हम लैंब्डा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन का चयन करें ट्रांसजेनिक कुतर या इसी जानवरों के साथ इलाज किया और ब्याज की एक रासायनिक/शारीरिक एजेंट के प्रसंस्कृत कोशिकाओं में सीआईआई उत्परिवर्तन परख । यह दृष्टिकोण स्तनधारी कोशिकाओं में यलो के mutagenicity परीक्षण के लिए व्यापक रूप से प्रयोग किया गया है.
स्तनधारी कोशिकाओं में यलो के mutagenicity टेस्टिंग के लिए कई ट्रांसजेनिक एनिमल मॉडल्स और उत्परिवर्तन डिटेक्शन सिस्टम विकसित किए गए हैं । इनमें से, ट्रांसजेनिक चूहों और लैंब्डा (λ) का चयन करें सीआईआई उत्परिवर्तन जांच प्रणाली दुनिया भर में कई अनुसंधान समूहों द्वारा mutagenicity प्रयोगों के लिए नियोजित किया गया है । यहां, हम लैंब्डा चुनें सीआईआई उत्परिवर्तन परख, जो ट्रांसजेनिक चूहों की प्रसंस्कृत कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन/चूहों या इसी जानवरों के साथ इलाज एक रासायनिक/ प्रोटोकॉल निंनलिखित चरणों के होते हैं: (1) जीनोमिक डीएनए के कोशिकाओं या अंगों से ट्रांसजेनिक पशुओं के ऊतकों/ इन विट्रो में या vivo में, क्रमशः, एक परीक्षण परिसर के साथ अलगाव; (2) जीनोमिक डीएनए से लैंब्डा शटल वेक्टर के एक उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन (यानी, सीआईआई transgene) ले जाने की वसूली; (3) संक्रामक bacteriophages में बचाया वैक्टर की पैकेजिंग; (4) एक मेजबान बैक्टीरिया और चयनात्मक शर्तों के तहत संवर्धन प्रेरित सीआईआई उत्परिवर्तनों के प्रसार की अनुमति के लिए संक्रमण; और (5) सीआईआई-म्यूटेंट और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण स्कोरिंग क्रमशः सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति और उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम का निर्धारण करने के लिए ।
ट्रांसजेनिक पशु मॉडल और उत्परिवर्तन का पता लगाने प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला स्तनधारी कोशिकाओं में कैंसर के mutagenicity परीक्षण के लिए विकसित किया गया है । इनमें से, ट्रांसजेनिक बड़े नीले (इसके बाद बी के रूप में संदर्भित) चूहों और λ चुनें सीआईआई उत्परिवर्तन जांच प्रणाली इस समूह द्वारा mutagenicity प्रयोगों के लिए नियोजित किया गया है और कई अंय अनुसंधान समूहों दुनिया भर में1,2, 3,4,5,6,7,8,9. पिछले 16 वर्षों के लिए, हम विभिंन रासायनिक और/या शारीरिक इन ट्रांसजेनिक पशुओं या उनके इसी भ्रूण fibroblast कोशिका एक परीक्षण परिसर के साथ इलाज संस्कृतियों का उपयोग कर एजेंटों के mutagenic प्रभाव की जांच की है, और बाद में विश्लेषण phenotype और जीनोटाइप द्वारा सीआईआई transgene के λ चयन सीआईआई परख और डीएनए अनुक्रमण, क्रमशः10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. इन ट्रांसजेनिक जानवरों के जीनोम में एक भोजी λ शटल वेक्टर (λLIZ) 4 गुणसूत्र पर एक बहु के रूप में एकीकृत-प्रति सिर से पूंछ concatemer1,2,25शामिल हैं । λLIZ शटल वेक्टर दो उत्परिवर्तन रिपोर्टर जीन किया जाता है, अर्थात् lacI और सीआईआई transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,३२,३३,३४,३५,३६, ३७,३८,३९,४०,४१,४२,४३,४४,४५ , ४६ , ४७. λ का चयन सीआईआई परख λLIZ शटल वैक्टर के अंगों से व्युत्पंन कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए की वसूली पर आधारित है/1,2,25 . बरामद λLIZ शटल वैक्टर तो λ फेज एक संकेतक मेजबान ई कोलाईसंक्रमण में सक्षम सिर में पैक कर रहे हैं । इसके बाद, संक्रमित बैक्टीरिया चुनिंदा शर्तों के तहत हो रहे हैं, जो सीआईआई transgene1,3में उत्परिवर्तनों के स्कोरिंग और विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ।
यहां, हम λ का चयन करें सीआईआई परख, जो कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए के अलगाव के होते है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन/ इन विट्रोमें इलाज ट्रांसजेनिक पशु के अंगों/vivo में एक परीक्षण परिसर के साथ, λLIZ शटल वैक्टर की पुनः प्राप्ति जीनोमिक डीएनए से, संक्रामक λ phages में वैक्टर की पैकेजिंग, bacteriophages के साथ मेजबान ई. कोलाई के संक्रमण, सीआईआई उत्परिवर्ती आवृत्ति का निर्धारण करने के लिए चुनिंदा शर्तों के तहत सीआईआई-म्यूटेंट की पहचान, और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण के लिए सीआईआई उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम की स्थापना । प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक माउस के लिए लागू किया जा सकता है/चूहा सेल संस्कृतियों में इलाज के साथ इन विट्रो एक रासायनिक/ब्याज की शारीरिक एजेंट, या इसी जानवरों के ऊतकों/परीक्षण रसायन के साथ vivo में इलाज/ 2,4,४८,४९,५०,५१,५२. λ चयन सीआईआई की परख की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति चित्रा 1में दिखाया गया है ।
λ का चयन सीआईआई की परख सीआईआई transgene में उत्परिवर्तनों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है जीनोमिक के अंगों से व्युत्पंन कोशिकाओं के डीएनए से बरामद3। इन ट्रांसजेनिक पशुओं के जीनोम chromosomall…
The authors have nothing to disclose.
हम अपने मूल अध्ययन, जिसका परिणाम इस पांडुलिपि में संदर्भित किया गया है (उदाहरण के प्रयोजनों के लिए) के लिए सभी साथियों और सहयोगियों के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं । ‘ लेखकों का काम राष्ट्रीय दंत चिकित्सा और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (1R01DE026043) के Craniofacial अनुसंधान संस्थान से अटल बिहारी और कैलिफोर्निया तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम के लिए अटल बिहारी विश्वविद्यालय से अनुदान द्वारा समर्थित है ( TRDRP-26IR-0015) और ST (TRDRP-25IP-0001) । अध्ययन के प्रायोजक अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह, डेटा विश्लेषण, डेटा व्याख्या, रिपोर्ट के लेखन, या प्रकाशन के लिए प्रस्तुत करने के निर्णय में कोई भूमिका नहीं थी ।
Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | Bacteriological grade |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | None |
Casein Peptone | Alfa Aesar | H26557 | None |
Gelatine | J. T. Baker | 2124-01 | Powder |
Glycerol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | None |
LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | None |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 8104 | 50 PCR purification reactions |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | M-15756 | None |
Taq5000 DNA Polymerase | Qiagen | 201207 | None |
Thiamine Hydrochloride | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | None |
Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 packaging reactions |
Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | None |
Trypton | Biosciences | RC-110 | None |