Summary
Bu makalede ayrıntılı bir metodoloji fisyon mayası bir hedef gen rasgele mutagenesis için. Örnek olarak, biz bir alt birim 19S proteasome ve ekran heterochromatin istikrarsızlaştırmak mutasyonlar için kodlar rpt4 +, hedef.
Abstract
Bir hedef gen rasgele mutagenesis sık istenen fenotip verim mutasyonlar tanımlamak için kullanılır. Rastgele mutagenesis elde etmek için kullanılabilecek yöntemleri, hataya PCR mutantların farklı bir havuz oluşturmak için uygun ve verimli bir strateji olduğunu (i.e., mutasyona uğramış bir kütüphane). Hataya PCR yönteminin seçimi olduğunda bir araştırmacı genomik diğer bölgeler etkilenmemiş bırakarak bir genin kodlama bölge gibi önceden tanımlanmış bir bölge mutasyona istiyor. Mutant kütüphane tarafından hataya PCR güçlendirilmiş sonra uygun bir plazmid klonlanmış gerekir. Hataya PCR tarafından oluşturulan Kütüphane boyutu klonlama adım verimlilik ile sınırlıdır. Ancak, fisyon mayası, Schizosaccharomyces pombe, klonlama adım yüksek verimli tek adımlı füzyon dönüşüm yapıları oluşturmak için PCR kullanımı tarafından değiştirilebilir. İstenen fenotipleri mutantlar sonra uygun gazetecilere kullanarak seçilebilir. Burada, biz bir örnek, centromeric heterochromatin eklenen bir muhabir olarak alınmıştır ayrıntılı olarak, bu strateji tanımlarlar.
Introduction
İleri genetik hangi araştırmacılar belirli bir fenotip görüntülemek doğal olarak meydana gelen mutantlar aramak ve genetik çözümlemesi klasik bir yöntemdir. Ters Genetik mutasyonlar faiz bir gen tanıtıldı ve fenotip inceledi. İkinci durumda, hedef gen rasgele mutagenesis kez daha sonra sıcaklık hassasiyeti gibi istenen fenotipleri için seçilir veya enzimatik aktivite değiştirilen mutant bir havuz oluşturmak için kullanılır. Rastgele mutagenesis, hataya PCR1de dahil olmak üzere elde etmek için çeşitli yöntemler kullanılabilir; UV ışınlama2; kimyasal mutajen, etil methanesulfonate (EMS) veya Nitröz asit3gibi; Bu mutD5 4aşırı ifade gibi geçici mutator suşları kullanımı; ve DNA5karıştırma.
Burada, hangi biz hataya PCR için bir hedef gen mutasyona uğramış havuzları fisyon mayası oluşturmak için kullanmak için bir ters-genetik strateji tanımlarlar. Bir adından tahmin edebileceğiniz gibi bu yöntem kasten PCR sırasında hataları tanıtarak mutasyonlar oluşturur. Diğer mutagenesis yöntemlerinden farklı olarak, hataya PCR mutagenized için bölge tanımlamak kullanıcı sağlar. Bu çabaları ilgi bir protein/etki alanı işlevinin çalışması için özellikle faydalı kılmaktadır.
Bu rasgele mutagenesis yordamı göstermek için biz burada 19S proteasome alt birim kodlar, rpt4 +, örnek olarak kullanın. Rpt4 fisyon mayası6,7,8,9farklı organizmalarda proteolizis bağımsız işlevler için gösterilmiştir ve proteolizis bir üründe proteinler değiştirerek dolaylı etkilere neden düzeyleri. Biz bu nedenle, proteolizis bağımsız değişiklikler, proteasome heterochromatin Tarih işlevi araştırma amacı ile tetiklenen mutantlar tarandı.
Hataya PCR, astar bağlama konumu ayarlama tarafından herhangi bir gen bölgesine uygulanabilir. İstenen fenotipik değişikliği gösteren mutantlar ile uygun gazetecilere tespit edilebilir. Burada, eklenen bir ade6 + muhabir kullanılan Şeması 1 dış tekrar (otr) bölgesi10. Ade6 + muhabir vahşi Türü koşulunu susturdu Yani bünye heterochromatin bu bölge11, oluşturulur; Bu kırmızı kolonileri10tarafından belirtilir. Şeması, bünye heterochromatin oynattığını bir mutasyon hangi beyaz koloniler görüntülenir ade6 + muhabir ifade sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. medya hazırlanması
- Maya Özü Takviyeler ile (Evet), Evet adenin (Evet düşük Ade), Pombe Glutamat orta (PMG12) ve PMG adenin (PMG-Ade) Tablo 1' de açıklandığı gibi bileşenleri karıştırarak hazırlayın. Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade plakaları, aynı bileşenleri hakkına sahiptir, ancak adenin ikinci gelen atlanır.
- Aşağıdaki tuz (50 x) hisse senedi kullanın: 52.5 g/L MgCl2·6H2O, 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 g/L KCl,4 ' te distile su böylece 2 g/L Na2. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- Aşağıdaki vitamini kullanmak (1, 000 x) hisse senedi: 1 g/L pantothenate, 10 g/L nikotinik asit, 10 g/L inositol, 10 mg/L biotin distile su içinde. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
- Aşağıdaki maden kullanın (10, 000 x) hisse senedi: 5 g/L Borik asit, 4 g/L MnSO4, 4 g/L ZnSO4·7H2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, 0.4 g/L MoO3, 1 g/L KI, 0.4 g/M CuSO4·5H2O , 10 g/L sitrik asit distile su içinde. Filtre 0,22-µm gözenek boyutu filtre sterilize ve 4 ° C'de depolayın
Not: Evet sıvı orta agar ihmal olarak yapılabilir.
- Otoklav orta ve 60 ° C 200 rpm hızında bir heyecan çizgiyle karıştırma sırasında aşağıda için serin.
- Evet + G418 (geneticin) plakalar için 1 mL/L G418 hisse senedi çözüm Evet Orta olarak ekleyin.
- Aşağıdaki G418 kullanın (1, 000 x) hisse senedi: 100 mg/mL G418 distile su içinde. Filtre sterilize 0,22-µm gözenek boyutu filtre, 1,5 mL santrifüj tüpleri ve mağaza aliquot-20 ° C'de kullanma
- Başka bir 5-10 dk ve aliquot için medya içine 90 mm Petri yemekler (1 litre kabaca 40 Petri yemekler için orta aliquots. ilave edin Plakayı 4 ° C'de depolayın
2. klonlama rpt4 + ve onun 5' / 3' UTRs
- PCR astar p1 ve p2 ile gerçekleştirmek (şekil 1A) fisyon kullanarak şablonu olarak toplam hacmi 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim reaksiyon arabellek x 1), genomik DNA (gDNA) Maya ve Tablo 2 ' de açıklanan tepki döngüleri uygulama yükseltmek 3,315 Bankası rpt4 + ve onun 5' / 3' UTRs oluşan çift (bp) parçası. Bir arıtma seti13 (şekil 1A) üretici tarafından belirtilen şekilde kullanarak PCR ürünü arındırmak.
- PBlueScript KS(-) vektör14 ve 16-18 için bir su banyosunda 37 ° C'de rpt4 + ile onun 5' / 3' UTRs BamH1 ve Xho1 ile 20 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim, 1 x sindirim arabellek) toplam hacmine içeren güçlendirilmiş DNA parçası sindirmek h (şekil 1B).
- Jel arındırmak sindirilir vektör (% 1.2 özel jel) ve DNA eklemek TAE-esaslı özel Jel Elektroforez (100 V, 1 h) gerçekleştirme, DNA bantları istenilen boyutlarda bilincin ve jel ekstraksiyon kiti15ile DNA izole.
- Vektör ve DNA ekle 50-100 ng vektörünün DNA ' sını içeren 20 µL ligasyonu tepki gerçekleştirerek T4 DNA ligaz kullanarak ligate bir ~ Ekle DNA, 400 U T4 DNA ligaz ve 1 tüp ligasyonu arabellek x 3 kat molar fazlalığı. Bu karışım için 16-18 h 18 ° C'de kuluçkaya.
- Isı şok 70 için uygulayarak ve birleştirilmiş DNA E. coli DH5α 100 µL dönüştürmek 42 ° C'de s 1 mL LB ekleyin ve kurtarma için 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya. Santrifüjü (13,800 x g) gerçekleştirmek, tüm dönüştürülmüş E. coli LB-Ampisilin (LA) Tabaklarda hücreleri ve 16 h için 37 ° C'de kuluçkaya süpernatant, plaka atın.
- 4-8 kolonileri kürdan ile almak ve gece 3 mL LA orta 37 ° C'de büyür.
- Üreticinin protokole göre kullanılan bir plazmid arıtma kiti ile16 plazmid ayırmak ve izole plazmid, 5 U her restriksiyon enzimi (BamH1 ve / 5 µL ile analitik restriksiyon enzimi sindirim gerçekleştirmek Xho1) ve 1 x kısıtlama arabellek. 37 ° C 3 h. aday plazmid sıralama tarafından klonlama Onayla için bir su banyosunda tepki karisimin kuluçkaya.
3. giriş sessiz mutasyon (Xho1 kısıtlama Site)
- Aksi takdirde tamamlayıcı sırayla istenen mutasyon içeren 33-bp astar (p3 ve p4) çifti Tasarla.
- Yüksek sadakat polimeraz17 ile (şekil 1 c) toplam hacmi çok 25 µL PCR gerçekleştirmek (10 ng klonlanmış plazmid, 10 pmol astar mix, 2 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL) Bisiklete binme parametrelerini kullanarak listelenen Tablo 3' te.
- Ben bir su 37 ° C'de 20 µL (20 U enzim, 1 x sindirim arabellek) toplam hacmine 1 s banyo Dpnile şablon plazmid sindirmek.
- Dönüşümü, yaymak, ayırma ve adımları 2.5-2.7 açıklandığı gibi sessiz mutasyon içeren Plazmid dizi.
Not: Sessiz mutasyon aynı zamanda birden fazla DNA parçalarının tek tepki18katılmak için izin veren bir klonlama yöntemi kullanarak tanıttı olabilir.
4. rasgele Mutagenesis rpt4 + hataya PCR tarafından
- Hataya PCR, plazmid sessiz mutasyon (Xho1 sitesi) ile kullanarak gerçekleştirmek şablonu, astar p5 ve p6, toplam hacmi 50 µL (Adım 4.1.1, 10 pmol astar mix, 2.5 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL tanımlanmış şablon miktarı) olarak , ve yüksek bir hata üretmek için tasarlanmış özel bir polimeraz oranı19 (şekil 1 d). PCR Tablo 2' de açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- 4-5 µg şablon plazmid, mutasyon sıklığı 1 bp/KB (kilobaz) kontrol etmek için kullanın.
Not: Bir yüksek konsantrasyon (> 500 ng/µL) bir mini hazırlık seti20kullanarak elde edilebilir, plazmid gereklidir.
- 4-5 µg şablon plazmid, mutasyon sıklığı 1 bp/KB (kilobaz) kontrol etmek için kullanın.
- Jel Elektroforez, PCR ürünü 2670 BP (% 1.2 özel jel) onaylamak için kullanın. Jel 2.5 adımda anlatıldığı gibi bu PCR ürünü arındırmak.
5. füzyon PCR parçaları (KAN, 3' UTR) hazırlanması
- PFA6a-KANMX621 şablonu, astar p7 ve p8 kullanarak PCR gerçekleştirmek ve koşulları işaretleyici (KAN) parçası elde etmek için Tablo 4'te listelenmiş. Jel 2.5 (şekil 1E) adımda anlatıldığı gibi elde edilen 1.480-bp parçası arındırmak.
- Hedef için mutasyon ve kodlayıcı bölge onun bitişik gen gen kodonu fazla 500 tarafından ayrılmış Eğer kontrol kan basıncı. Bu bölgede 500'den az olduğunda endojen Sonlandırıcı kullanılamaz bp; daha doğrusu, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanılmalıdır. ADH Sonlandırıcı kullanmak için gereken protokol değişiklikleri Tablo 5' te sunulmaktadır.
Not: PFA6a-3HA-KANMX6 plazmid mevcuttur, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanıldığında bu değişiklikler yalnızca geçerli.
- Hedef için mutasyon ve kodlayıcı bölge onun bitişik gen gen kodonu fazla 500 tarafından ayrılmış Eğer kontrol kan basıncı. Bu bölgede 500'den az olduğunda endojen Sonlandırıcı kullanılamaz bp; daha doğrusu, ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanılmalıdır. ADH Sonlandırıcı kullanmak için gereken protokol değişiklikleri Tablo 5' te sunulmaktadır.
- PCR klonlanmış rpt4 +ile gerçekleştirmek-vektör olarak şablon ve astar p9 ve toplam hacmi 50 µL p10 içeren (20 ng klonlanmış plazmid, 10 pmol astar mix, 2 U enzim, 1 x reaksiyon arabellek 2 µL), Tablo 6' da sunulan koşul kullanma. Jel (şekil 1E) elde edilen 506-bp 3' UTR parçası arındırmak.
6. nesil Fusion PCR (şekil 1E) dönüşümü yapı
- 3 parçaları (mutagenized rpt4 +, KAN ve 3' UTR) 50 ng/µL, hazır olun.
- PCR üç parçaları astar p11 ve p12, kullanarak tablo 7'de açıklandığı gibi füzyon gerçekleştirin. (Fusion PCR için bir değişiklik orijinal protokolü22protokoldür.) Önemli 4,398-bp PCR ürünü arındırmak.
- Rpt4 +kullanın: KAN:3'UTR parçaları 1 oranında: 3:1 en iyi sonuçlar için.
Not: INSERT DNA'ın toplam tutarı 500 geçmemelidir ng. Önerilen miktarı rpt4 +: KAN:3'UTR 50 ng:150 ng:50 ng olduğunu. Diğer üç mutasyona uğramış her Bankası tüm olası birleşimlerini için hesap olacaktır Maya kolonileri az sayıda 1,600 x 3 = 4800 bu yüzden yaklaşık 1,6 kb, mutagenized bölgesidir koloniler. Bir dönüştürme tepki genellikle 400-500 kolonileri verimleri çünkü değer en az 10 reaksiyonlar füzyon PCR oluşturmak gereklidir. 10 kat yalnızca tepki tutarı (Yani, PCR tüpleri sayısı) artırarak bu ihtiyacı karşılanabilir.
- Rpt4 +kullanın: KAN:3'UTR parçaları 1 oranında: 3:1 en iyi sonuçlar için.
7. fisyon mayası elektroporasyon (şekil 1F) tarafından dönüşümün
- Maya Evet orta doygunluk için 10 ml den fazla 16 h için kuluçka tarafından aşılamak.
- 600 optik bir yoğunluk hücrelere seyreltik nm (OD600) 0,2 200 ml Evet orta ve 30 ° C'de 5-6 h, OD600 için sallayarak ile kuluçkaya = 0,6 - 0,8.
- OD600 hücrelere konsantre = 30, dört 50 mL konik tüpler için dağıtmak ve chill buz 10 dk için.
- 4 ° C'de 3 dk aralıklarla 1.050 x g de gerçekleştirerek hücreleri hasat Tüpler ve 10 electro-cuvettes Buza koyun. 7.3-7,8 adımları buz üzerinde gerçekleştirin.
- Süpernatant atın ve 1, 2 M sorbitol 15 mL ekleyin. Hücreleri resuspend tüplere hafifçe sallayın.
- Hücreleri vasıl 1050 x g 4 ° C'de 3 dk santrifüj kapasitesi
- 7.4 ve 7,5 adımları yineleyin. Süpernatant atmak. 1, 2 M sorbitol 500 µL her tüp eklemek, hücreleri resuspend ve bir 15 ml konik tüp içinde hücrelerin tümünü toplamak.
- 1, 2 M sorbitol eklemek 2.4 mL (OD600 = 0.2 mL başına 10). Tüp buz üzerinde tutun.
- 200 µL (onlar tam olarak askıya emin olun) sorbitol askıya hücre eklemek için füzyon PCR içeren bir EP tüp oluşturun, iyice karıştırın ve örnek bir elektro-küvet için transfer.
- Electroporate aşağıdaki seçenekleri içeren hücreleri: Mantarlar, ShS (2.00kV, 1 darbe).
- Her elektro-küvet için 800 µL toplam hacmi 1.2 M sorbitol 600 µL ekleyin ve sonra hücreleri dört Evet plakaları (200 µL/plaka) yayıldı. On elektro-cuvettes 40'a Evet plakaları dağıtmak olacaktır.
- Plakayı 24 h 30 ° C'de kuluçkaya.
- Evet + G418 için yineleme kaplama gerçekleştirmek ve tabak 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.
8. seçimi, Heterochromatin kararsız hale mutantlar ve yanlış pozitif olarak kontrol
- Her Evet + G418 plaka için yineleme kaplama Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade (Hayır Ade) plakalar için gerçekleştirin. Bazı Evet-Ade plakaları kolonileri kırmızı rengi (şekil 1G) göstermek kadar yineleme tabak 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya.
- Evet-Ade ve PMG-Ade plakaları ve pembe veya beyaz Evet-Ade plaka üzerinde göstermek ve ayrıca PMG-Ade plaka üzerinde büyümeye seçme hücreleri karşılaştırın. Yanlış pozitif (KAN kaset genom başka bir yerindeki bir sigara hedef sitede entegre yansıtanmesela ) oldukları gibi kolonileri PMG-Ade, büyüme olmadan seçin.
- Her koloni yaklaşık 1 x 105 hücreleri seçin ve 2,5 mg/mL zymolyase 100 T en az 30 dk. kullanım 1 µL PCR (şekil 1 H) koloni için başlangıç şablon olarak gerçekleştirmek için bu çözüm için 37 ° C'de içeren SPZ çözüm 10 µL kuluçkaya.
- SPZ (50 mL) 2 M sorbitol 30 mL, 1 M Na2HPO44,05 mL, 0.95 mL NaH2PO4 ve 15 mL distile su (son pH, 7,5) karıştırılarak olun. Örnekleri (5 mL) zymolyase ile desteklenmiş ve 500 µL aliquots-20 ° c kadar kullanmak saklanır.
- Sonuçlarını + koloni PCR görselleştirmek için Jel Elektroforez (% 1.2 özel jel, 180V, 20 dk) gerçekleştirin. Uygun Boyut grupları PCR sergi ve her reaksiyon ürünü Xhoile 5 µL sindirmek reaksiyonlar seçin ben (4 U enzim, 1 x sindirim tampon, 37 ° C su banyosu, 1 h) yanlış pozitif (Resim 1 H) ekran için.
- XhoI özetleri (% 1.2 özel jel, 180 V, 20 dk) görselleştirmek için Jel Elektroforez gerçekleştirin. PCR ürünleri XhoItarafından kesilir ve bunları Evet + G418 tabak (şekil 1I) yama kolonileri işaretleyin.
- GDNA füzyon Maya hücreleri izole ve PCR ürünleri23nın gerçekleştirin. Elde edilen sıra mutasyonlar (şekil 1I) tanımlamak için vahşi-tipi kol ile karşılaştırın.
- Doğrudan mutation(s) vahşi tipi hücrelere mutant hücreleri23PCR tarafından güçlendirilmiş füzyon yapıları ile dönüştürerek yeniden tanıtmak. Lekelenme fenotip yeni yapılan mutant hücrelerdeki (şekil 1J) onaylamak için kullanın.
- Füzyon dönüşümü yapı kolay güçlendirilmiş PCR tarafından astar p1 ve p10 ile genomik DNA mutant toplam hacmi 50 µL (~ 1 µg DNA, 20 U enzim reaksiyon arabellek x 1), şablon olarak kullanarak ve Tablo 2 açıklanan tepki döngüleri uygulama . Yapı dönüşümü 7.1-7,13 adımları izleyerek yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 ' de açıklanan yordamları izleyerek Edinsel Rpt4 mutantlar koloniler renklerinin değerlendirmek tarafından çözümlenebilir. Kolonilerin renkleri şeklinde ilermek cep numarasını Şekil 2' deki ilgili plakalar üzerine lekeli. Heterochromatin bölge eklenen ade6 + muhabir vahşi türü susturdu ve kırmızı kolonileri Evet-Ade tabak içinde gösterir. Bir kez heterochromatin dengeleri bozdu ve ade6 + muhabir ifade edilir, beyaz kolonileri Evet-Ade plaka clr4Δ mutant gibi görülebilir. Filtrelenmiş Rpt4 gösterildiği gibi mutantız. rpt4-1 mutant en ağır heterochromatin istikrarsızlık gösterir.
Resim 1 : Protokol şematik gösterimi. (A) PCR ürününün şematik gösterim elde edilen PCR, 1 ve 2 astar ile gerçekleştirilen ilk turunda tarafından. (B) kısıtlama tabanlı rpt4 + parçası klonlama. (C) Site yönettiği mutagenesis klonlanmış Yöneyin bir XhoI kısıtlama sitesine ekler sessiz bir mutasyon tanıtmak için kullanılır. (D) rastgele mutagenesis bölge desteği rpt4 + hataya PCR kullanılarak gerçekleştirilir. (E) mutasyona uğramış rpt4 + parça, KAN parçası ve 3' UTR parçası bir dönüştürme hazır kaset oluşturmak için PCR füzyon tarafından birleştirilir. (F) fisyon mayası hücre füzyon tarafından homolog rekombinasyon endojen rpt4 + sırasını değiştirir PCR yapı ile dönüştürülür. (G) koloniler kaplan tarafından seçilen yineleme Evet-Ade (Ade düşük) ve PMG-Ade (Hayır Ade) levha kaplama olumlu koloniler seçilir var... (H) PCR ve PCR ürününün sonraki XhoI kısıtlama yanlış pozitif önlemek için kullanılır. (I) fenotip neden olur mutasyon yama seçili koloniler, hücrelerinin yayılma, genomik DNA (gDNA) çıkarımı ve sıralamanın ilgili bölümü rpt4 +tarafından tanımlanır. (J) etken mutasyonlar onaylanır (ve yanlış pozitif ekarte) mutasyon yaban tipi hücrelere doğrudan tanıtımı tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Heterochromatin de-baskı mutantlar, Rpt4. Otr1::ade6 + muhabir (üst) şematik diyagramı. Seçme filtrelenmiş Rpt4 mutant 5-Fold seri halinde dilutions heterochromatin istikrarsızlık (alt) düzeyi artan sırayla belirtilen plakalar üzerine tespit edildi. Bu rakam makale '19S proteasome doğrudan tür ile fisyon mayası yayılma heterochromatin Seo vd., 201724ile ilgilenmektedir' değişiklik yapıldı. Sigara kırpılmış resim orijinal makalede bulunabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşen | Plaka türü | |
| EVET | PMG | |
| Maya ekstresi | 5 g/L | |
| Glikoz | 30 g/L | 20 g/L |
| Adenin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Histidin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Lösin | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Urasil | 0,15 g/L | 0,1 g/L |
| Potasyum hidrojen pthalate | 3 g/L | |
| Na2HPO4 | 2,2 g/L | |
| L-glutamik asit | 3.75 g/L | |
| Tuzları | 20 ml/L | |
| Vitaminler | 1 ml/L | |
| Mineraller | 0.1 ml/L | |
| Agar | 16 g/L | 16 g/L |
Tablo 1. Evet bileşenleri ve PMG plakaları
| Sıcaklık | Zaman | Cycle(s) |
| 95oC | 2 dk | 1 döngüsü |
| 95oC | 20 s | 30 döngüleri |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 dk | |
| 72oC | 8 dk. | 1 döngüsü |
| 8oC | Basılı tutun |
Tablo 2. Önerilen PCR program sitesi Yönetmen: mutagenesis için
| Sıcaklık | Zaman | Cycle(s) |
| 95oC | 2 dk | 1 döngüsü |
| 95oC | 30 s | 19 döngüleri |
| 55oC | 1 dk. | |
| 72oC | 7 dk. | |
| 72oC | 10 dk | 1 döngüsü |
| 8oC | Basılı tutun |
Tablo 3. Önerilen PCR program hataya PCR
| Sıcaklık | Zaman | Cycle(s) |
| 95oC | 2 dk | 1 döngüsü |
| 95oC | 20 s | 30 döngüleri |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 2 dk | |
| 72oC | 8 dk. | 1 döngüsü |
| 8oC | Basılı tutun |
Tablo 4. PCR program KAN parçası elde etmek için önerilen
| Değiştir | Hedef | Örnek olgusu rpt4 + | |
| Şablon vektör | pFA6a-3HA-KANMX6 | ||
| P7 dizisi vektör-bağlama | ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | ttgctgacctgaagaaacttgaaggtacaattgattaccaaaagctttag ATTACGCTGCTCAGTGCTGA | |
| P7 dizi asılı | Kodonu dahil olmak üzere son 50bp dizisini | ||
| P8 dizi asılı | İlk 50bp sırası değil kodonu (tamamlayıcı sıra) sonra | AATCTTCATCGGTAAACTTATCATTTCATGGCTTTTTGGATATATGTGCA GAATTCGAGCTCGTTTAAAC | |
| P9 dizisi | Kodonu sonra doğru başlamak | tgcacatatatccaaaaagccatgaa | |
| P10 dizisi | Üretmek ~ 500bp parçası p9 ile (tamamlayıcı seqeucne) | TAGACGTTTTTCCTCGTTTCTTTGTC | |
Tablo 5. ADH Sonlandırıcı endojen Sonlandırıcı yerine kullanıldığında gereken değişiklikler
| Sıcaklık | Zaman | Cycle(s) |
| 95oC | 2 dk | 1 döngüsü |
| 95oC | 20 s | 30 döngüleri |
| 55oC | 30 s | |
| 72oC | 1 dk. | |
| 72oC | 8 dk. | 1 döngüsü |
| 8oC | Basılı tutun |
Tablo 6. PCR program 3' UTR parçası elde etmek için önerilen
| Sıcaklık | Zaman | Rampa | Cycle(s) |
| 94oC | 2 dk | 1 döngüsü | |
| 94oC | 20 s | 10 döngüleri | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 dk | 0.2 oC/s | |
| 94oC | 20 s | 5 döngüleri | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 dk | 0.2 oC/s + 5 s/dönüşümü | |
| 94oC | 20 s | 10 döngüleri | |
| 70oC | 1 s | ||
| 55oC | 30 s | 0.1 oC/s | |
| 68oC | 2:30 dk | 0.2 oC/s + 20 s/döngüsü | |
| 72oC | 10 dk | 1 döngüsü | |
| 8oC | Basılı tutun |
Tablo 7. Fusion PCR için önerilen PCR program
| CBL1877 | h + | ade6-210 leu1-32 ura4-D18 otr1R (dg-glu) Sph1:ade6 |
Tablo S1: Bu çalışmada kullanılan zorlanma
Tablo S2: Bu çalışmada kullanılan astar listesi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rastgele mutagenesis hataya PCR ile belirli bir bölgede mutantların farklı bir havuz oluşturmak için güçlü bir araçtır. Bu teknik özellikle belirli bir koşulda bir proteinin işlevini değerlendirmek için arama çalışmaları için yararlıdır. Örneğin, biz burada kullanılan hataya PCR 19S proteasome alt birimi, Rpt4, heterochromatin bakım işlevini değerlendirmek için. Değişen tarafından bölge tarafından hataya PCR hedef ve tarama Koşulları ayarlama, faiz ve ekran için istenen fenotip genomik bölgesi hücreleri mutasyona başardık. Son zamanlarda, benzer bir yöntem Milli direk vücut bileşen25mutasyonların yataklık füzyon Maya hücreleri izole etmek için kullanılmıştır.
Rastgele mutagenesis önemli avantajı hem non-gerekli ve temel genler için uygulanabilir olduğunu. Rastgele mutagenesis temel genlerin hücre canlılığı sürekli olabilir izin ince ve/veya kısmi fonksiyonel kusurları olanlar gibi çeşitli mutantlar veya yalnızca belirli bir koşul altında olan işlevleri etkilenen mutantlar verim. Bir sıcaklığa duyarlı mutant ikinci bir örnektir. Bu tür mutantlar 5 mg/L phloxine B, ölen hücreleri kırmızı lekeleri ve yavaş büyüyen hücreler hücreleri26ölümden ayırt edici olmasını sağlar kullanarak izole olabilir.
Bu iletişim kuralı kritik adım hataya PCR adımdır. Bu adımda, çok PCR döngü sayısı ve şablon ilk miktarına bağlı olarak değişebilir mutasyon sıklığı denetlemek önemlidir. Biz en iyi duruma getirme için daha uygun bir strateji olarak buldum olarak kullanıcı PCR devir sayısını saptamak ve şablon, başlangıç düzeyinde değişiklik öneririz. Biz hataya PCR tekniği yıllardır yaygın olarak mevcut olmuştur unutmayın. Kullanıcı seçerse, el ile bir piyasada bulunan mutagenesis kit kullanmadan hataya PCR27 yerine getirmek için kullanılan bir yöntem isteyebiliriz.
Uyarı, bu iletişim kuralının yanlış pozitif oranı oldukça yüksektir. Böylece, mutant adaylar gösterimleri belgili tanımlık yanlış mutlak ot için amaçlanan bir dizi tabi. Bulduğumuz bir kısıtlama sitedeki hedef gene sessiz birleşme konu yanlış pozitif sıralama oldukça zahmetli adıma gerek önlemenize yardımcı olur. Mutant adaylar yüz ya da düz ötesinde numara gibi düşük maliyetli, bu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje için destek finansman temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Bilim Bakanlığı ve ICT (2016R1A2B2006354) tarafından desteklenen NMK) tarafından sağlandı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J.
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S.
- Forsburg, S. L. Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html (2011).
- QIAquick PCR Purification Kit. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation (2013).
- pBlueScript II Vector. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115& (2005).
- QIAquick Gel Extraction Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation (2013).
- QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2 (2016).
- PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136 (2004).
- Gibson Assembly Master Mix. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information (2017).
- GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057 (2012).
- Plasmid Plus Midi Kit. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/ (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. Fission Yeast Handbook. , https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D.
