Se presenta un método que puede proporcionar más información sobre los eventos principios subyacentes a la neurodegeneración y basado en la técnica de cerebro establecido ex vivo , combinando las ventajas de los experimentos en vivo y en vitro . Además, representa una oportunidad única para comparación directa del grupo tratado y no tratado en el mismo plano anatómico.
A pesar de numerosos estudios que intentan desarrollar modelos animales confiables que refleja la primaria procesos de neurodegeneración subyacente, muy pocos han sido ampliamente aceptados. Aquí, proponemos un nuevo procedimiento de adaptación de la conocida ex vivo cerebro rebanada técnica, que ofrece un más de cerca en vivo-como escenario de preparativos en vitro , para investigar los acontecimientos tempranos provocando degeneración de célula, como observado en la enfermedad de Alzheimer (AD). Esta variación consiste en pasos simples y fácilmente reproducibles, que permiten la preservación de la Citoarquitectura anatómico de la región seleccionada del cerebro y su funcionalidad local en un medio fisiológico. Pueden obtenerse diferentes áreas anatómicas del cerebro mismo, brindando la oportunidad de realizar múltiples experimentos con los tratamientos en cuestión en un sitio, dosis y forma dependiente del tiempo. Limitaciones potenciales que puedan afectar a los resultados relacionados con esta metodología se relacionan con la conservación del tejido, es decir, el mantenimiento de su integridad anatómica durante los pasos de incubación y corte y el espesor de la sección, que puede influir en el bioquímico y el análisis immunohistochemical. Este enfoque puede ser empleado para diferentes fines, como explorar mecanismos moleculares implicados en condiciones fisiológicas o patológicas, detección de drogas o ensayos dosis-respuesta. Por último, este protocolo también podría reducir el número de animales empleados en estudios de comportamiento. La aplicación aquí ha sido recientemente descrita y probado por primera vez en vivo ex rebanadas de cerebro rata, que contiene el prosencéfalo basal (BF), que es una de las regiones cerebrales afectadas principalmente en AD. En concreto, se ha demostrado que la administración de un péptido tóxico derivado de la c-terminal de la acetilcolinesterasa (AChE) podría sugerirán el un anuncio como perfil, disparo, a lo largo del eje antero-posterior del BF, una expresión diferencial de las proteínas alteradas en DC, como el receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada (P-tau) del Tau y amiloide beta (Aβ).
AD es que una patología crónica caracterizada por deterioro neurodegenerativo progresivo que afecta a diversas áreas del cerebro, tales como la corteza entorrinal (CE), BF, hipocampo (HC) y el bulbo olfatorio (OB)1,2,3, 4,5. Las etapas finales de desarrollo AD conducen a un deterioro cognitivo progresivo, que esta enfermedad la forma más común de demencia, representando aproximadamente el 70% de los casos6. A pesar de intentos amplia para entender las etapas iniciales que causan AD, no hay actualmente una indicación experimental definida elucidarlos. Además, la teoría más popular – la “hipótesis del amiloide” – es cada vez más puesta en duda ya que no provee un perfil completo en la explicación de la Patobiología de la AD, ni un objetivo farmacéutico que ha demostrado ser eficaz7,8 ,9.
Una teoría alternativa que está recibiendo atención cada vez mayor sugiere que los mecanismos iniciales que ocurren durante la neurodegeneración están relacionados con un grupo neuronal principalmente susceptible en AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. el rodete celular heterogéneo englobado dentro de los proyectos BF, mesencéfalo y médula oblonga, para varias regiones, tales como la CE, HC y OB15,16. A pesar de su diversidad en la morfología neuronal y la síntesis del neurotransmisor, este núcleo de células comparte una característica común en la expresión de dolor, que puede tener también una función no-enzimática17,18. Este papel no clásico como una novela de señalización molécula media flujo de calcio (Ca2 +) en las neuronas que puede someterse a eventos tóxicos o tróficos en relación con la dosis de Ca2 + y la disponibilidad neuronal edad17,18 , 19.
Durante la neurodegeneración, la pérdida celular observada podría ser, por tanto, asociada a esta función no enzimática17,18,20, que es atribuible a un péptido 30mer (T30) troceado de la C-terminal de dolor 20. en consonancia con los resultados anteriores, en cultivo celular y óptica de18,21 preparados, hemos demostrado, a través de un novedoso enfoque basado en ex vivo las rebanadas de cerebro de rata en que contienen estructuras BF, que T30 un perfil de AD-como22. En concreto, esta nueva metodología ofrece un escenario más fisiológico que la cultura de célula ya que mantiene muchas de las características de un tejido intacto, desde anatómicos a la preservación de los circuitos, aunque para una ventana de tiempo de horas. Hemos aplicado este protocolo para explorar los eventos que tienen lugar durante las primeras fases de la neurodegeneración, monitoreo de la respuesta aguda al T30 aplicación.
A pesar del gran cuerpo de literatura sobre el uso de cerebro rebanadas para investigar vías moleculares implicadas en el daño neuronal o neurogénesis23,24, este protocolo proporciona por primera vez una más inmediata y sensible a la lectura en comparación con para el uso común de organotypic rebanadas. Sin embargo, como es el caso de organotypic secciones del cerebro, este procedimiento de rebanada aguda puede también adoptar para varios propósitos, tales como la evaluación de neuroprotectores o moléculas neurotóxicas, descubrimiento de primarios cambios moleculares que ocurren en un proceso específico, el análisis de immunohistochemical y ensayos farmacológicos para el sistema nervioso central relacionados con patologías.
El aspecto principal de este protocolo, basado en la técnica de cerebro bien establecida ex vivo , permite probar sincrónicamente dos hemislices especulares, obtenidos en el mismo plano anatómico, monitoreo de la respuesta después de la aplicación de un específico condición de control o tratamiento; por lo tanto ofrece un paradigma experimental controlado tan ajustadamente como sea posible. La posibilidad de evaluar en un tiempo, dosis y forma específica diferentes neuroquímicos relacionados con el dete…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por Neuro-Bio Ltd. Nos gustaría agradecer al Dr. Giovanni Ferrati y Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) por sus comentarios y consejos sobre el manuscrito.
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
Glue | Brain preparation for slicing | ||
Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
Brushes | Tissue handling | ||
Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
Microcentrifuge | |||
Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |