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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
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Immunology and Infection

선택 하는 람다 cII 돌연변이 탐지 시스템

Published: April 26, 2018
doi:
10.3791/57510
,
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine,University of Southern California

Summary

우리는 유전자 변형 쥐의 배양된 세포에 람다 선택 cII 돌연변이 분석 결과 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트 처리에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 이 접근은 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위한 널리 사용 되었습니다.

Abstract

유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템의 수 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 생쥐와 돌연변이 탐지 시스템 람다 (λ) 선택 cII 되었습니다 고용 했다 변이 실험에 대 한 전 세계 많은 연구 그룹에 의해. 여기, 우리가 선택 하는 람다 cII 돌연변이 분석 결과, 유전자 변형 쥐/쥐의 배양된 세포에 적용 될 수 있는 대 한 자세한 프로토콜 설명 또는 해당 동물의 화학/물리적 에이전트와 치료. 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 세포에서 게놈 DNA의 (1) 절연 또는 유전자 변형 동물의 기관/조직 치료 생체 외에서 또는 vivo에서각각, 시험 화합물; (2) 게놈 DNA;에서 mutational 리포터 유전자 (즉, cII transgene) 들고 람다 셔틀 벡터의 복구 (3) 포장 구조 벡터의 전염 성 살 균 소;에 (4) 호스트 박테리아를 감염 하 고 유도 cII 돌연변이;의 전파 수 있도록 선택적 조건 하에서 배양 그리고 (5) 득점 cII-돌연변이 DNA 순서 분석을 cII 돌연변이 주파수 및 돌연변이 스펙트럼, 각각.

Introduction

다양 한 유전자 변형 동물 모델 및 돌연변이 탐지 시스템 변이 포유류 세포에서 발암 물질의 테스트를 위해 개발 되었습니다. 이들의 유전자 변형 (라고도 BB) 빅 블루 마우스 및 돌연변이 탐지 시스템 λ 선택 cII 있다 변이 실험에 의해 고용 되었다이 그룹 및 많은 다른 연구 그룹 전세계1,2, 3,,45,6,7,,89. 지난 16 년 동안, 우리가이 유전자 변형 동물을 사용 하 여 다양 한 화학 및 물리적 에이전트의 변이 원 성 영향 조사 또는 자신의 해당 미 발달 섬유 아 세포 세포 배양 시험 화합물으로 치료 하 고 이후에 분석은 표현 형 및 λ 선택 cII 분석 결과와 DNA 시퀀싱, 각각10,,1112,,1314 cII transgene의 유전자 형 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 유전자 변형 동물의 게놈 다중 복사 머리-투-꼬리 concatemer1,,2254 염색체에 통합 된 살 균 소 λ 셔틀 벡터 (λLIZ) 포함 되어 있습니다. ΛLIZ 셔틀 벡터 운반 두 mutational 리포터 유전자, 즉 lacI 및 cII transgenes1,2,25,,2627, 28,29,30,31,32,33,,3435,36, 37,38,39,40,41,42,43,,4445 , 46 , 47. λ 선택 cII 분석 결과 유전자 변형 동물1,2,25의 기관/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 λLIZ 셔틀 벡터의 회복에 따라 . 복구 된 λLIZ 셔틀 벡터 다음 λ 살 균 소 머리 표시기 호스트 대장균감염의 수에 포장 됩니다. 그 후, 감염 된 박테리아는 점수 및 cII transgene1,3에 있는 돌연변이의 분석에 대 한 수 있도록 선택적 조건 하에서 성장 된다.

여기, 우리가 치료 하는 유전자 변형 동물에 체 외에서의 셀/기관에서 게놈 DNA의 분리를 이루어져 있는 λ 선택 cII 분석 결과 대 한 자세한 프로토콜 설명 /vivo에 는 λLIZ의 시험 화합물, 검색으로 셔틀 벡터 genomic DNA에서 전염 성 λ 페이지, 살 균 소, cII의 id와 호스트 대장균 의 감염에는 벡터의 포장- cII 돌연변이 주파수를 결정 하는 선택적 조건 돌연변이 및 CII 돌연변이 스펙트럼을 설정할 DNA 순서 분석. 프로토콜 유전자 변형 마우스/쥐 셀 문화 치료 체 외에 관심, 화학/물리 에이전트에 적용할 수 또는 해당 동물의 조직/장기에서 치료 vivo에서 테스트 화학/에이전트1, 2,4,48,49,50,,5152. Λ 선택 cII 분석 결과의 프레 젠 테이 션이 회로도 그림 1에 표시 됩니다.

Protocol

1. 게놈 DNA 절연 마우스 미 발달 섬유 아 세포에서 참고: 기본 마우스 미 발달 섬유 아 세포는53게시 된 프로토콜 따라 BB 유전자 변형 마우스 C57BL/6 유전 배경에서 파생 된 배아에서 격리 됩니다. 1 x 107 배아 섬유 아 세포 세포 제어 복합 대 테스트와 치료 1 x 106 이 프로토콜에 대 한 시작 물자에 의하여 이루어져 있다. 참조10</…

Representative Results

데이터 배포에 따라 패라메트릭 또는 비-파라 메 트릭 테스트 치료 및 제어 그룹 (즉, 자연 스러운 돌연변이 주파수 대 유도) cII 돌연변이 주파수 차이의 중요성을 결정 하기 위해 사용 됩니다. . 다른 치료 그룹 유도 cII 돌연변이 주파수의 비교에 의해 이루어집니다 다양 한 (인덱스도) 적용으로 통계적 테스트. 주파수를 비교 하는 χ2 테스트 또?…

Discussion

Λ 선택 cII 분석 결과 BB 설치류3의 장기/조직에서 파생 된 세포의 게놈 DNA에서 복구 cII transgene에 변이의 탐지를 위해 사용 됩니다. 이러한 유전자 변형 동물의 게놈 cII 운반 하는 chromosomally 통합된 λLIZ 셔틀 벡터의 여러 탠덤 복사본이 포함 (294 bp)와 lacI (1080 bp) transgenes mutational 리포터 유전자1, 2 , <sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 모든 동료의 기여 금 및 그 결과에 추천 된이 원고 (예시)에 대 한 우리의 원래 연구에 공동 작업자를 인정 하 고 싶습니다. 작가 작품은 AB (California Tobacco-Related 질병 연구 프로그램의 대학 및 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구는 건강의 국가 학회 (1R01DE026043) ab의 교부 금에 의해 지원 TRDRP-26IR-0015)와 세인트 (TRDRP-25IP-0001). 연구의 스폰서 연구 설계, 데이터 수집, 데이터 분석, 데이터 해석, 보고서의 작성 또는 게시를 위해 제출 하는 결정에 있는 역할을 했다.

Materials

Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None
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