Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .
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Articolo metodologico
Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'efficiente e robusto isolamento e coltura dei oligodendrocytes primario (OLs) è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla e Malattia di Pelizaeus-Merzbacher-simile (PMLD). Qui, presentiamo un semplice e metodo di selezione efficace per l'isolamento di immunomagnetica di fase tre O4+ cellule preoligodendrocytes da cuccioli di topi neonatali. Poiché immaturo OL costituiscono più dell'80% della materia bianca roditore-cervello postnatale giorno 7 (P7) questo metodo di isolamento non solo assicura un alto rendimento cellulare, ma anche l'isolamento specifico di OLs già commesso alla stirpe oligodendroglial, diminuendo il possibilità di isolare cellule contaminanti quali gli astrociti e altre cellule del cervello del mouse. Questo metodo è una modifica delle tecniche segnalato precedentemente e fornisce del oligodendrocyte preparazione purezza superiore al 80% in circa 4 h.
Introduzione
Oligodendrociti (OLs) sono le cellule di mielinizzazione del sistema nervoso centrale (SNC)1. L'isolamento e la coltura degli oligodendrociti primari in un ambiente strettamente regolamentato è uno strumento prezioso per lo Studio in vitro di sviluppo di oligodendroglia, nonché la biologia di demyelinating malattie come la sclerosi multipla2 . Ciò richiede un'efficiente e robusto del oligodendrocyte isolamento e coltura metodo3. In questo studio, abbiamo approfittato dell'espressione di un indicatore della superficie delle cellule del oligodendrocyte distintivo per implementare una tecnic....
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Protocollo
I topi utilizzati in questo studio sono stati curati per secondo le indicazioni del numero di protocollo di SUNY Downstate Medical Center divisione del laboratorio animale risorse (DLAR) 15-10492.
Nota: Oligodendrocytes primario sono stati isolati da neonatale (P5-P7 selvaggio-tipo C57Bl/6N) topi. In questa fase, immaturi OLs costituiscono più dell'80% della materia bianca del roditore garantire alto rendimento cellulare. Tutti i buffer e composizioni di reagente sono disponibili alla fine della Tabella materiali.
1. preparazione vetrini coprioggetti
Nota: Poli-D-lisina ....
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Risultati
Lo scopo di questo studio era di stabilire un metodo di isolamento migliorato per O4+ oligodendrociti primario del mouse che richiedono la manipolazione meno possibile delle cellule bersaglio. L'intera procedura dall'eutanasia dei cuccioli di placcatura delle celle di vetrini coprioggetti prende circa 4 h e i dati qui indicati rappresentano tre esperimenti indipendenti. Dopo dissociazione del tessuto, una media di 4,3 ± 0,46 x 107 cellule sono state isolate per ogni .......
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Discussione
In questa comunicazione, presentiamo un metodo per l'isolamento efficiente delle culture del oligodendrocyte altamente purificata del mouse immaturo. Rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati39,40, questo metodo ha reso una purezza più elevata con un livello molto più basso degli astrociti GFAP-positive e una percentuale molto bassa di altre cellule non caratterizzato. È importante sottolineare che questi sono immaturi OLs già commit alla stirpe oligodend.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno alcuna informazioni integrative.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) e il National Institutes of Health (R03NS06740402). Gli autori ringraziano il Dr. Ivan Hernandez e membri del suo laboratorio per fornire consulenza, attrezzature e lo spazio laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pipette sierologiche da 10 ml | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| Siringa da 10 ml Punta Luer-Loc | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
| Provette coniche da 15 ml | Falcon | 352097 | |
| Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti | Falcon | 353935 | |
| 40µ filtro per cellule m | Fisher Scientific | 22368547 | |
| provette coniche da 50 ml | Falcon | 352098 | |
| pipette sierologiche da 5 ml | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Piastre per colture tissutali da 60 mm | Falcon | 353002 | |
| 70&; colino per cellule | m Fisher Scientific | 22363548 | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpo secondario | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgM (H+L) anticorpo secondario | Invitrogen | A21042 | |
| Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgM (H+L) anticorpo secondario | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 capra anti-pollo IgG (H + L) anticorpo secondario | Invitrogen | A11042 | |
| Perline Anti-O4- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
| Apo-Transferrin umano | Sigma | T1147 | |
| Autofil gruppo filtro completo per flacone, filtro da 0,22 um, 250 ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
| Autofil filtro completo per flaconi assemblaggio, filtro da 0,22 um, 250 ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
| B27 Integratore | Invitrogen | 17504-044 | |
| Acido borico | Sigma | B7660 | |
| Siero per la crescita bovina (BGS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30541.03 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| CNTF | Peprotech | 450-50 | |
| d-Biotin | Sigma | B4639 | |
| Desossiribonucleasi I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
| Microscopio per epifluorescenza con fotocamera Olympus DP70 | Olympus | Bx51 | |
| Bisturi monouso in piuma | Andwin Scientific | EF7281C | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| vetrini coprioggetti tedeschi, spessore #1, diametro 12 mm | NeuVitro | GG-12-oz | |
| GFAP anticorpo | Aves | GFAP | |
| glucosio | Fisher Scientific | D16-1 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
| insulina | Invitrogen | 12585-014 | |
| Supporto separatore magnetico - MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Separatore magnetico-Separatore MiniMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex PES 0.22µ m unità filtrante | Millipore | SLG033RS | |
| Mezzi di montaggio- Prolong Gold con DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
| N-acetil-cisteina (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Lamina naturale di topo | Invitrogen | 23017-015 | |
| Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Neurotrophin-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
| Anticorpo NG2 | Millipore | AB5320 | |
| Papaina | Worthington | LS003126 | |
| PBS senza Ca2+ e Mg2+ | Sigma | D5652 | |
| PDGF | Peprotech | 100-13A | |
| Petri piastre | Falcon | 351029 | |
| Poli-D-Lisina | Sigma | P6407 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescina | Sigma | P5780 | |
| Colonna di selezione-Colonne LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Selenito di sodio | Sigma | S5261 | |
| Oligoelementi B | Corning | 25-000-CI | |
| Triiodotironina (T3) | Sigma | T6397 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Soluzione blu di tripano | Corning | 25-900-CI | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| B27NBMA | 487,75 mL di terreno neurobasale A; 10 ml di integratore di B27; 1 ml di primocin; 1,25 ml di Glutamax; Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 gradi; C fino all'uso. | ||
| B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL Siero per la crescita bovina | ||
| CNTF in soluzione (10 µ g/ml; 1000X) | Ordina da Peprotech (450-50). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo il produttore s (può variare da lotto a lotto) in buffer (es. DPBS + 0,2% BSA). Conservare a -80 °C. Soluzione di lavoro (10 °C.; g/ml, 1000X) 1. Preparare lo 0,2% di BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in soluzione DPBS e filtrare sterilize. 2. Diluire l'aliquota master stock a 10µ g/ml in sterile, refrigerato 0,2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µ l/tubo) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C. | ||
| Soluzione madre di d-biotina (50 µ g/ml; 5000X) | Risospensione della d-biotina (Sigma-B4639) in H2O a doppia distillazione a 50 µ g/ml (ad es. 2,5 mg in 50 ml di ddH2O). La risospensione potrebbe richiedere una discreta quantità di agitazione/vortice o un leggero riscaldamento brevemente a 37°C. Se la d-biotina continua a non solubilizzare, va bene comporre un prodotto meno concentrato (es. 10µ g/ml) e di aggiungere un volume maggiore al B27NBMA (1/1000), invece di 1/5000). Conservare a 4 gradi. | ||
| DNase I soluzione | 1. Sciogliere a 12.500 U desossiribonucleasi I / ml in HBSS raffreddato su ghiaccio. 2. Sterilizzare il filtro su ghiaccio 3. Aliquot a 200 µ l e congelare durante la notte a -20°C. 4. Conservare le aliquote a una temperatura compresa tra -20 e -30 °C. | ||
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (senza Ca2+ e Mg2+) | Sciogliere la busta in 1 litro d'acqua per ottenere 1 litro di terreno a 9,6 grammi di polvere per litro di terreno. Conservare a 2-8 °C. | ||
| Forskolin soluzione madre (4,2 mg/ml; 1000X) | Aggiungere 1 ml di DMSO sterile a 50 mg di Forskolin in flacone (Sigma-F6886) e pipettare fino a risospensione. Trasferire in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 11 ml di DMSO sterile per portare a 4,2 mg/ml. Aliquot (ad es. 20 µ l) e conservare a -20°C. | ||
| Hank' s sali bilanciati (HBSS) (Sigma | 1. Misurare 900 ml di acqua (temperatura 15-20 ° C) in un cilindro e mescolare delicatamente. 2. Aggiungere la potenza e mescolare fino a quando non si sarà sciolto. 3. Sciacquare la confezione originale con una piccola quantità di acqua per rimuovere ogni traccia della polvere. 4. Aggiungere alla soluzione nel passaggio 2. 5. Aggiungere 0,35 gr di bicarbonato di sodio (7,5% p/v) per ogni litro di volume finale. 6. Continuate a mescolare fino a quando non si sarà sciolto. 7. Regolare il pH del tampone mescolando a 0,1-0,3 unità al di sotto di pH= 7,4 poiché potrebbe aumentare durante la filtrazione. Si consiglia l'uso di 1N HCl o 1N NaOH per regolare il pH. 8. Aggiungere altra acqua per portare il volume finale a 1L. 9. Sterilizzare per filtrazione utilizzando una membrana con una porosità di 0,22 micron. 10. Conservare a 2-8 °C. | ||
| Soluzione madre di insulina (4000 µ g/ml) | Scongelare il flacone e aliquotare 25 µ l per provetta da microcentrifuga e conservare a -20°C. | ||
| di laminina | Scongelare lentamente la laminina al freddo (2° C a 8° C) per evitare la formazione di gel. Quindi, aliquotare in tubi di polipropilene. Negozio a 5 gradi C a -20 gradi C in aliquote (es. 20 µ l) e non congelare/scongelare ripetutamente. La laminina può essere conservata a queste temperature per un massimo di sei mesi. | ||
| di selezione cellulare magnetica (MCS) | Preparare la soluzione contenente soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2 e albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5%, EDTA 0,5 mM, 5µ g/ml di insulina, 1 g/l di glucosio. Sterilizzare e degassare per filtrazione il tampone facendolo passare attraverso un 0,22 µ m Filtro Millex. Conservare il buffer a 4 gradi C fino all'uso della | ||
| soluzione madre di N-acetil-L-cisteina (NAC) (5 mg/ml; 1000X) | Sciogliere la N-acetil-L-cisteina (Sigma-A8199) a 5 mg/ml in DMEM (ad es. 50 mg di NAC in 10 ml di B27NBMA). Sterilizzare e aliquotare il filtro (es. 20 µ l). Conservare a -20°C. | ||
| NT3 soluzione madre (1 µ g/ml; 1000X) | Master stock: Ordina da Peprotech (450-03). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo il produttore s istruzioni (può variare da lotto a lotto), in buffer (es. DPBS + 0,2% BSA). Conservare a -80°C. Scorte di lavoro (1µ g/ml; 1000X): 1. Preparare lo 0,2% di BSA in soluzione DPBS e filtrare sterilize. 2. Diluire l'aliquota del master stock a 1 µ g/ml in sterile, refrigerato 0,2% BSA/DPBS. 3. Aliquote (es. 20µ l/tubo) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C. | ||
| Soluzione madre di PDGF (10 µ g/ml; 1000X) | Magazzino principale: Ordina da Peprotech (100-13A). Preparare da 0,1 a 1 mg/ml secondo il produttore s istruzioni (può variare da lotto a lotto) in buffer (es. DPBS) + 0,2% BSA). Conservare a -80°C. Scorte di lavoro (1µ g/ml; 1000X): 1. Preparare lo 0,2% di BSA in soluzione DPBS e filtrare sterilize. 2. Diluire l'aliquota del master stock a 1µ g/ml in sterile, refrigerato 0,2% BSA/DPBS. 3. Aliquote (es. 20µ l/tubo) e congelare a scatto in azoto liquido. 4. Conservare le aliquote a -80 °C. | ||
| Poli-D-lisina (1mg/ml; 100X) | Risospensione poli-D-lisina, peso molecolare 70-150 kD (Sigma P6407) a 0,5 mg/ml in acido borico 0,15M pH 8,4 (ad es. 50 mg in 50 ml di tampone borato). Filtrare, sterilizzare e aliquotare (es. 100µ l/tubo). Conservare a -20°C. Prima dell'uso, diluire il brodo 100X (1mg/ml) a 50 µ g/ml in acqua sterile. | ||
| proliferazione degli oligodendrociti | , vedere Tabella supplementare 1 | ||
| Mezzi | vedere Tabella supplementare 1 | ||
| Integratore Sato (100X) | vedi Tabella supplementare 1 | ||
| Riferimenti: l'elenco dei reagenti e delle ricette è stato adottato dai protocolli precedentemente descritti da Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purificazione di cellule di lignaggio di oligodendrociti da cortecce di topo mediante immunopanning. Primavera fredda Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) e Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, SR Isolamento di cellule precursori di oligodendrociti corticali di topo. J Metodi Neurosci. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |
Riferimenti
- Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
- Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods.
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Ristampe e permessi
