожжей и выполнить последовательность продуктов ПЦР23. Сравните полученные последовательности с одичал типа последовательности для определения мутации (Рисунок 1I).
- Прямо вновь ввести mutation(s) одичал тип клеток путем преобразования их с конструкциями фьюжн, усиливается ПЦР мутантные клетки23. Для подтверждения фенотип в недавно сделал мутантные клетки (Рисунок 1J) используйте кровянистые выделения.
- Фьюжн преобразование конструкции можно легко усиливается ПЦР праймеры p1 и p10 с использованием геномной ДНК мутантов как шаблон в суммарный объем 50 мкл (~ 1 мкг ДНК, 20 U фермента, 1 x реакции буфера) и применения циклов реакции, описанные в таблице 2 . Преобразование конструкции могут быть сделаны следующие шаги 7,1-7.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Приобретенные Rpt4 мутантов, выполнив процедуры, описанные на рис. 1 могут быть проанализированы путем оценки цвета колоний. Цвета колоний запятнаны на соответствующие пластины в уменьшении количества клеток на рисунке 2. Ade6 + репортер вставлены в регионе гетерохроматин замолчать в одичал тип и показывает красный колоний в да-фасадные плиты. Как только дестабилизировали гетерохроматин и репортер ade6 + выражается, белых колоний можно наблюдать в да-фасадные плиты как clr4Δ мутант. Отобранных мутантов Rpt4, как показано. rpt4-1 мутант показывает наиболее тяжелых гетерохроматин дестабилизации.
Рисунок 1 : Схематическое представление протокола. (A) схематическое представление продукта PCR полученные первый раунд PCR, который выполняется с праймерами 1 и 2. (B) ограничения based клонирование фрагмента rpt4 + . (C) сайт Направленный мутагенез клонированных вектора используется для введения немого мутации, которая добавляет узел ограничения XhoI . (D) случайные мутагенеза rpt4 + кодирования региона осуществляется с помощью ошибкам ПЦР. (E) мутировавших rpt4 + фрагмент, Кан фрагмент и 3' УТР фрагмент соединены фьюжн ПЦР для создания преобразования готовых кассету. (F) деления дрожжевой клетки трансформируются с сплавливанием ПЦР конструкцию, которая заменяет последовательность эндогенного rpt4 + гомологичная рекомбинация. (G) Кан выбранные колонии являются реплики покрытием да-Аде (низкий Аде) и PMG-Аде (No Аде) плиты, и выбираются положительных колоний. (H) ПЦР и последующего XhoI ограничение продукта PCR используются чтобы избежать ложных срабатываний. (I) мутация, вызывающая фенотипа идентифицируется ямочный ремонт отдельных колоний, размножения клеток, добыча геномной ДНК (геномная ДНК) и последовательность в соответствующей части rpt4 +. (J) подтверждаются причинный мутации (и ложных срабатываний, исключены), непосредственно вводя мутации клеток одичал типа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Гетерохроматина де репрессий мутантов Rpt4. Принципиальная схема otr1::ade6 + репортер (вверху). 5 раз серийных разведений выберите отобранных мутантов Rpt4 были замечены на указанный пластины в порядке возрастания уровня гетерохроматин дестабилизации (внизу). Эта цифра была изменена из статьи «19S протеасомы непосредственно участвует в регуляции гетерохроматина, распространяя в деления дрожжевой» Seo et al., 201724. Не обрезать рисунок можно найти в оригинальной статье. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Компонент | Тип пластины | |
| ДА | ПМГ | |
| Экстракт дрожжей | 5 г/Л | |
| Глюкоза | 30 г/Л | 20 г/Л |
| Аденин | 0,15 г/Л | по 0,1 г/Л |
| Гистидин | 0,15 г/Л | по 0,1 г/Л |
| Лейцина | 0,15 г/Л | по 0,1 г/Л |
| Урацила | 0,15 г/Л | по 0,1 г/Л |
| Калия водорода pthalate | 3 г/Л | |
| Na2HPO4 | 2.2 г/Л | |
| L-глутаминовая кислота | 3,75 г/Л | |
| Соли | 20 мл/Л | |
| Витамины | 1 мл/Л | |
| Полезные ископаемые | 0,1 мл/Л | |
| Агар | 16 г/Л | 16 г/Л |
Таблица 1. Компоненты, да и PMG пластины
| Температура | Время | Циклы |
| 95oC | 2 мин | 1 цикл |
| 95oC | 20 s | 30 циклов |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 мин | |
| 72oC | 8 мин | 1 цикл |
| 8oC | Удерживайте |
Таблица 2. Рекомендуемая программа ПЦР для сайта Направленный мутагенез
| Температура | Время | Циклы |
| 95oC | 2 мин | 1 цикл |
| 95oC | 30 s | 19 циклов |
| 55oC | 1 мин | |
| 72oC | 7 мин | |
| 72oC | 10 мин | 1 цикл |
| 8oC | Удерживайте |
Таблица 3. Рекомендуемая программа ПЦР для ошибок PCR
| Температура | Время | Циклы |
| 95oC | 2 мин | 1 цикл |
| 95oC | 20 s | 30 циклов |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 мин | |
| 72oC | 8 мин | 1 цикл |
| 8oC | Удерживайте |
Таблица 4. Рекомендуемые программы ПЦР для получения фрагмента Кан
| Изменения | Кому | Пример rpt4 + | |
| Шаблон вектор | pFA6a-3га KANMX6 | ||
| Вектор привязки последовательность p7 | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| Висячие последовательность p7 | Последний 50bp последовательность, включая стоп-кодон | ||
| Висячие последовательность p8 | Первая последовательность 50bp сразу после остановки кодон (дополнительные последовательности) | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| Последовательность p9 | Начать прямо после стоп-кодон | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| Последовательность p10 | Производят ~ 500bp фрагмент с p9 (дополнительные seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Таблица 5. Изменения, необходимые при ADH-Терминатор используется вместо эндогенного Терминатор
| Температура | Время | Циклы |
| 95oC | 2 мин | 1 цикл |
| 95oC | 20 s | 30 циклов |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 мин | |
| 72oC | 8 мин | 1 цикл |
| 8oC | Удерживайте |
Таблица 6. Рекомендуемые программы ПЦР для получения фрагмента UTR 3'
| Температура | Время | Пандус | Циклы |
| 94oC | 2 мин | 1 цикл | |
| 94oC | 20 s | 10 циклов | |
| C 70o | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 мин | 0.2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 циклов | |
| C 70o | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 мин | 0.2 oC/s + s 5/цикл | |
| 94oC | 20 s | 10 циклов | |
| C 70o | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 мин | 0.2 oC/s + s 20/цикл | |
| 72oC | 10 мин | 1 цикл | |
| 8oC | Удерживайте |
Таблица 7. Рекомендуемая программа ПЦР для fusion PCR
| CBL1877 | h + | otr1R ade6-210 leu1-32 ura4-D18 (ГД glu) Sph1:ade6 |
Таблица S1: Штамм, используемые в данном исследовании
Таблица S2: Список праймеры, используемые в данном исследовании
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Случайные мутагенеза через ошибкам ПЦР является мощным инструментом для создания разнообразных пул мутантов в данном регионе. Этот метод особенно полезен для исследований, которые стремятся оценивать функцию белка при конкретных обстоятельствах. Например мы здесь используется ошибкам ПЦР для оценки функции Субблок протеасом 19S Rpt4, в гетерохроматина. Варьируя региона мишенью ошибкам ПЦР и корректировать условия отбора, мы были способны мутировать клетки в регионе геномной интерес и экран для желаемого фенотип. Недавно подобный метод был использован для изоляции деления дрожжевой клетки укрывательство мутации в шпиндель полюс тела компонент25.
Ключевым преимуществом случайных мутагенеза является, что он может применяться для неосновных и основных генов. Случайные мутагенеза важно генов может принести разнообразных мутантов, такие тонкие и/или частичного функциональных дефектов, которые позволяют жизнеспособность клеток быть устойчивым, или мутанты, функции которых затрагиваются только под конкретные условия. Примером последнего является мутант чувствительных к температуре. Такие мутанты могут быть изолированы с помощью 5 мг/Л phloxine B, который пятна умирающих клеток в красном и позволяет медленно растущих клеток следует отличать от смерти клетки26.
Важнейшим шагом этого протокола является ошибкам шаг ПЦР. На этом этапе важно контролировать частоту мутаций, которые могут варьироваться в зависимости от числа циклов PCR и суммы первоначального шаблона. Мы рекомендуем что пользователь исправить количество циклов PCR и изменять первоначальное количество шаблонов, как мы обнаружили, это будет более удобно стратегию для оптимизации. Мы отмечаем, что техника ошибкам PCR был широко доступны на протяжении десятилетий. Если пользователь выбирает, они могут искать метод для выполнение ошибкам ПЦР27 вручную без использования коммерчески доступных мутагенеза kit.
Как предостережение уровень ложных положительных настоящего Протокола является довольно высоким. Таким образом мутант кандидаты должны пройти серию фильмов, предназначенных чтобы отсеять ложных срабатываний. Мы обнаружили, что молчание включение сайта ограничение в целевой ген может помочь избежать необходимости предметом ложных срабатываний на относительно трудоемкий этап последовательности. Это экономически эффективным, как мутант кандидатов может состоять в сотни или даже за его пределы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Финансовую поддержку для этого проекта была представлена базовая программа исследований науки через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки и ИКТ (2016R1A2B2006354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J.
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S.
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D.
