Vi beskriver ett detaljerat protokoll för den Lambda Välj cII -mutationsanalys i odlade celler av transgena gnagare eller de motsvarande djur som behandlats med en kemisk/fysikaliska agent av intresse. Detta tillvägagångssätt har använts för mutagenicitet testning av cancerframkallande ämnen i däggdjursceller.
Ett antal transgena djurmodeller och mutation detekteringssystem har utvecklats för mutagenicitet testning av cancerframkallande ämnen i däggdjursceller. Av dessa har transgena möss och Lambda (λ) Välj cII Mutation Detection System använts för mutagenicitet experiment av många forskargrupper världen över. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för den Lambda Välj cII mutationsanalys, som kan tillämpas på odlade celler från transgena möss/råttor eller motsvarande djur behandlats med en kemisk/fysikaliska agent av intresse. Protokollet består av följande steg: (1) isolering av genomisk DNA från celler eller organ/vävnader av transgena djur behandlas in vitro- eller in-vivo, respektive med en test förening; (2) återvinning vektorns lambda pendelbuss transporterar en mutationsanalys reporter gen (dvs, cII transgenens) genomisk DNA; (3) förpackningar räddade vektorer i smittsamma bakteriofager; (4) infekterar en värd bakterier och odlingsskålar selektiv villkor att tillåta spridning av de inducerade cII mutationerna; och (5) poängsättning av cII-mutanter och DNA sekvens analys för att fastställa cII Mutantfrekvensen och mutation spektrum, respektive.
Ett brett utbud av transgena djurmodeller och mutation detekteringssystem har utvecklats för mutagenicitet testning av cancerframkallande ämnen i däggdjursceller. Av dessa har transgena Big Blue (kallas härefter BB) möss och λ väljer cII Mutation Detection System använts för mutagenicitet experiment av denna grupp och många andra forskning grupper över hela världen1,2, 3,4,5,6,7,8,9. För de senaste 16 åren, vi har undersökt de mutagena effekterna av olika kemiska eller fysikaliska agenser som använder dessa transgena djur eller deras motsvarande embryonala fibroblast cellkulturer behandlas med en test-förening, och därefter analyseras den fenotyp och genotyp av den cII transgenens av λ väljer cII assay och DNA-sekvensering, respektive10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. genomet hos dessa transgena djur innehåller en bacteriophage λ transfer vektor (λLIZ) integrerade på kromosom 4 som flera exemplar head-to-tail concatemer1,2,25. ΛLIZ transfer vektorn bär två mutationsanalys reporter gener, nämligen lacI och cII transgener1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ väljer cII analysen bygger på återvinning av λLIZ transfer vektorer från genomisk DNA celler som härrör från organ/vävnader av transgena djur1,2,25 . Återvunna λLIZ transfer vektorerna är sedan förpackade i λ phage huvuden kan infektera en indikator värd Escherichia coli. Därefter odlas de infekterade bakterierna selektiv villkor för att scoring och analys av mutationer i cII transgenens1,3.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för λ väljer cII analysen, som består av isolering av genomisk DNA från celler/organ av transgena djur behandlas i vitro/i vivo med en test förening, hämtning av λLIZ shuttle vektorer genomiskt DNA, förpackningar av vektorer i smittsamma λ fagocyt, infektion i mottagande E. coli med bakteriofager, identifiering av den cII-mutanter selektiv villkor att fastställa cII mutant frekvens, och DNA sekvens-analys att upprätta cII mutation spektrumet. Protokollet kan tillämpas på transgena mus/råtta cell kulturer behandlas i vitro med en kemisk/fysikaliska agent av intresse, eller vävnader/organ motsvarande djur behandlas i vivo med test kemiska/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. En schematisk presentation av λ väljer cII analysen visas i figur 1.
Λ väljer cII analysen används för detektion av mutationer i den cII transgenens återhämtat sig från genomisk DNA celler som härrör från organ/vävnader av BB gnagare3. Genomet hos dessa transgena djur innehåller tandem kopior av kromosomalt integrerade λLIZ transfer vektor, som bär den cII (294 bp) och Lindberg (1.080 bp) transgener, som mutationsanalys reporter gener1, 2 , <sup c…
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja erkänna bidrag från alla kollegor och medarbetare till vår ursprungliga studierna, vars resultat har nämnts i detta manuskript (för illustrativa syften). Författarnas arbete stöds av bidrag från det nationella institutet för Dental- och kraniofaciala forskning av National Institutes of Health (1R01DE026043) till AB och från University of California Tobacco-Related sjukdom forskningsprogram till AB ( TRDRP-26IR-0015) och ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorerna av studien hade ingen roll i studiedesign, datainsamling, dataanalys, tolkning av data, skrivandet av rapporten eller i beslutet att publicera.
Agar | MO Bio Laboratories, Inc. | 12112-05 | Bacteriological grade |
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Thermo Fisher Scientific | 4337455 | None |
Casein Peptone | Alfa Aesar | H26557 | None |
Gelatine | J. T. Baker | 2124-01 | Powder |
Glycerol | Fisher Scientific | BP 229-1 / M-13750 | None |
LB Agar | Fisher Scientific | BP 9724-500 | None |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 8104 | 50 PCR purification reactions |
Sodium Acetate Trihydrate | Fisher Scientific | M-15756 | None |
Taq5000 DNA Polymerase | Qiagen | 201207 | None |
Thiamine Hydrochloride | Macron Fine Chemicals | 2722-57 | None |
Transpack Packaging Extract | Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. | 200223 | 50 packaging reactions |
Tris Base | Fisher Scientific | BP 152-1 / EC 201-064-4 | None |
Trypton | Biosciences | RC-110 | None |