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Immunology and Infection

La Lambda selezionare cII , sistema di rilevazione di mutazione

doi: 10.3791/57510 Published: April 26, 2018

Summary

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'analisi di mutazione di Lambda selezionare cII in cellule coltivate di roditori transgenici o corrispondenti animali trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Questo approccio è stato ampiamente utilizzato per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero.

Abstract

Una serie di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione è stata sviluppata per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici e la Lambda (λ) Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per il Lambda selezionare cII test di mutazione, che può essere applicato alle cellule coltivate di topi/ratti transgenici o gli animali corrispondenti trattati con un agente chimico/fisiche di interesse. Il protocollo prevede i passaggi seguenti: (1) isolamento di DNA genomic dalle cellule o tessuti o organi di animali transgenici trattati in vitro o in vivo, rispettivamente, con un composto in esame; (2) il recupero del vettore navetta lambda portatrice di un gene reporter mutazionale (cioè, cII transgene) dal DNA genomico; (3) imballaggio dei vettori hanno salvati in infettivi batteriofagi; (4) che infetta un batterio ospite e coltura in condizioni selettive per consentire la propagazione delle mutazioni indotte cII ; e (5) segnando il cII-analisi per determinare la frequenza dei mutanti cII e spettro di mutazione, rispettivamente di sequenza del DNA e mutanti.

Introduction

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Una vasta gamma di modelli animali transgenici e sistemi di rilevazione di mutazione sono stati sviluppati per il test di mutagenicità degli agenti cancerogeni in cellule di mammifero. Di questi, topi transgenici Big Blue (di seguito chiamato BB) e λ Select cII sistema di rilevazione di mutazione sono stati impiegati per esperimenti di mutagenesi da questo gruppo e molti altri ricerca gruppi in tutto il mondo1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Per i 16 anni, abbiamo studiato gli effetti mutageni di vari agenti chimici e/o fisici, utilizzando questi animali transgenici o loro colture di cellule embrionali del fibroblasto corrispondente trattato con un composto in esame e successivamente analizzato il fenotipo e genotipo del transgene cII dal saggio Select cII λ e sequenziamento del DNA, rispettivamente10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. il genoma di questi animali transgenici contiene un vettore navetta λ di batteriofago (λLIZ) integrato sul cromosoma 4 come multi-copia testa-coda concatemer1,2,25. Il vettore λLIZ navetta trasporta due geni reporter mutazionale, vale a dire i lacI e cII transgeni1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. il saggio di Select cII λ si basa sul recupero dei vettori navetta λLIZ dal DNA genomico delle cellule derivate da tessuti o organi di animali transgenici1,2,25 . I vettori di navetta λLIZ recuperati vengono quindi assemblati in teste di fago λ in grado di infettare un ospite indicatore Escherichia coli. Successivamente, i batteri infetti sono coltivati in condizioni selettive per consentire per il punteggio e l'analisi delle mutazioni in cII transgene1,3.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per il dosaggio di Select cII λ, che consiste di isolamento del DNA genomico da cellule/organi di animali transgenici trattati in vitro/in vivo con un test composto, recupero della λLIZ navetta vettori da DNA genomic, imballaggio dei vettori in fagi λ infettiva, infezione dell'ospite e. coli con batteriofagi, identificazione di cII-mutanti sotto condizioni selettive per determinare la frequenza mutante cII , e Analisi di sequenza del DNA per stabilire lo spettro di mutazione di cII . Il protocollo può essere applicato a transgenici topo/ratto cell culture trattate in vitro con un agente chimico/fisiche di interesse, o tessuti/organi degli animali corrispondenti trattati in vivo con il test chimico/agente1, 2,4,48,49,50,51,52. Una presentazione schematica del dosaggio Select cII λ è illustrata nella Figura 1.

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Protocol

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1. isolamento genomic del DNA da fibroblasti embrionali del Mouse

Nota: Fibroblasti embrionali del mouse primario sono isolate da embrioni ottenuti da topi transgenici BB con background genetico C57BL/6, secondo il protocollo pubblicato53. Il materiale di partenza per questo protocollo è costituito da 1 x 106 a 1 x 107 embrionali del fibroblasto cellule trattate con un test composto rispetto al controllo. La raccolta e il conteggio di queste cellule, utilizzando metodi standard sono descritti in riferimenti10,54,55.

  1. Preparare buffer un (0,3 M saccarosio 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, spermidina 0,5 mM, spermina 0,15 mM e 2 mM EDTA), B (150 mM NaCl e 5 mM EDTA, pH 7,8) del buffer e buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 20 mM NaCl, 20 mM EDTA e 1% SDS) in anticipo e conservare a temperatura ambiente (TA) per fino a un anno54,55.
  2. Risospendere le cellule in 2 – 4 mL in una provetta conica per centrifuga 15 mL pipettando ripetutamente su e giù utilizzando un ampio foro punta della pipetta 1.000 µ l di tampone.
  3. Aggiungere un volume (2 – 4 mL) tampone A contenente 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (ad es., Nonidet P40) usando una pipetta sierologica di vetro.
  4. Incubare la provetta in ghiaccio per 5 min.
  5. Centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 minuti a TA.
  6. Scartare il surnatante e lavare la pallina con 10 – 15 mL di tampone per un utilizzo di una pipetta sierologica di vetro.
  7. Risospendere il pellet in 2 – 4 mL di tampone B.
  8. Aggiungere un volume (2 – 4 mL) tampone C contenente 600 µ g/mL proteinasi K.
  9. Incubare la provetta per 3 h a 37 ° C.
  10. Aggiungere la RNasi A una concentrazione finale di 100 µ g/mL.
  11. Incubare la provetta per un ulteriore 1 h a 37 ° C.
  12. Aggiungere un fenolo di volume (2 – 4 mL) (saturi in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alcol (25:24:1 vol/vol).
    Nota: Fenolo può rappresentare un pericolo per la salute gravi e dovrà essere maneggiato con estrema cautela. Fenolo è altamente corrosivo per la pelle e facilmente assorbito attraverso di essa e presenta altri effetti. Quando Gestione fenolo, utilizzare sempre doppia calzata, indossare occhiali protettivi e lavorare in una cappa chimica.
  13. Mescolare bene capovolgendo la provetta per 5 minuti sull'agitatore tubo a 4 ° C.
  14. Centrifugare la provetta a 1.000 x g per 5 min a 4 ° C.
  15. Rimuovere la fase acquosa (strato superiore) ad un nuovo tubo usando una pipetta sierologica di vetro.
  16. Ripetere fenolo: cloroformio: isoamil alcool estrazione da 1 a 3 volte fino a quando la fase acquosa è chiara e l'interfaccia non è più torbida.
  17. Aggiungere 1/10 di volume (200 – 400 µ l) 3M sodio acetato, pH 5.2.
  18. Aggiungere 2,5 volume (5 – 10 mL) di 100% di etanolo (refrigerato) e capovolgere la provetta delicatamente a mano per 2 – 3 min.
  19. Lo spooling il DNA con un gancio di vetro e trasferirlo in una nuova provetta contenente 1 – 5 mL 70% etanolo e lavarlo con cura. In alternativa, centrifugare la provetta a velocità elevata (3.500 x g) a 4 ° C per il DNA di pellet e lavarlo accuratamente con 1 – 5 mL 70% etanolo.
  20. Centrifugare la provetta a velocità elevata (3.500 x g) a RT, rimuovere il supernatante e asciugare all'aria il DNA per 10-15 min.
  21. Sciogliere il DNA in 10 – 100 µ l di tampone di TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) e conservare a 4 ° C (per breve deposito fino ad un mese) o a-20 ° C (per il periodo di conservazione più lungo). La concentrazione ottimale per il DNA per il dosaggio di Select cII λ è 0,5 – 1,0 µ g / µ l (nel buffer di TE)56.

2. in Vitro Packaging reazione

  1. Per una reazione di imballaggio, aggiungere ~ 5 µ g di DNA genomico (volume finale: 8 – 12 µ l, il DNA di genomic è stato isolato nella sezione 1 del mouse fibroblasti embrionali trattate in vitro con una sostanza in esame o controllo) ad un tubo del microcentrifuge contenente il primo miscela di reazione (~ 10 µ l).
    Nota: In-House preparati o λ commercialmente disponibili imballaggio estratti sono utilizzati in laboratori diversi. Nella confezione commerciale Estratto kit utilizzato qui56 (Vedi la Tabella materiali), tubi rossi conteneva la prima miscela di reazione (~ 10 µ l) e tubi blu conteneva il mix di reazione secondo (~ 70 µ l per almeno 5 reazioni).
  2. Incubare la provetta per 90 min a 30 ° C.
  3. Aggiungere il volume richiesto (~ 12 µ l) del secondo mix di reazione per il tubo.
  4. Incubare la provetta per altri 90 minuti a 30 ° C.
  5. Aggiungere 1,1 mL di tampone di SM al tubo.
    Nota: 1 mL di questa soluzione (cioè, miscela di reazione di imballaggio) verrà utilizzato per lo screening di λ cII-mutanti. Il resto servirà per titolazione.
    1. Preparare il tampone di SM mescolando 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7h2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5) e 5 mL 2% (p/v) gelatina. Aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 litro, autoclave per 30 min. Store a temperatura ambiente per fino a 1 anno.
  6. Vortice nella provetta contenente il campione di DNA confezionato per 10 s a RT (vigoroso Vortex).
  7. Impulso girare il tubo in un microcentrifuge e conservare il ghiaccio fino all'uso. Se il campione non sta per essere utilizzato entro il giorno stesso del packaging, aggiungere 50 µ l di cloroformio di DNA confezionato per mL del campione, vortice delicatamente e conservare a 4 ° C fino a 2 settimane.

3. preparare la coltura batterica di e. coli G1250

  1. Almeno due giorni prima della placcatura, fare qualche striatura batterica tavole da Escherichia coli (Escherichia coli) G1250 su piastre di agar TB1-kanamicina.
    1. Preparare piatti di agar TB1-kanamicina come segue. Mescolare 5,0 g di NaCl, 10,0 g peptone di caseina e 12,0 g di agar. Aggiungere il cloridrato della tiamina di 800ml dH2O. aggiungere 1 mL 0,1%. Regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl. Aggiungi dH2O ad un volume finale di 1 litro.
    2. Mescolare bene e autoclave per 30 min. Consenti raffreddare a 55 ° C. Aggiungere 50,0 mg kanamicina e mescolare. Versare in capsule di Petri sterili 100 mm (20 – 25 mL per ogni piatto). Conservare le piastre a 4 ° C fino a due settimane.
  2. Incubare le piastre di striatura batterica in un incubatore stazionario 30 ° C per almeno 24 h.
  3. Un giorno prima della placcatura, combinare 10 mL di terreno liquido TB1 con 100 µ l di soluzione di 20% (p/v) maltosio-1 M MgSO4 in un tubo conico di sterile 50 mL con tappo a vite.
    1. Preparare il mezzo liquido TB1 come segue. Mix 5.0 g NaCl e peptone di caseina 10,0 g, aggiungere mL 800 dH2O, cloridrato di tiamina 0,1% 1 mL, quindi regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl. Quindi aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 litro, mescolare bene e autoclave per 30 min. memorizzare il mezzo al RT fino a tre mesi.
    2. Preparare il 20% (p/v) di maltosio-1 M MgSO4 come segue. Mescolare 20,0 g maltosio e 24,6 g MgSO4. 7H2O, quindi aggiungere dH2O ad un volume finale di 100 mL. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C fino a 6 mesi.
  4. Inoculare il mezzo liquido con diverse colonie dalla piastra batterica striatura utilizzando una sterile inoculando ciclo56.
  5. Incubare la coltura liquida pernottamento in a 30 ° C in agitazione incubatrice con agitazione vigorosa (250 – 300 giri/min).
  6. Il giorno di placcatura, centrifugare la provetta conica contenente la coltura liquida di G1250 a 1.500 x g per 10 min a RT per agglomerare le cellule batteriche.
  7. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di 10 mM MgSO4.
  8. Misurare l'assorbanza di una 01:10 diluizione della sospensione delle cellule a lunghezza d'onda 600 nm utilizzando un UV-Vis spettrofotometro (ad es., 100 µ l cella sospensione + 900 µ l 10 mM MgSO4)56.
  9. Diluire la sospensione cellulare a un finale OD600 di 0,5 con 10mm MgSO4. La soluzione ricostituita di G1250 e. coli con OD600 = 0,5 è indicato come 'la cultura di placcatura di G1250'.
  10. Conservare la cultura di placcatura di G1250 sul ghiaccio e usare entro 1-2 h.

4. i campioni di DNA confezionati di placcatura

  1. Per un pacchetto campione di DNA, preparare sedici sterile 14 x 100 mm2 turno-fondo tubi e piastre di agar sedici TB1. Dieci da ogni set servirà per lo screening e sei per titolazione (tre per titolo 20) e tre per titolo 100.
    1. Preparare piatti di agar TB1 come segue. Mix 5.0 g NaCl, peptone di caseina g 10,0 e 12,0 g Agar, quindi aggiungere 800 mL dH2O e 1 mL 0,1% Tiamina cloridrato. Regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl e aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 L.
    2. Mescolare bene e autoclave per 30 min. lasciar raffreddare a 55 ° C, poi versarlo in capsule di Petri sterili 100 mm (20 – 25 mL per ogni piatto). Conservare le piastre a 4 ° C fino a due settimane.
      Nota: Piastre di agar TB1 dovrebbero essere preparate almeno 24 ore prima dell'uso.
  2. Aliquotare e 200 µ l della cultura di placcatura di G1250 in ogni provetta di turno-fondo.
  3. Per titolazione, fare una diluizione 1: 100 del campione del DNA confezionato e mescolare bene nel Vortex (vale a dire, 10 µ l confezionato DNA campione + 990 µ l di tampone di SM).
  4. Aggiungere 20 µ l della diluizione 1: 100 per ciascuna delle tre titolo 20 provette.
  5. Aggiungere 100 µ l della diluizione 1: 100 per ciascuna delle tre titolo 100 provette.
  6. Per lo screening, aggiungere 100 µ l dei 'non diluito ' confezionati campione di DNA per ciascuna delle dieci screening provette.
  7. Elaborare tutte le titolazione e screening tubi (tubi di 2 x 3 + 10 = 16), come segue: mescolare bene su vortex per circa 10 s e poi incubare a temperatura ambiente per 30 min consentire all'host di e. coli di adsorbire i fagi.
  8. Aggiungere 2,5 mL scaldati TB1 fuso top agar (raffreddato a 55 ° C) ad ogni titolo o tubo, schermante mescolare immediatamente nel Vortex (delicatamente), e riversando il titolo appropriato o piastre di agar TB1 di screening.
    1. Preparare TB1 top agar come segue. Mix 5.0 g NaCl, peptone di caseina 10,0 g e 7,0 g Agar, quindi aggiungere il cloridrato della tiamina di 800ml dH2O. aggiungere 1 mL 0,1%, quindi regolare il pH a 7.0 con NaOH o HCl. Infine, aggiungere dH2O ad un volume finale di 1 litro.
    2. Mescolare bene e autoclave per 20 – 25 min. Store a temperatura ambiente fino a tre mesi.
    3. Prima dell'uso, sciogliere l'agar di top TB1 preparato in un forno a microonde, mescolare bene e lasciare per raffreddare a 55 ° C in un bagno d'acqua.
      Nota: Parte superiore di TB1 fuso e raffreddato viene aggiunto al contenuto di ogni titolo o tubo schermante e dopo la miscelazione, viene versato nel titolo appropriato o piastre di agar di screening TB1.
  9. Lasciate le piastre a riposare per 15-30 min a temperatura ambiente, con il coperchio socchiuso per evitare la condensazione.
  10. Invertire le piastre e posizionare le piastre di dieci schermatura in un incubatore stazionario 24 ° C e incubare per 46 – 48 h (cioè, condizioni selettive) e le sei piastre di titolo in un incubatore stazionario 37 ° C ed incubare per 24 h/pernottamento (vale a dire, condizioni di non-selettivi).
    Nota: Per garanzia della qualità e la standardizzazione dei risultati, controllo disponibile sul mercato dei fagi soluzioni contenenti una miscela di wildtype e mutante cII con frequenza mutante nota sono placcate al fianco di campioni del DNA confezionati e incluso in tutti i l'analisi viene eseguito56.

5. esaminare il titolo e piastre di Screening per determinare la cII frequenza mutante

  1. Dopo l'incubazione 24 h/notte a 37 ° C, il numero delle placche formate in ciascuna delle tre titolo 20 piastre e titolo 100 piastre. Per identificare più facilmente le placche, tenere la piastra accanto a una finestra di luce bianca e su uno sfondo scuro con il coperchio rimosso (Vedi Figura 2).
  2. Fare una media (media) del numero delle placche conteggiata in ogni set di piastre 20 titolo e titolo 100 (in triplice copia, ciascuno).
  3. Scegliere il numero medio dal set di piastre di titolo che cade più vicino alla gamma di placche di 50 – 200 per piastra insieme.
  4. Calcolare il numero totale delle placche proiettato nelle piastre di dieci screening come segue:
    Totale targhe proiettati = (numero medio di placche nel set selezionato di titolo piastre ÷ numero di µ l della diluizione utilizzato per ogni piastra selezionate) x fattore di diluizione x numero di µ l di campione di DNA confezionato per lo screening di piastra [100 µ l/piastra] x numero di piastre [10] di screening.
    Nota: ad esempio, se il numero medio delle placche per piastra nel set di titolo 20 piastre è 128 e il numero corrispondente nel set di titolo 100 piastre è 478, numero 128 verrà essere utilizzato per il calcolo del numero totale delle placche proiettato , come segue:
    (128 ÷ 20) x 100 [fattore di diluizione] x 100 [µ l/piastra] x 10 [piastre] = 640.000
    Questa operazione equivale a moltiplicare il numero medio delle placche di 5.000 o 1.000, se il numero medio è basato su conti dal titolo 20 piastre o titolo 100 piastre, rispettivamente.
  5. 46 – 48 ore di incubazione a 24 ° C, a seguito di contare il numero totale delle placche formate nelle piastre di dieci screening (seguire le istruzioni fornite nel paragrafo 5.1).
    Nota: La frequenza mutante cII è calcolata dividendo il numero totale delle placche formate nelle piastre di screening per il numero totale delle placche proiettato. Utilizzando l'esempio precedente, se il numero totale delle placche contato nelle piastre di dieci screening è 112, la frequenza dei mutanti cII per questo campione di DNA sarebbe 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5.

6. Verifica dei putativi λ cII mutanti, l'amplificazione di PCR e sequenziamento del DNA

  1. La placca in questione con una punta di pipetta sterile, wide-bore di base ed espellerla (pipettando su e giù) in una provetta da microcentrifuga sterile contenente 500 µ l di tampone sterile SM.
  2. Incubare per almeno 2 ore a temperatura ambiente o a 4 ° C durante la notte, per consentire le particelle dei fagi eluire da agar spina.
  3. In un tubo di turno-fondo sterile 14 x 100 mm2 , mescolare 200 µ l della cultura di placcatura di G1250 con 1 µ l della soluzione dei fagi animato e incubare per 30 minuti a TA.
  4. Piastra campione con 2,5 mL di 55 ° C fuso TB1 top agar e incubare la piastra a 24 ° C per 46 – 48 h (condizioni selettive), come descritto nelle sezioni 4.8 – 4,10.
  5. Una volta che hanno formato le placche secondarie, è possibile utilizzare un puntale per scegliere attentamente un singolo ben isolato verificato λ cII-placca mutante (evitare di toccare l'agar inferiore).
    Nota: Ricromatura le placche mutante presunto cII serve a due scopi: (i) placcatura manufatti può a volte sbagliarsi le placche di piccole dimensioni; e (ii) un nucleo di agarosio prelevato da una piastra di screening può contenere non mutante phage(s) insieme a un mutante dei fagi. Le piastre secondarie da una bassa densità ricromatura fornirà un modello mutante incontaminato per successiva analisi di sequenza del DNA e di PCR.
  6. Trasferire la placca a un tubo del microcentrifuge contenente acqua bidistillata di 25 µ l pipettando su e giù.
  7. Posizionare il tubo in acqua bollente per 5 min.
  8. Centrifugare a massima velocità (18.000 x g) per 3 minuti a TA.
  9. Trasferire 10 µ l del surnatante immediatamente ad un nuovo tubo del microcentrifuge contenente 40 µ l di una PCR mastermix in cui le concentrazioni finali dei reagenti sono tampone PCR Taq 1x, 10 pmol ogni dei primer forward e reverse, 12,5 nmol di ogni dNTP e 2,5 U di Taq DNA polimerasi.
    Nota: Il primer forward e reverse sono come segue: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posizioni -68 a -50 rispetto al cII avviare codone) e 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (posizioni + 345 a 365 rispetto il codone di inizio cII ), rispettivamente.
  10. Amplificare il modello utilizzando i seguenti parametri in bicicletta: una denaturazione di 3 min a 95 ° C, seguita da 30 cicli di 30 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C e 1 min a 72 ° C, con un'estensione finale di 10 min a 72 ° C.
  11. Purificare il prodotto di PCR di bp 432 contenente il gene cII e fiancheggianti regioni utilizzando kit di purificazione di PCR commercialmente disponibili, secondo le istruzioni del produttore.
  12. Eseguire il sequenziamento del DNA utilizzando una piattaforma di sequenziamento appropriato e analizzare le sequenze di DNA risultanti per rilevare le mutazioni nel transgene cII (vedere la nota qui sotto).
    Nota: Ciò si ottiene tramite l'allineamento con la sequenza di cII di riferimento utilizzando il software, ad esempio il basati su web server allineamento di sequenza T-caffè. Per istruzioni su come utilizzare il programma, visitare: http://tcoffee.crg.cat/

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Representative Results

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A seconda della distribuzione dei dati, parametrici o non parametrici test vengono utilizzati per determinare il significato di differenza nella frequenza mutante cII tra gruppi di controllo e trattamento (cioè, indotta contro frequenze mutante spontanee) . Confronto delle frequenze mutante indotto cII attraverso diversi gruppi di trattamento è fatto da varie (pairwise) test statistici, come applicabile. La prova di ipergeometrica di Adams e Skopek comunemente viene utilizzata per confrontare il complessivo indotto - e spontanea mutazione spettri57, sebbene altri test, come il χ2 test o analisi della varianza (ANOVA), può essere utilizzato anche per confrontare la frequenza di ogni specifico tipo di mutazione (ad es., transizione, transversione, inserimento o eliminazione) tra gli spettri di mutazione indotta - e controllo, o tra i vari spettri di mutazione indotti da agenti chimici o dosi varianti dello stesso chimico/agente.

Nella figura 3 è una raccolta di dati di frequenza mutante dagli studi pubblicati in cui abbiamo dimostrato che la misura dell'aumento relativo cII frequenza mutante in fibroblasti embrionali del mouse trattati con vari agenti chimici e/o physicalagents può variare da pochi-a parecchi centuplica, secondo il mutagene 'potenza' del composto in esame. Piega-aumenti statisticamente significativi della frequenza mutante cII sono indicati per i fibroblasti embrionali del mouse trattati con acrilammide12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, Acido δ-aminolevulinico (δ-ALA) più ultravioletto dose bassa luce A (UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo (a) pirene diolo epoxide(B(a)PDE)19ed equilethal dosi di raggi UVA, UVB (λ = 2 80−320 nm) e simulato luce solare UV (SSL) 21 (Vedi Figura 3).

Nella figura 4 è una dimostrazione della 'specificità di sequenza' di mutazioni in cui abbiamo mostrato l'induzione di specifici tipi di mutazione nel transgene cII in mouseembryonicfibroblasts irradiati con UVBrelativetocontrol23. Lo spettro di mutazione indotta UVB è caratterizzato da un aumento significativo nella frequenza relativa delle transizioni di C→T singola o tandem ai dinucleotidi di pirimidina.

Figure 1
Figura 1: Presentazione schematica del dosaggio Select cII λ. Il saggio si basa sul recupero dei vettori navetta λLIZ, che contengono il transgene cII come un gene reporter mutazionale, dal DNA genomico delle cellule coltivate derivate da roditori transgenici trattati in vitro con un composto di prova o tessuti/organi degli animali corrispondenti trattati in vivo con la testata chimica/agente (A e B). I vettori hanno salvati vengono assemblati in teste di fago λ che possono infettare un host appropriato e. coli (C e D). I batteri infetti sono poi coltivati in condizioni selettive per consentire per il punteggio e l'analisi delle mutazioni nel cII transgene1,2,3,25, 52 (E). Determinazione della frequenza mutante indotta cII e istituzione dello spettro di mutazione di sequenziamento del DNA sono delineati in F e G. Gli spettri di mutazione indotta - e spontanea sono visualizzati in diversi formati. Per gli scopi dell'illustrazione, abbiamo evidenziato un formato in cui le mutazioni indotte cII sono digitate sopra la sequenza di riferimento, mentre le mutazioni spontanee (controllo) sono tipizzate sotto la sequenza di riferimento (H). L'altezza di una mutata base rappresenta la frequenza delle mutazioni (cioè, maggiore la base, il più frequentemente mutate). I numeri sopra una base mutato indicano la frequenza percentuale di mutazioni in quella base. Basi eliminati vengono sottolineati. Inserito basi sono indicati con una freccia. Le basi sono numeri fanno riferimento a posizioni del nucleotide. I dati vengono da uno studio pubblicato23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Conteggio placche in piastre titolo. Per identificare più facilmente le placche, piastre si svolgono accanto a una finestra di luce bianca e su uno sfondo scuro con coperchi rimossi. 20 piastra (A) e titolo 100 piastra (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Frequenze mutante del transgene cII in fibroblasti embrionali del mouse trattati con vari prodotti chimici e/o agenti fisici rispetto ai comandi. Sono dati dagli studi pubblicati su acrilamide12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, tamoxifen18, acido δ-aminolevulinico (δ-ALA) più bassa dose di raggi ultravioletti A luce (raggi UVA: λ > 320−400 nm)15, benzo(a) pyrenediol epossido (B(a)PDE)19ed equilethal dosi di raggi UVA, UVB (λ = 280−320 nm) e simulato luce solare UV (SSL)21. Per metabolizzare efficientemente tamoxifen in cellule di fibroblasti embrionali di topo, abbiamo usato il sistema di attivazione S9 (S9 mix) composta da preparazioni del fegato del ratto indotta da Aroclor 1.254 e cofattore reagenti22. Tutte le differenze tra trattati- e campioni di controllo sono statisticamente significativi al p < 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Spettri di mutazione del transgene in fibroblasti embrionali di topo irradiati con UVB relativo controllo cII . I dati vengono da uno studio pubblicato23. Le controparti di specchio filo di tutte le transizioni (ad es., G→A e C→T) e trasversioni (ad es., G→T e C→A o G→C e C→G) sono combinate. Ins: inserimento; Del: cancellazione. Lo spettro di mutazione indotta UVB è caratterizzato da un aumento significativo nella frequenza relativa delle transizioni di C→T singola o tandem ai dinucleotidi di pirimidina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Il dosaggio di Select cII λ viene utilizzato per il rilevamento delle mutazioni nel transgene cII recuperato dal DNA genomico delle cellule derivate da organi/tessuti di BB roditori3. Il genoma di questi animali transgenici contiene più tandem copie del vettore navetta cromosomicamente integrato λLIZ, che trasporta il cII (294 bp) e lacI (1.080 bp) transgeni, come il reporter mutazionale di geni1, 2 , 25. il saggio di Select cII λ si basa sul recupero dei vettori λLIZ navetta dal DNA genomico delle cellule/tessuti degli animali transgenici, seguiti da un confezionamento dei vettori hanno salvati nelle teste di fago λ che possono infettare un host appropriato E. coli. Successivamente, i batteri infetti sono coltivati in condizioni selettive per consentire per il punteggio e l'analisi delle mutazioni nel transgene cII (Vedi Figura 1)1,3. Il dosaggio di Select cII λ è stato usato estesamente per test di mutagenicità di una vasta gamma di prodotti chimici e/o agenti fisici (rivisto in riferimenti2,49). Il dosaggio è stato applicato con successo a transgenici topo/ratto cell culture trattate in vitro con diverse sostanze chimiche e/o agenti fisici, e i tessuti/organi degli animali corrispondenti trattati in vivo con diversi test gli agenti4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Il dosaggio di Select cII λ in cellule coltivate di roditori transgenici trattati con un test composto rappresenta, in molti modi, una valida alternativa per esperimenti di mutagenicità in vivo negli animali corrispondenti trattati con la testata chimica/agente 3. come regola generale, i modelli in vitro offrono vantaggi significativi rispetto alle loro controparti in vivo modelli animali, così come sono molto meno lavoro intensivo e costosa, richiede molto meno tempo per essere completata e la cosa più importante, non prevedono l'utilizzo diretto del animali2,50,52. Allo stesso tempo, i modelli in vitro non possono ricapitolare completamente tutti gli aspetti di mutagenesi a causa di differenze nelle proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche di sostanze chimiche tra le cellule coltivate in vitro e animali da esperimento in vivo 2 , 3. ad esempio, sostanze chimiche cui via di esposizione è inalazione (ad es., vapor sigaretta elettronica o fumo di sigaretta) possono avvenire solo suscettibili di in vitro test nelle colture delle cellule dopo che essi vengono convertiti da gas o vapori forme a liquidi o la condensa, che complica la loro farmacocinetica. Inoltre, un'incompleta o assente capacità metabolica delle cellule coltivate in vitro per convertire alcune sostanze chimiche in DNA-reattivi specie potrebbe non rappresentare il danno del DNA guidato mutagenicità in animali esposti in vivo per prodotti chimici genotossici2 ,3. Anche se, questo inconveniente può essere compensato, in diversa misura, con l'aggiunta di un'attivazione metabolica esterna sistema (cioè, S9 mix) in vitro delle cellule cultura modelli22.

Inoltre, la replica dell'esposizione umana di vita reale per prodotti chimici/agenti genotossici è più limitata con in vitro modelli della coltura cellulare che con animali da esperimento in vivo3. Generalmente, gli esseri umani sono esposti a dosi croniche di agenti genotossici nell'arco di diversi anni per alcuni decenni76,77,78. La durata limitata delle cellule in coltura, rispetto la vita relativamente più lunga dei roditori (cioè, giorni/settimane contro pochi anni) rende la modellazione dell'esposizione umana a genotoxins più impegnativo in modelli ex2, 3. Ciò nonostante, mutagenicità analisi con modelli di coltura in vitro delle cellule può fornire una prima indicazione di potenziale genotossico di un dato prodotto chimico / agenti e i risultati possono essere utilizzati come guida per progettare esperimenti 'raffinato' in vivo che dispongono di un numero di animali2,3'ridotto'.

In conclusione, il dosaggio di Select cII λ in cellule coltivate di roditori transgenici trattati con un composto in esame, o i corrispondenti animali trattati con testata chimiche/agente, è un valido approccio per il test di mutagenicità. Abbiamo utilizzato con successo l'approccio, come hanno altri gruppi di ricerca in tutto il mondo4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,73,74,75. Più recentemente, abbiamo ampliato le applicazioni di questo approccio attraverso lo sviluppo di una nuova tecnica in cui una modifica del dosaggio Select cII λ insieme al sequenziamento di nuova generazione consente analisi di rendimento elevato di mutazioni in un tempo-, costo-, e lavoro-efficace modo23.

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Disclosures

Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Vorremmo riconoscere i contributi di tutti i colleghi e collaboratori per i nostri studi originali, i cui risultati sono stati denominati in questo manoscritto (a scopo esemplificativo). Lavoro degli autori è sostenuto da borse di studio dal National Institute of Dental e Craniofacial Research del National Institutes of Health (1R01DE026043) di AB e dall'Università di programma di ricerca di malattia di California Tobacco-Related a (AB TRDRP-26IR-0015) e ST (TRDRP-25IP-0001). Gli sponsor dello studio non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati, analisi dei dati, interpretazione dei dati, scrittura della relazione, o nella decisione di presentare per la pubblicazione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

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La Lambda selezionare <em>cII</em> , sistema di rilevazione di mutazione
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Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).More

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