אנו מתארים פרוטוקול מפורט את assay מוטציה cII למדא בחר בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. גישה זו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים.
מספר מודלים בבעלי חיים מהונדס, מערכות זיהוי המוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים, בחר למבדה (λ) cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור למדא בחר cII מוטציה וזמינותו, אשר ניתן להחיל על תאים בתרבית של העכברים הטרנסגניים/חולדות או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: (1) בידוד של דנ א גנומי מתאי או איברים/רקמות חיות הטרנסגניים שטופלו חוץ גופית או ויוו, בהתאמה, תרכובת מבחן; (2) שחזור של וקטור הסעות למדא נושא גן כתב mutational (כלומר, cII transgene) של ה-DNA גנומי; (3) אריזה של הווקטורים שניצלו לתוך bacteriophages זיהומיות; (4) להדביק חיידקים המארח ו culturing בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר הפצת מוטציות המושרה cII ; (5) הקלפים של cII-מוטציות ו- DNA רצף ניתוח כדי לקבוע את תדירות מוטציה cII ואת הספקטרום מוטציה, בהתאמה.
מגוון רחב של מודלים בבעלי חיים מהונדס ומערכות איתור מוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים Big Blue (המכונים להלן BB), בחר λ cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצה זו רבים אחרים מחקר קבוצות ברחבי העולם1,2, 3,4,5,6,7,8,9. במשך 16 השנים האחרונות, חקרנו את ההשפעות המוטגניות של סוכנים כימי ו/או גופניים שונים באמצעות בעלי חיים אלה הטרנסגניים או שלהם תרביות תאים עובריים פיברובלסט המקביל שטופלו תרכובת המבחן ולאחר לאחר מכן ניתח גן # מושגים בסיסיים, גנוטיפ של transgene cII מאת λ cII בחירה וזמינותו של רצפי DNA, בהתאמה10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכיל bacteriophage λ הסעות וקטור (λLIZ) משולב על כרומוזום 4 כמו2,1,concatemer ראש זנב מרובת עותקים25. הווקטור הסעות λLIZ נושאת שני גנים כתב mutational, כלומר לצי של cII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ cII בחירה וזמינותו מבוססת על החזרתה של הווקטורים הסעות λLIZ של ה-DNA גנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות חיות הטרנסגניים1,2,25 . הווקטורים הסעות λLIZ התאושש ארוזים ואז לתוך ראשי phage λ מסוגל להדביק מארח מחוון Escherichia coli. לאחר מכן, נגוע החיידקים גדלים בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר את הניקוד וניתוח של מוטציות של cII transgene1,3.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור וזמינותו בחר cII λ, אשר מורכב של בידוד של דנ א גנומי של תאים/איברים של חיות הטרנסגניים מטופלים במבחנה/ויוו עם החזרה במתחם, בדיקה של λLIZ מעבורת וקטורים מן ה-DNA גנומי, אריזה של הווקטורים לתוך phages λ זיהומיות, זיהום של החיידק המארח עם bacteriophages, זיהוי cII-המוטציות בתנאים סלקטיבית כדי לקבוע את תדירות מוטציה של cII , ו ניתוח רצף הדנ א להקים cII מוטציה הספקטרום. הפרוטוקול ניתן להחיל על העכבר הטרנסגניים/חולדה תא תרבויות מטופלים במבחנה עם סוכן כימי/פיזי של עניין, או רקמות/איברים מבעלי החיים המתאים שטופל ויוו עם בדיקה כימית/סוכן1, 2,4,48,49,50,51,52. מצגת סכמטי של λ cII בחירה וזמינותו מוצג באיור1.
Λ cII בחירה וזמינותו משמש לצורך זיהוי של מוטציות transgene cII התאוששה הדנ א הגנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות של BB מכרסמים3. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכילה עותקים של וקטור הסעות λLIZ chromosomally משולב, אשר נושאת את cII טנדם (294 bp) ו לצי (1,080 bp) transgenes, כמו גנים כתב mutati…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות התרומות של כל עמיתיו ושותפיו ללימודים המקורי שלנו, אשר התוצאות כבר התייחסו בכתב היד (להמחשה). העבודה של המחברים נתמך על ידי מענקים הלאומית המכון של שיניים, מחקר ואסטתיים של מכוני הבריאות הלאומיים (1R01DE026043) ל AB ו מן האוניברסיטה של מחלת California Tobacco-Related מחקר לתוכנית AB ( TRDRP-26IR-0015) סטריט (TRDRP-25IP-0001). נותני החסות של המחקר שהיה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, נתונים לפרשנות, כתיבת הדו ח, או ההחלטה להגיש לפרסום.
Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | Bacteriological grade |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | None |
Casein Peptone | Alfa Aesar | H26557 | None |
Gelatine | J. T. Baker | 2124-01 | Powder |
Glycerol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | None |
LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | None |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 8104 | 50 PCR purification reactions |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | M-15756 | None |
Taq5000 DNA Polymerase | Qiagen | 201207 | None |
Thiamine Hydrochloride | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | None |
Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 packaging reactions |
Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | None |
Trypton | Biosciences | RC-110 | None |