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Neuroscience

माउस प्राथमिक Oligodendrocytes के तीव्र और विशिष्ट Immunomagnetic अलगाव

doi: 10.3791/57543 Published: May 21, 2018

Summary

हम प्राथमिक माउस oligodendrocytes के immunomagnetic अलगाव का वर्णन है, जो इन विट्रो संस्कृति के लिए कोशिकाओं के तेजी से और विशिष्ट अलगाव की अनुमति देता है ।

Abstract

कुशल और मजबूत अलगाव और प्राथमिक oligodendrocytes (OLs) की संस्कृति oligodendroglia के विकास के रूप में अच्छी तरह से demyelinating रोगों के जीवविज्ञान जैसे कई स्केलेरोसिस और के रूप में के रूप में के लिए एक मूल्यवान उपकरण है Pelizaeus-Merzbacher-जैसे रोग (PMLD) । यहाँ, हम नवजात चूहों पिल्ले से चरण तीन O4+ preoligodendrocytes कोशिकाओं के immunomagnetic अलगाव के लिए एक सरल और कुशल चयन विधि प्रस्तुत करते हैं । के बाद से अपरिपक्व राजभाषा जन्मोत्तर दिवस 7 (P7) में मूषक-मस्तिष्क सफेद पदार्थ का ८०% से अधिक का गठन इस अलगाव विधि न केवल उच्च सेलुलर उपज सुनिश्चित करता है, लेकिन यह भी OLs के विशिष्ट अलगाव पहले से ही oligodendroglial वंश के लिए प्रतिबद्ध, कम astrocytes और माउस मस्तिष्क से अन्य कोशिकाओं के रूप में दूषित कोशिकाओं को अलग करने की संभावना. इस विधि पहले रिपोर्ट की तकनीक का एक संशोधन है, और के बारे में 4 एच में ८०% से ऊपर oligodendrocyte तैयारी पवित्रता प्रदान करता है ।

Introduction

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Oligodendrocytes (OLs) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की myelinating कोशिकाएं हैं1. अलगाव और एक कसकर विनियमित वातावरण में प्राथमिक oligodendrocytes की संस्कृति oligodendroglia के विकास के रूप में अच्छी तरह से demyelinating रोगों के जीव विज्ञान जैसे कई स्केलेरोसिस के रूप में के रूप में के रूप में के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है 2 . यह एक कुशल और मजबूत oligodendrocyte अलगाव और संस्कृति विधि3की आवश्यकता है । इस अध्ययन में, हम तेजी से और विशिष्ट है कि एक संशोधित अलगाव तकनीक को लागू करने के लिए एक विशिष्ट oligodendrocyte कोशिका सतह मार्कर की अभिव्यक्ति का लाभ लिया.

oligodendrocyte परिपक्वता के चार अलग चरणों की पहचान की गई है, प्रत्येक प्रत्येक विकासात्मक चरण के लिए विशिष्ट सेल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति की विशेषता (चित्रा 1) । इन सेल सतह मार्करों विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जा सकता है4,5, और विशिष्ट चरणों में OLs अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहले चरण में, oligodendrocyte प्रणेता कोशिकाओं (OPCs) पैदा करना, विस्थापित करने के लिए क्षमता है, और विशेष रूप से प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर (PDGF-Rα) 6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG2 7, 8 , polysialic एसिड-तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु9 और फैटी एसिड-बाध्यकारी प्रोटीन 7 (FABP7)10। OPCs कुछ कम सेल शरीर है, जो तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं की विशेषता है की विरोध डंडे से निकलने प्रक्रियाओं के साथ द्विध्रुवी आकृति विज्ञान है11

Figure 1
चित्रा 1: माउस oligodendrocyte विकास के दौरान सेल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति. OLs कोशिका सतह मार्करों जैसे A2B5, GalC (O1), NG2, O4, और PDGF-Rα विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट विकास स्तर पर विशेष रूप से oligodendrocytes को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।  

दूसरे चरण में, OPCs preoligodendrocytes और एक्सप्रेस न केवल OPC मार्करों पर सेल झिल्ली में वृद्धि दे, लेकिन यह भी sulfatide (एक सल्फेट galactolipid) O4 एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त12,13, और GPR17 प्रोटीन14, जो अपरिपक्व oligodendrocyte (राजभाषा) अवस्था तक बनी रहती है । इस स्तर पर, preoligodendrocytes multipolar लघु प्रक्रियाओं का विस्तार । Preoligodendrocytes जन्मोत्तर दिवस 2 में प्रमुख राजभाषा मंच है (P2) दोनों चूहे और चूहे के मस्तिष्क सफेद मामले में अपरिपक्व OLs15की एक छोटी सी आबादी के साथ ।

तीसरे चरण के दौरान, अपरिपक्व OLs O4 व्यक्त करने के लिए जारी रखने के लिए, A2B5 और NG2 मार्करों की अभिव्यक्ति खो और galactocerebroside सी16एक्सप्रेस शुरू करते हैं । इस स्तर पर, OLs oligodendroglial वंश के लिए प्रतिबद्ध है और लंबी ramified शाखाओं17,18के साथ पोस्ट-mitotic कोशिकाओं बन जाते हैं । अपरिपक्व राजभाषा P7 पर मूषक सफेद पदार्थ के ८०% से अधिक का गठन और इस समय पहली MBP+ कोशिकाओं को15,19,20,21मनाया जाता है । इसलिए, P7 पर OLs के अलगाव उच्च सेलुलर उपज सुनिश्चित कर सकता है ।

राजभाषा विकास के अंतिम और चौथे चरण में परिपक्व OLs एक्सप्रेस myelinating प्रोटीन्स (myelin बेसिक प्रोटीन (MBP), proteolipid प्रोटीन (PLP), myelin एसोसिएटेड ग्लाइकोप्रोटीन (पत्रिका) और myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग)22,23 ,24,25,26. इस स्तर पर, परिपक्व OLs विस्तार झिल्ली कि axons के आसपास कॉंपैक्ट enwrapping आवरण फार्म और myelinate करने में सक्षम हैं । इस अवलोकन के साथ मेल खाती है कि चूहे और माउस मस्तिष्क में, MBP+ कोशिकाओं P1419,20,21में तेजी से प्रचुर मात्रा में हो जाते हैं ।

१९६७27में Fewster और सहयोगियों द्वारा oligodendrocyte के पहले अलगाव के बाद से, कुतर सीएनएस से OLs के अलगाव के लिए कई तरीकों immunopanning28,29,30सहित लागू किया गया है, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) सेल सतह विशिष्ट एंटीजन28,31, अवकलन ग्रैडिएंट केंद्रापसारक३२,३३,३४,३५ और एक मिलाते हुए अलग सीएनएस glia३६के विभेदक पालन के आधार पर विधि,३७। हालांकि, मौजूदा संस्कृति के तरीकों की सीमाएं हैं, विशेष रूप से शुद्धता, उपज और समय की दृष्टि से३८प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, oligodendrocytes के लिए अधिक कुशल आइसोलेशन विधि आवश्यक हैं ।

इस पत्र में, हम नवजात चूहों पिल्ले से स्टेज तीन O4+ preoligodendrocytes कोशिकाओं के immunomagnetic अलगाव के लिए एक सरल और कुशल चयन विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि एमरी एट अल द्वारा रिपोर्ट तकनीकों का एक संशोधन है । ३९ और Dincman एट अल. ४० और के बारे में 4 एच में ८०% से ऊपर एक oligodendrocyte तैयारी पवित्रता प्रदान करता है ।

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Protocol

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इस अध्ययन में प्रयुक्त चूहों को प्रयोगशाला पशु संसाधन (DLAR) प्रोटोकॉल संख्या 15-10492 के SUNY Downstate चिकित्सा केंद्र प्रभाग के दिशानिर्देशों के अनुसार देखभाल की गई.

नोट: प्राथमिक oligodendrocytes नवजात (P5-P7 वाइल्ड-टाइप C57Bl/6N) चूहों से पृथक किए गए थे । इस स्तर पर, अपरिपक्व OLs उच्च सेलुलर उपज सुनिश्चित करने के लिए कुतर सफेद बात के ८०% से अधिक का गठन । सभी बफर और रिएजेंट रचनाएं सामग्री की तालिकाके अंत में उपलब्ध हैं ।

१. Coverslips तयारी

नोट: पाली-डी-lysine (PDL)/laminin लेपित coverslips को राजभाषा अलगाव से पूर्व तैयार किया जाना चाहिए ।

  1. #1 जर्मन ग्लास coverslips को ५०-एमएल शंकु ट्यूब में रखें और उन्हें साफ करने के लिए ७०% ेतोः की ३५ मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. ट्यूब बंद करें, यह एक nutating मिक्सर में जगह है और धीरे से कमाल करते हुए कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी । Coverslips रातोंरात गर्मी हो सकती है ।
  3. ७०% ेतोः को छोड़ दें ।
  4. coverslips को 3 बार पानी से धो लें, पानी को वैक्यूम आकांक्षा के साथ हर समय निकालें ।
  5. ५०-एमएल ट्यूब में coverslips के लिए 30-35 मिलीलीटर PDL ५० µ g/ml जोड़ें, coverslips को कवर करने के लिए पर्याप्त है ।
  6. एक nutating मिक्सर पर coverslips युक्त ५०-एमएल ट्यूब प्लेस और धीरे से कमाल करते हुए कम से कम 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
  7. coverslips को 3 बार पानी से धोकर, पानी को वैक्यूम आकांक्षा के साथ हर समय निकाल लें ।
  8. coverslips को ६०-mm पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित करना चाहिए जिसमें पानी भरा हो ।
  9. पेट्री डिश की पूरी सतह को कवर एक परत के रूप में coverslips की व्यवस्था करने के लिए एक P200 पिपेट टिप का प्रयोग करें ।
  10. ध्यान से, वैक्यूम आकांक्षा के साथ बर्तन से पानी निकालें ।
  11. coverslips के आसपास पानी की अतिरिक्त निकालें और उंहें खुले ढक्कन के साथ रात भर सूखी और हुड में यूवी प्रकाश के तहत ।
    नोट: PDL लेपित ग्लास coverslips को तीन महीने तक बाँझ पेट्री व्यंजन में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  12. 24 अच्छी तरह से प्लेटें, एक प्रति अच्छी तरह से, ठीक संदंश का उपयोग कर में coverslips प्लेस ।
  13. अच्छी तरह से सुनिश्चित करें कि किनारों अच्छी तरह की दीवार को छूने नहीं कर के केंद्र के लिए coverslips हटो ।
  14. जोड़ें १०० µ के एल 10 µ जी/एमएल laminin B27NBMA में पतला ( सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक coverslip के केंद्र में शुरू करने और किनारों की ओर एक परिपत्र फैशन में जाने के लिए सभी क्षेत्र को कवर ।
    नोट: चूंकि laminin राजभाषा रखरखाव में शामिल है और परिपक्व OLs में भेदभाव को बढ़ावा देता है, यह इन विट्रो संस्कृति४१,४२,४३,४४के लिए एक महत्वपूर्ण राजभाषा अस्तित्व कारक है ।
  15. 5% CO2 में एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में थाली मशीन कम से कम 1 घंटे के लिए या जब तक OLs चढ़ाना के लिए तैयार हैं ।

2. माउस ब्रेन प्रांतस्था पृथक्करण

  1. बलिदान जन्मोत्तर 5-7-दिन पुराने C57Bl/6N माउस पिल्ले कैंची के साथ त्वरित decapitation द्वारा पहले से ७०% इथेनॉल में साफ ।
    नोट: सेरेब्रल cortices से 5-6 नवजात चूहों पिल्ले प्रत्येक तैयारी के लिए इस्तेमाल किया गया. औसतन, एक माउस मस्तिष्क पैदावार 1-1.5 x 106 OLs ।
  2. छोटे विदारक कैंची के साथ midline के साथ खोपड़ी त्वचा में कटौती और खोपड़ी बेनकाब करने के लिए वापस लेना ।
  3. खोपड़ी को ललाट क्षेत्र की ओर पीठ में खोलने से शुरू midline के साथ-साथ, मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाने के लिए कैंची से ऊपर उठाना फिर, खोपड़ी के आधार के साथ एक आंख गर्तिका की ओर खोपड़ी कटौती के पीछे में खोलने का उपयोग कर ।
  4. ठीक संदंश का प्रयोग करें धीरे cortices midbrain से दूर चिढ़ा और उंहें एक ६०-mm ऊतक संस्कृति B27NBMA के 7 मिलीलीटर युक्त पकवान को हस्तांतरण । प्रत्येक मस्तिष्क के लिए २.४ के माध्यम से २.२ चरणों को दोहराएँ, पूलिंग विदारक cortices.
  5. cortices एक नया ६०-mm ऊतक संस्कृति पृथक्करण बफर (B27NBMA, 20-30 u/एमएल Papain, और २,५०० यू DNase) के 5 मिलीलीटर युक्त पकवान के लिए स्थानांतरण ।
  6. पासा के बारे में 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में cortices3 एक #15 स्केलपेल ब्लेड और एक ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2 मशीन में 20 मिनट के लिए मशीन का उपयोग कर ।
  7. एंजाइमी प्रतिक्रिया को रोकने के लिए गोजातीय वृद्धि सीरम (BGS) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. cortices पृथक्करण मीडिया के साथ एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण ।
  9. धीरे से मस्तिष्क ऊतक अलग कर देना करने के लिए शुरू pipetting ऊपर और नीचे 6-8 बार एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक का उपयोग कर, बुलबुले को कम करने के लिए देखभाल का उपयोग कर.
  10. ऊतक हिस्सा 2-3 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए और एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण की अनुमति दें ।
  11. 10% BGS/2500 यू DNase मैं ऊतक गोली से युक्त B27NBMA के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  12. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट धीरे मस्तिष्क ऊतक अलग कर देना जबकि ऊपर और नीचे 6-8 बार pipetting का प्रयोग करें । बुलबुले को कम करने के लिए सावधान रहें ।
  13. ऊतक हिस्सा 2-3 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें ।
  14. supernatant एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण । B27NBMA 10% BGS/DNase मैं ऊतक गोली से युक्त 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  15. धीरे अलग कर देना मस्तिष्क ऊतक एक P1000 प्लास्टिक टिप का उपयोग कर, जबकि pipetting मीडिया और मस्तिष्क ऊतक के मिश्रण ऊपर और नीचे । दोहराएँ चरण २.१३ और २.१४ जब तक ऊतक का कोई बड़ा हिस्सा रहने के लिए या 10% BGS/DNase से युक्त B27NBMA जब तक मैं थक गया है, जो भी पहले आता है. बुलबुले को कम करने के लिए सावधान रहें ।
  16. पिछले supernatants के साथ पूल सेल सस्पेंशन ।
  17. प्लेस ७०-µm सेल छलनी में एक ५०-एमएल ट्यूब । एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक प्लास्टिक का उपयोग करना, ७०-µm सेल छलनी पर परित सेल निलंबन धीरे से गुजारें ।
  18. 10% BGS/DNase I युक्त B27NBMA की 1 मिलीलीटर जोड़कर सेल छलनी को धो लें ।
  19. सेल छलनी को त्यागें । 10% BGS/DNase I युक्त B27NBMA के साथ वॉल्यूम को 30-mL पर लाएं ।
  20. २ १५-एमएल शंकु ट्यूबों के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण । २०० x g पर 10 मिनट के लिए सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक
  21. हवा को उजागर कोशिकाओं को छोड़ के बिना supernatant निकालें । supernatant सेल के मलबे के कारण बादल छाए रहेंगे । गोली के लिए 10% BGS युक्त B27NBMA के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  22. ध्यान से एक P1000 प्लास्टिक का उपयोग कर सेल गोली अलग कर देना । 10% BGS युक्त B27NBMA के साथ 15 मिलीलीटर मात्रा लाने के लिए ।
  23. एक ताजा ४० µm सेल छलनी पर सेल निलंबन दर्रा ।
  24. 10% BGS युक्त B27NBMA के 1mL जोड़कर सेल छलनी को धो लें । सेल छलनी को त्यागें ।
  25. 10% BGS युक्त B27NBMA के साथ मात्रा 30 मिलीलीटर लाने के लिए ।
  26. 2 x 15-एमएल शंकु ट्यूबों के लिए सेल सस्पेंशन स्थानांतरण । २०० x g पर 10 मिनट के लिए सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक
  27. हवा को उजागर कोशिकाओं छोड़ बिना supernatant के अधिकांश निकालें । बर्फ शीत चुंबकीय कोशिका छंटाई (MCS) बफर के 5 मिलीलीटर में सेल छर्रों reसस्पेंड ।

3. सेल गणना और व्यवहार्यता का निर्धारण

  1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में Trypan नीले समाधान के ४०० µ एल के साथ सेल निलंबन के १०० µ l पतला ०.४% में एक 1:5 कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए (डब्ल्यू/
  2. केंद्र एक hemocytometer चैंबर पर एक आवरण गिलास और सेल के 10 µ एल के साथ दो कक्षों को भरने के एक P10 पिपेट का उपयोग कर कमजोर पड़ने और अधिक से परहेज । समाधान केशिका कार्रवाई द्वारा कवर ग्लास के तहत पारित होगा ।
  3. माइक्रोस्कोप मंच पर hemocytometer प्लेस और 40X आवर्धन का उपयोग कर ध्यान समायोजित करें ।
    नोट: सेल की गिनती पांच चौकों (चार कोनों और एक केंद्र) में से प्रत्येक में एक हाथ से आयोजित काउंटर का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं । केवल गैर व्यवहार्य कोशिकाओं डाई को अवशोषित और नीले रंग दिखाई देते हैं, जबकि रहते हैं और स्वस्थ कोशिकाओं को गोल और अपवर्तन दिखाई देते हैं और नीले रंगों के डाई को अवशोषित नहीं करते हैं, milliliter प्रति व्यवहार्य और कुल कोशिकाओं की संख्या के निर्धारण के लिए अनुमति देता है ।

4. O4 का अलगाव+ Oligodendrocytes

  1. 10 मिनट के लिए २०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  2. ध्यान से वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करके supernatant त्याग, कोशिकाओं के जोखिम से बचने के लिए हवा ।
  3. 1 x 10 के प्रति MCS बफर के ९० µ एल में गोली पुनः स्थगित7 कुल कोशिकाओं 1 x 107 कोशिकाओं को विरोधी के 10 µ एल के अलावा के बाद O4 मोतियों ।
  4. इस सेल सस्पेंशन और मोतियों को धीरे से 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब 4-5 बार उंगली के साथ झाड़ कर मिलाएं ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन, उंगली 4-5 timesevery 5 मिनट के साथ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब झाड़ ।
  6. धीरे ट्यूब के लिए 1 x 107 कोशिकाओं के प्रति MCS बफर के 2 मिलीलीटर जोड़कर मिश्रण धो लो । 10 मिनट के लिए २०० x g पर मिश्रण केंद्रापसारक ।
  7. ध्यान से वैक्यूम आकांक्षा का उपयोग करके supernatant त्यागें, हवा के लिए कोशिकाओं के जोखिम से परहेज । हर 1 एक्स 107 कोशिकाओं के लिए MCS बफर के ५०० µ एल में सेल गोली reसस्पेंड ।
  8. चुंबकीय विभाजक को एक चुम्बकीय विभाजक खड़े करने के लिए संलग्न करें. चुंबकीय विभाजक के लिए एक चयन कॉलम संलग्न और कॉलम के शीर्ष पर एक ४० µm सेल छलनी जगह है । २ १५-एमएल या १ ५०-एमएल शंकु ट्यूब पृथक्करण स्तंभ से नीचे के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा करने के लिए जगह है ।
  9. पूर्व कुल्ला ४०-µm सेल छलनी और जुदाई कॉलम MCS बफर के 3 मिलीलीटर के साथ और चलो यह सूखी दे बिना कॉलम के माध्यम से चलाने के बफर ।
  10. सेल निलंबन और मोती के मिश्रण सेल छलनी और चयन कॉलम में जोड़ें ।
  11. धो ४० µm सेल छलनी MCS बफर की 1 मिलीलीटर के साथ ।
  12. सेल छलनी त्यागें और कोशिकाओं के मिश्रण, मोतियों और बफर दे यह सूखी बिना कॉलम के माध्यम से चलाते हैं ।
  13. जुदाई कॉलम 3 बार MCS बफर और 1 समय के साथ 3 मिलीलीटर के साथ धो लें राजभाषा प्रसार मीडिया ।
  14. चुंबकीय विभाजक से जुदाई कॉलम निकालें, जल्दी से एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जगह है, और तुरंत राजभाषा प्रसार मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  15. कॉलम के शीर्ष पर एक गोताख़ोर रखें और मजबूती से 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में लेबल कोशिकाओं को फ्लश करने के लिए धक्का ।
  16. सेल की गणना और Trypan नीला और hemocytometer के रूप में धारा 3 में संकेत का उपयोग कर व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए कक्ष निलंबन के १०० µ एल निकालें ।
    नोट: ८०% से ऊपर कोशिका व्यवहार्यता OLs की संस्कृति के साथ आगे बढ़ना स्वीकार्य माना जाता है, लेकिन व्यवहार्यता से अधिक ९०% इष्टतम है ।

5. पृथक O4 का चढ़ाना+ Oligodendrocytes

  1. इच्छा चढ़ाना घनत्व के लिए सेल निलंबन पतला (5 एक्स 105 coverslip प्रति कोशिकाओं) राजभाषा प्रसार मीडिया का उपयोग कर ।
    नोट: राजभाषा सीडिंग घनत्व बहुत महत्वपूर्ण है, इसलिए उपयुक्त कोशिका घनत्व आगे बढ़ने से पहले एक ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पुष्टि की जानी चाहिए । १०,००० कोशिकाओं के नीचे सीडिंग घनत्व/coverslips गरीब सेल अस्तित्व के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । १०,००० से २५,००० में चढ़ाना घनत्व पर, राजभाषा रूपात्मक भेदभाव४५धीमी है । हम सेल के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए कम से ५०,००० कोशिकाओं के एक बीज का घनत्व पर OLs प्लेट/coverslips ।
  2. 24 अच्छी तरह से coverslips युक्त प्लेटें ऊतक संस्कृति हूड के लिए मशीन से laminin के साथ लेपित ले जाएं ।
  3. प्रत्येक coverslip से laminin निकालें और इसे राजभाषा निलंबन के १०० µ l के साथ बदलें ।
  4. ३७ ° c/5% कं2 मशीन में OLs मशीन ४५ मिनट की एक अधिकतम के लिए coverslips को राजभाषा आसंजन को बढ़ावा देने के लिए ।
  5. मशीन के बाद, 24 मशीन से अच्छी तरह से प्लेटें हटा दें । बाढ़ एक अच्छी तरह से 24 के साथ प्लेट ५०० µ एल के साथ राजभाषा प्रसार मीडिया ।
  6. ३७ ° c/5% कं2 मशीन अतिरिक्त 24 एच के लिए में वापस OLs प्लेस ।
  7. 24 ज OLs के चढ़ाना के बाद, प्रसार मीडिया और राजभाषा भेदभाव मीडिया के साथ स्थानापंन हटाने के लिए भेदभाव प्रेरित ।
  8. OLs वापस मशीन में रखें और जब तक कोशिकाओं को निर्धारण के लिए तैयार कर रहे है दूर नहीं है ।
    नोट: पीएच में परिवर्तन OLs और कम सेल व्यवहार्यता के लिए हानिकारक हैं, इसलिए मशीन से OLs संस्कृतियों के अनावश्यक हटाने से बचा जाना चाहिए ।

6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. सेल सतह मार्करों (NG2, O1 और O4) का पता लगाने के लिए मीडिया कुओं से हटा दें ।
  2. जोड़ें २५० µ माउस hybridoma supernatants O1 के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त (पतला)13 और O4 (पतला)13 और polyclonal के खिलाफ खरगोश NG2 (1:150 B27NBMA में पतला) ।
    नोट: यदि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटी-O1 और एंटी-O4 एंटीबॉडी का उपयोग किया जाना है, तो निर्माता द्वारा सुझाए गए कमजोरों का उपयोग करना उचित है ।
  3. एक ३७ ° c/5% CO2 मशीन में ४५ मिनट अधिकतम के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
  4. ०.०५% के बीच-20/1x पंजाबियों के साथ दो बार धोएं । कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (4% पीएफए) के साथ कोशिकाओं को ठीक करें ।
  5. धो 5 ०.०५% के बीच प्रत्येक मिनट के लिए तीन बार-20/
  6. पतला Alexa ४८८-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस आईजीएम या विरोधी खरगोश आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) B27NBMA में ।
  7. coverslips से ०.०५% के बीच-20/ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
  8. धो 5 ०.०५% के बीच प्रत्येक मिनट के लिए तीन बार-20/
  9. आंतरिक मार्करों (GFAP) का पता लगाने के लिए डबल धुंधला के लिए, ०.०५% के बीच-20/1x पंजाबियों और ब्लॉक/permeabilize कोशिकाओं के लिए ब्लॉक/permeabilization बफर के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हटा दें । अंयथा ६.१७ कदम के लिए आगे बढ़ना ।
  10. ब्लॉक/permeabilization बफर निकालें और २५० µ एल चिकन एंटी GFAP (1:100) ब्लॉक में पतला/permeabilization बफर जोड़ें ।
  11. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए विरोधी GFAP के साथ कोशिकाओं की मशीन । धो 5 ०.०५% के बीच प्रत्येक मिनट के लिए तीन बार-20/
  12. पतला Alexa ५९४-संयुग्मित बकरी विरोधी चिकन आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) B27NBMA में ।
  13. coverslips से ०.०५% के बीच-20/ अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की मशीन ।
  14. धो 5 ०.०५% के बीच प्रत्येक मिनट के लिए तीन बार-20/
  15. Counterstain के साथ 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) और antifade युक्त DAPI बढ़ते मीडिया के साथ कोशिकाओं माउंट ।
  16. कमरे के तापमान पर अंधेरे में रात भर coverslips इलाज करते हैं ।
  17. छवि एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ सना हुआ कोशिकाओं ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं 40X आवर्धन पर एक समान जोखिम समय का उपयोग कर imaged थे ।

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इस अध्ययन का उद्देश्य O4+ प्राथमिक माउस के लिए एक बेहतर अलगाव विधि स्थापित करने के लिए किया गया था oligodendrocytes लक्ष्य कोशिकाओं के ंयूनतम संभव हेरफेर की आवश्यकता होती है । coverslips में कोशिकाओं की चढ़ाना करने के लिए पिल्ले की इच्छामृत्यु से पूरी प्रक्रिया के बारे में 4 एच और डेटा यहां दिखाया तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व लेता है । ऊतक पृथक्करण के बाद, ४.३ ± ०.४६ x 107 कोशिकाओं के एक औसत ९१% ± ५.६% की व्यवहार्यता के साथ प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग के लिए अलग किया गया । immunomagnetic अलगाव विरोधी O4 टैग चुंबकीय microbeads का उपयोग करने के बाद ६.९ ± ०.३८ x 106 OLs की एक औसत प्राप्त किया गया (1-1.5 x 106 प्रति माउस) जो १६.२% ± १.६% है शुरू में कुल कोशिकाओं का असंबद्ध; व्यवहार्यता ९६.३% ± ३.५% थी ।

Figure 2
चित्रा 2: Immunomagnetically अलग OLs एक्सप्रेस 1DIV पर अपरिपक्व मार्करों । (A) चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप शो द्वि-और त्रि-ध्रुवीय आकृति विज्ञान के अंतर्गत OLs । OLs express NG2 (B), O4 (C), और O1 (D) । बहुत कुछ astrocytes पर मौजूद थे 1DIV (C, red), स्केल बार = ५० µm. डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

immunomagnetically अलग कोशिकाओं के प्रतिजनी phenotype की जांच करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 24 एच (1DIV) और ७२ ज (3DIV) प्रदर्शन किया गया था । 1DIV में, कक्ष द्वि-या tripolar के चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप (चित्रा 2a-B), प्रारंभिक चरण proliferating OLs (OPCs और या preoligodendrocytes) की विशेषता की एक विशेषता के तहत दिखाई दिया । इन कोशिकाओं के ६६.१ ± ८.४% NG2-लेबल (चित्रा 2 बी) थे, और ५८% ± ९.४% कोशिकाओं O4-लेबल (चित्रा 2c) थे । O1 (GalC)-लेबलिंग, oligodendrocyte वंश में अधिक परिपक्व कोशिकाओं के मार्कर, बहुत कम आम था (७.४% ± ६.०%, चित्रा 2d). इस मार्कर प्रोफ़ाइल पता चलता है कि इस बिंदु पर कोशिकाओं के अधिकांश छोटे प्रतिशत अपरिपक्व या परिपक्व ओलिगोस्पर्मिया और संभवतः कुछ oligodendrocyte जनक कोशिकाओं (OPCs) के साथ पूर्व oligodendrocytes हैं । Astrocytes, GFAP धुंधला द्वारा सबूत के रूप में, ०.५७ ± १.०% (चित्रा 2c) के शामिल हैं । इन आंकड़ों का सुझाव है कि संशोधित तकनीक के साथ अलग oligodendrocytes अत्यधिक शुद्ध और बहुमत अपरिपक्व oligodendrocytes के एक विशिष्ट मार्कर के लिए अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा रहे हैं ।

Figure 3
चित्रा 3:3DIV पर परिपक्व OLs मार्करों की अभिव्यक्ति । (A) चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के अंतर्गत OLs अधिक जटिल आकृति विज्ञान दिखाएं । 3DIV में, NG2 () की अभिव्यक्ति नाटकीय रूप से कम हो जाती है, जबकि O4 (सी) और O1 (डी) में वृद्धि । कुछ astrocytes 3DIV पर दिखाई दे रहे हैं (, लाल), स्केल बार = ५० µm. डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3DIV में, oligodendrocyte आकृति 1DIV (चित्र 3ए) में कक्षों की तुलना में अधिक जटिल दिखाई दी. इस समय बिंदु पर, जल्दी oligodendrocyte मार्कर NG2 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं की आवृत्ति 1DIV की तुलना में बहुत कम था. NG2-लेबल वाले कक्षों में ३१.२ ± १७.१% (बनाम ६६.१ ± ८.४% पर 1DIV, t-परीक्षण p < 0.0001, चित्र बीसी, चित्र 4a). हालांकि यहां विश्लेषण नहीं, NG2 के लिए सकारात्मक समझा कोशिकाओं में दाग की औसत तीव्रता 1DIV की तुलना में 3DIV पर कम किया गया था । अधिकांश कक्ष (८१.९% ± ४.८८४%, चित्रा 3सी) ने O4-लेबलिंग दिखाई, जो 1DIV (५८% ± ९.४%, t-test p < 0.0001, figure 4B) से अधिक थी । इसके अलावा, लगभग आधे कोशिकाओं (४७.२% ± १६.४%, चित्रा 3 डी) O1 के लिए धुंधला दिखाई दिया (GalC), अधिक परिपक्व oligodendrocyte वंश के एक मार्कर, सुझाव है कि कोशिकाओं को एक अधिक परिपक्व phenotype करने के लिए अंतर कर रहे हैं. 3DIV पर O1+ कोशिकाओं की वृद्धि भी 1DIV (७.४% ± ६.०%, टी-टेस्ट पी < 0.0001, फिगर 4c) की तुलना में महत्वपूर्ण थी । इस समय बिंदु पर astrocytes की उपस्थिति बेहद कम (०.८% ± १.५%, चित्रा 3सी) बनी रही और यह 1DIV की तुलना में काफी अलग नहीं थी (०.५७% ± १.०%, महत्वपूर्ण नहीं (एन एस), चित्रा 4d) । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि समय के साथ, immunomagnetically पृथक oligodendrocytes इस तरह के astrocytes के रूप में अन्य कोशिका प्रकार के बहुत कम संदूषण के साथ परिपक्वता के तीन चरण में इन विट्रो में अंतर करने में सक्षम हैं.

Figure 4
चित्रा 4:1DIV और 3DIV (ए-डी) में राजभाषा मार्करों की अभिव्यक्ति का ठहराव. 1DIV पर, कोशिकाओं के ६६% थे NG2+, कोशिकाओं के ५८% थे O4+, कोशिकाओं के 7% थे O1+ और कोशिकाओं के ०.५% GFAP+थे. 3DIV पर, कोशिकाओं के 31% थे NG2+, कोशिकाओं के ८१% थे O4+, कोशिकाओं के ४७% थे O1+ और कोशिकाओं के ०.७% GFAP+थे । मतलब मान ± एसडी यहां प्रस्तुत कर रहे हैं, * * * * इंगित करता है p < 0.0001, ns = महत्वपूर्ण नहीं है । डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों से एकत्र किए गए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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इस संचार में, हम अत्यधिक शुद्ध अपरिपक्व माउस oligodendrocyte संस्कृतियों के कुशल अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में३९,४०, इस विधि GFAP के एक बहुत कम स्तर के साथ एक उच्च शुद्धता उपज-सकारात्मक astrocytes और अन्य गैर चरित्र कोशिकाओं के एक बहुत कम प्रतिशत. यह कहना है कि ये अपरिपक्व OLs पहले से ही oligodendroglial वंश के लिए प्रतिबद्ध है महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, इन कोशिकाओं को भेदभाव के प्रारंभिक चरणों के अध्ययन के लिए उपयोगी नहीं होगा ।

Dincman प्रोटोकॉल से संशोधनों में से एक४० हमारे प्रसार मीडिया से बुनियादी fibroblast विकास फैक्टर (bFGF) को हटाने की थी । यह बताया गया है कि इन विट्रो में, bFGF एक मजबूत mitogenic कारक के रूप में अभिनय न केवल भेदभाव से OPCs को रोकता है, लेकिन यह भी प्रक्रियाओं की संख्या में कमी करता है४६,४७. इसके अलावा, bFGF oligodendrocyte विभेदन और oligodendroglial वंश ४८के पारित कोशिकाओं में प्रसार बढ़ जाती है । इसलिए, यह प्रशंसनीय है कि कम संख्या में O4+ कोशिकाओं और A2B5+ और NG2+ कोशिकाओं की बढ़ी हुई संख्या Dincman अध्ययन४० में मनाया संस्कृति में bFGF के प्रभाव के कारण हो सकता है ।

कक्षों को अलग करने के लिए विधि के रूप में O4 बाइंडिंग का उपयोग करने के बावजूद, केवल ५९% कक्षों की O4+ 1DIV पर हैं । ये परिणाम गुणात्मक रूप से उन Dincman और सहकर्मियों४० के समान है जो कि अलगाव के लिए बाध्यकारी O4 का उपयोग करते हुए, कक्षों के ५०% से थोड़ा कम 1DIV पर O4+ थे । यह दिखाया गया है कि PDGF देरी के बाद mitotic विकास क्षणिक O4+GalC- progenitors को A2B5+O4- प्री-जनक की तरह कोशिकाओं है कि बाद में भी PDGF की जारी उपस्थिति में अंतर ४९. इसलिए, यह संभावना है कि पहले दिन में प्रसार की प्रक्रिया के दौरान इन विट्रो कुछ अपरिपक्व OLs O4 से एक उत्क्रमण का अनुभव हो सकता है+NG2+ करने के लिए O4-NG2+, जबकि अभी भी शेष प्रतिबद्ध oligodendrocyte वंश को । इस परिकल्पना है Dincman खोज४० द्वारा समर्थित है कि तुरंत बाद कोशिकाओं के ८०% के बारे में अलगाव O4+थे ।

3DIV से कम, इस प्रोटोकॉल एक कुछ हद तक उच्च राजभाषा शुद्धता पैदा की तुलना में है कि दूसरों के द्वारा वर्णित३९,४० हालांकि हम एक सिर को अपने तरीकों के साथ सिर की तुलना नहीं कर पाया । Dincman एट अल के प्रोटोकॉल की तुलना में । ४०, हमारी संस्कृतियों में GFAP-सकारात्मक कोशिकाओं की कम संख्या का प्रसार मीडिया में FGF की कमी के कारण हो सकता है. एमरी और डुगा प्रोटोकॉल३९ संस्कृति व्यंजन के माध्यम से कोशिकाओं के अनुक्रमिक बीतने पर निर्भर करता है; astrocytes संस्कृति व्यंजन को आसानी से संलग्न कर सकते है५० और immunopanning प्रोटोकॉल के दौरान कोशिकाओं के प्रत्येक अनुक्रमिक बीतने के बाद खत्म किया जा सकता है । प्रस्तुत विधि हमारे शुद्धि अंश में प्रदूषित astrocytes को शुरू करने का जोखिम नहीं लेती.

हमारे संशोधित विधि तेजी से अंय दो के बारे में 4 एच करने के लिए प्रदर्शन की तुलना में है । हम अनावश्यक कदम और अंय प्रोटोकॉल द्वारा शामिल एजेंट को नष्ट करने से यह हासिल । उदाहरण के लिए, Dincman प्रोटोकॉल४०, जो 5-6 h लेता है की तुलना में, हम दोनों का उपयोग एक किट के तंत्रिका ऊतक पृथक्करण और चूहा विरोधी माउस आईजीएम मोतियों के साथ राजभाषा सेल निलंबन की मशीन को छोड़ मृत कोशिकाओं को हटा दें । इसके बजाय, हम papain और मृत कोशिकाओं के साथ माउस मस्तिष्क cortices के पृथक्करण प्रदर्शन कम गति केंद्रापसारक (२०० x g) प्रदर्शन से हटा दिया गया ।

एमरी प्रोटोकॉल३९है, जो के बारे में 9 एच लेता से एक प्रमुख संशोधन, immunopanning चयन को हटाने और एक प्रत्यक्ष हे2/CO के लिए आवश्यकता के हटाने के लिए इस्तेमाल किया गया था2 लाइन ऊतक के दौरान Papain बफर पूर्व equilibrate पाचन. इसके बजाय, हम immunomagnetic चयन और सह2 मशीन में माउस मस्तिष्क cortices और Papain बफर के मिश्रण के प्रत्यक्ष मशीन का इस्तेमाल किया ।

हालांकि इस अध्ययन में सीधे तौर पर जांच नहीं की जाती, एंटी O4 microbeads को चूहे, ह्यूमन और ट्रांसजेनिक माउस ब्रेन टिशू से OLs को अलग करने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है । इस तकनीक की बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला गया OLs अलगाव के लिए एकाधिक ऊतक स्रोतों का उपयोग करने की क्षमता के साथ OLs माउस के अलावा अंय स्रोतों से काम करने में रुचि प्रयोगशालाओं लाभ ।

अंत में, इस अध्ययन में वर्णित संशोधित OPC आइसोलेशन विधि myelination और demyelinating रोग के अध्ययन में लागू किया जा सकता है कि प्राथमिक माउस oligodendrocytes प्राप्त करने के लिए एक तेजी से और विशिष्ट विकल्प प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों ने कोई खुलासे नहीं किए हैं ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी (RG4591A1/2) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R03NS06740402) से अनुदान का समर्थन किया गया था । लेखकों को प्रयोगशाला अंतरिक्ष, उपकरण और सलाह प्रदान करने के लिए डॉ इवान Hernandez और उनके प्रयोगशाला के सदस्यों का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10J
10ml syringe Luer-Loc tip BD, Becton Dickinson 309604
15ml conical tubes Falcon 352097
24-well tissue culture plates Falcon 353935
40µm cell strainer Fisher Scientific 22368547
50ml conical tubes Falcon 352098
5ml serological pipets Fisher Scientific 13-676-10H
60mm tissue culture plates Falcon 353002
70µm cell strainer Fisher Scientific 22363548
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11001
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A21042
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody Invitrogen A11008
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody Invitrogen A11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads Miltenyi Biotec 130-094-543
Apo-Transferrin human Sigma T1147
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1101
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml USA Scientific 6032-1102
B27 Supplement Invitrogen 17504-044
Boric acid Sigma B7660
Bovine Growth Serum (BGS) GE Healthcare Life Sciences SH30541.03
BSA Fisher Scientific BP-1600-100
CNTF Peprotech 450-50
d-Biotin Sigma B4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I) Worthington LS002007
EDTA Fisher Scientific S311
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera Olympus Bx51
Feather disposable scalpels Andwin Scientific EF7281C
Forskolin Sigma F6886
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round NeuVitro GG-12-oz
GFAP antibody Aves GFAP
Glucose Fisher Scientific D16-1
GlutaMAX Invitrogen 35050-61
Insulin Invitrogen 12585-014
Magnetic separator stand - MACS multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
Magnetic separator-MiniMACS separator Miltenyi Biotec 130-042-302
Millex PES 0.22µm filter unit Millipore SLG033RS
Mounting media- Prolong Gold with DAPI Thermo Fisher P36930
N-acetyl-cysteine (NAC) Sigma A8199
Natural mouse laminin Invitrogen 23017-015
Neurobasal Medium A Invitrogen 10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3) Peprotech 450-03
NG2 antibody Millipore AB5320
Papain Worthington LS003126
PBS without Ca2+ and Mg2+ Sigma D5652
PDGF Peprotech 100-13A
Petri dishes Falcon 351029
Poly-D-Lysine Sigma P6407
Primocin Invivogen ant-pm-2
Progesterone Sigma P8783
Putrescine Sigma P5780
Selection column-LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
Sodium Selenite Sigma S5261
Trace elements B Corning 25-000-CI
Triiodothyronine (T3) Sigma T6397
Triton-X Sigma T8787
Trypan Blue Solution Corning 25-900-CI
Tween 20 Sigma P1379
B27NBMA 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use.
B27NBMA + 10% BGS 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C.
Working solution (10 µg/ml, 1000X)
1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80 °C.
d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C.
DNase I stock solution 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice.
2. Filter sterilize on ice
3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C.
4. Store aliquots at -20 to -30°C.
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C.
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C.
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently.
2. Add the power and stir until dissolved.
3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder.
4. Add to the solution in step 2.
5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume.
6. Keep stirring until dissolved.
7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH.
8. Add additional water to bring the final volume to 1L.
9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns.
10. Store at 2-8 °C.
Insulin stock solution (4000 µg/ml) Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C.
Laminin solution Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months.
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C.
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) Master stock:
Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C.

Working stock (1µg/ml; 1000X):
1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize.
2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen.
4. Store aliquots at -80°C.
Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water.
Oligodendrocyte proliferation media see Supplementary Table 1
Oligodendrocyte differentiation media see Supplementary Table 1
Sato supplement (100X) see Supplementary Table 1
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))

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References

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माउस प्राथमिक Oligodendrocytes के तीव्र और विशिष्ट Immunomagnetic अलगाव
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Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).More

Flores-Obando, R. E., Freidin, M. M., Abrams, C. K. Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes. J. Vis. Exp. (135), e57543, doi:10.3791/57543 (2018).

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