हम प्राथमिक माउस oligodendrocytes के immunomagnetic अलगाव का वर्णन है, जो इन विट्रो संस्कृति के लिए कोशिकाओं के तेजी से और विशिष्ट अलगाव की अनुमति देता है ।
कुशल और मजबूत अलगाव और प्राथमिक oligodendrocytes (OLs) की संस्कृति oligodendroglia के विकास के रूप में अच्छी तरह से demyelinating रोगों के जीवविज्ञान जैसे कई स्केलेरोसिस और के रूप में के रूप में के लिए एक मूल्यवान उपकरण है Pelizaeus-Merzbacher-जैसे रोग (PMLD) । यहाँ, हम नवजात चूहों पिल्ले से चरण तीन O4+ preoligodendrocytes कोशिकाओं के immunomagnetic अलगाव के लिए एक सरल और कुशल चयन विधि प्रस्तुत करते हैं । के बाद से अपरिपक्व राजभाषा जन्मोत्तर दिवस 7 (P7) में मूषक-मस्तिष्क सफेद पदार्थ का ८०% से अधिक का गठन इस अलगाव विधि न केवल उच्च सेलुलर उपज सुनिश्चित करता है, लेकिन यह भी OLs के विशिष्ट अलगाव पहले से ही oligodendroglial वंश के लिए प्रतिबद्ध, कम astrocytes और माउस मस्तिष्क से अन्य कोशिकाओं के रूप में दूषित कोशिकाओं को अलग करने की संभावना. इस विधि पहले रिपोर्ट की तकनीक का एक संशोधन है, और के बारे में 4 एच में ८०% से ऊपर oligodendrocyte तैयारी पवित्रता प्रदान करता है ।
Oligodendrocytes (OLs) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की myelinating कोशिकाएं हैं1. अलगाव और एक कसकर विनियमित वातावरण में प्राथमिक oligodendrocytes की संस्कृति oligodendroglia के विकास के रूप में अच्छी तरह से demyelinating रोगों के जीव विज्ञान जैसे कई स्केलेरोसिस के रूप में के रूप में के रूप में के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है 2 . यह एक कुशल और मजबूत oligodendrocyte अलगाव और संस्कृति विधि3की आवश्यकता है । इस अध्ययन में, हम तेजी से और विशिष्ट है कि एक संशोधित अलगाव तकनीक को लागू करने के लिए एक विशिष्ट oligodendrocyte कोशिका सतह मार्कर की अभिव्यक्ति का लाभ लिया.
oligodendrocyte परिपक्वता के चार अलग चरणों की पहचान की गई है, प्रत्येक प्रत्येक विकासात्मक चरण के लिए विशिष्ट सेल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति की विशेषता (चित्रा 1) । इन सेल सतह मार्करों विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पहचाना जा सकता है4,5, और विशिष्ट चरणों में OLs अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. पहले चरण में, oligodendrocyte प्रणेता कोशिकाओं (OPCs) पैदा करना, विस्थापित करने के लिए क्षमता है, और विशेष रूप से प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर (PDGF-Rα) 6, ganglioside A2B5, proteoglycan NG2 7, 8 , polysialic एसिड-तंत्रिका कोशिका आसंजन अणु9 और फैटी एसिड-बाध्यकारी प्रोटीन 7 (FABP7)10। OPCs कुछ कम सेल शरीर है, जो तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं की विशेषता है की विरोध डंडे से निकलने प्रक्रियाओं के साथ द्विध्रुवी आकृति विज्ञान है11।
चित्रा 1: माउस oligodendrocyte विकास के दौरान सेल सतह मार्करों की अभिव्यक्ति. OLs कोशिका सतह मार्करों जैसे A2B5, GalC (O1), NG2, O4, और PDGF-Rα विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके विशिष्ट विकास स्तर पर विशेष रूप से oligodendrocytes को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
दूसरे चरण में, OPCs preoligodendrocytes और एक्सप्रेस न केवल OPC मार्करों पर सेल झिल्ली में वृद्धि दे, लेकिन यह भी sulfatide (एक सल्फेट galactolipid) O4 एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त12,13, और GPR17 प्रोटीन14, जो अपरिपक्व oligodendrocyte (राजभाषा) अवस्था तक बनी रहती है । इस स्तर पर, preoligodendrocytes multipolar लघु प्रक्रियाओं का विस्तार । Preoligodendrocytes जन्मोत्तर दिवस 2 में प्रमुख राजभाषा मंच है (P2) दोनों चूहे और चूहे के मस्तिष्क सफेद मामले में अपरिपक्व OLs15की एक छोटी सी आबादी के साथ ।
तीसरे चरण के दौरान, अपरिपक्व OLs O4 व्यक्त करने के लिए जारी रखने के लिए, A2B5 और NG2 मार्करों की अभिव्यक्ति खो और galactocerebroside सी16एक्सप्रेस शुरू करते हैं । इस स्तर पर, OLs oligodendroglial वंश के लिए प्रतिबद्ध है और लंबी ramified शाखाओं17,18के साथ पोस्ट-mitotic कोशिकाओं बन जाते हैं । अपरिपक्व राजभाषा P7 पर मूषक सफेद पदार्थ के ८०% से अधिक का गठन और इस समय पहली MBP+ कोशिकाओं को15,19,20,21मनाया जाता है । इसलिए, P7 पर OLs के अलगाव उच्च सेलुलर उपज सुनिश्चित कर सकता है ।
राजभाषा विकास के अंतिम और चौथे चरण में परिपक्व OLs एक्सप्रेस myelinating प्रोटीन्स (myelin बेसिक प्रोटीन (MBP), proteolipid प्रोटीन (PLP), myelin एसोसिएटेड ग्लाइकोप्रोटीन (पत्रिका) और myelin oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग)22,23 ,24,25,26. इस स्तर पर, परिपक्व OLs विस्तार झिल्ली कि axons के आसपास कॉंपैक्ट enwrapping आवरण फार्म और myelinate करने में सक्षम हैं । इस अवलोकन के साथ मेल खाती है कि चूहे और माउस मस्तिष्क में, MBP+ कोशिकाओं P1419,20,21में तेजी से प्रचुर मात्रा में हो जाते हैं ।
१९६७27में Fewster और सहयोगियों द्वारा oligodendrocyte के पहले अलगाव के बाद से, कुतर सीएनएस से OLs के अलगाव के लिए कई तरीकों immunopanning28,29,30सहित लागू किया गया है, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS) सेल सतह विशिष्ट एंटीजन28,31, अवकलन ग्रैडिएंट केंद्रापसारक३२,३३,३४,३५ और एक मिलाते हुए अलग सीएनएस glia३६के विभेदक पालन के आधार पर विधि,३७। हालांकि, मौजूदा संस्कृति के तरीकों की सीमाएं हैं, विशेष रूप से शुद्धता, उपज और समय की दृष्टि से३८प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए आवश्यक है । इसलिए, oligodendrocytes के लिए अधिक कुशल आइसोलेशन विधि आवश्यक हैं ।
इस पत्र में, हम नवजात चूहों पिल्ले से स्टेज तीन O4+ preoligodendrocytes कोशिकाओं के immunomagnetic अलगाव के लिए एक सरल और कुशल चयन विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि एमरी एट अल द्वारा रिपोर्ट तकनीकों का एक संशोधन है । ३९ और Dincman एट अल. ४० और के बारे में 4 एच में ८०% से ऊपर एक oligodendrocyte तैयारी पवित्रता प्रदान करता है ।
इस संचार में, हम अत्यधिक शुद्ध अपरिपक्व माउस oligodendrocyte संस्कृतियों के कुशल अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में३९,४०, इस विधि GFAP के एक बहुत कम स…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन में राष्ट्रीय मल्टीपल स्केलेरोसिस सोसाइटी (RG4591A1/2) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R03NS06740402) से अनुदान का समर्थन किया गया था । लेखकों को प्रयोगशाला अंतरिक्ष, उपकरण और सलाह प्रदान करने के लिए डॉ इवान Hernandez और उनके प्रयोगशाला के सदस्यों का धंयवाद ।
10ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
10ml syringe Luer-Loc tip | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
15ml conical tubes | Falcon | 352097 | |
24-well tissue culture plates | Falcon | 353935 | |
40µm cell strainer | Fisher Scientific | 22368547 | |
50ml conical tubes | Falcon | 352098 | |
5ml serological pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
60mm tissue culture plates | Falcon | 353002 | |
70µm cell strainer | Fisher Scientific | 22363548 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A21042 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgM (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11008 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-chicken IgG (H+L) secondary antibody | Invitrogen | A11042 | |
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
Apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
Autofil complete bottle top filter assembly, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Boric acid | Sigma | B7660 | |
Bovine Growth Serum (BGS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30541.03 | |
BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
CNTF | Peprotech | 450-50 | |
d-Biotin | Sigma | B4639 | |
Desoxyribonuclease I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
Epifluorescence microscope with an Olympus DP70 camera | Olympus | Bx51 | |
Feather disposable scalpels | Andwin Scientific | EF7281C | |
Forskolin | Sigma | F6886 | |
German glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | NeuVitro | GG-12-oz | |
GFAP antibody | Aves | GFAP | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
Insulin | Invitrogen | 12585-014 | |
Magnetic separator stand – MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Magnetic separator-MiniMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
Millex PES 0.22µm filter unit | Millipore | SLG033RS | |
Mounting media- Prolong Gold with DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
N-acetyl-cysteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
Neurotrophin-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
NG2 antibody | Millipore | AB5320 | |
Papain | Worthington | LS003126 | |
PBS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | D5652 | |
PDGF | Peprotech | 100-13A | |
Petri dishes | Falcon | 351029 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
Progesterone | Sigma | P8783 | |
Putrescine | Sigma | P5780 | |
Selection column-LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
Sodium Selenite | Sigma | S5261 | |
Trace elements B | Corning | 25-000-CI | |
Triiodothyronine (T3) | Sigma | T6397 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Trypan Blue Solution | Corning | 25-900-CI | |
Tween 20 | Sigma | P1379 | |
B27NBMA | 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter sterilize and store at 4 °C until use. | ||
B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum | ||
CNTF solution stock (10 µg/ml; 1000X) | Order from Peprotech (450-50). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to Manufacturer’s instruction (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80 °C. Working solution (10 µg/ml, 1000X) 1. Make on 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 10µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80 °C. |
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d-Biotin stock solution (50 µg/ml; 5000X) | Resuspend d-Biotin (Sigma-B4639) in double-distilled H2O at 50 µg/ml (e.g. 2.5 mg in 50 ml of ddH2O). Resuspension might take fair amount of agitation/vortexing, or mild warming briefly at 37°C. If the d-Biotin still will not solubilize, it is fine to make up a less concentrated (e.g. 10µg/ml), and to add a higher volume to the B27NBMA (1/1000), instead of 1/5000). Store at 4°C. | ||
DNase I stock solution | 1. Dissolve at 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml in HBSS chilled on ice. 2. Filter sterilize on ice 3. Aliquot at 200 µl and freeze overnight at -20°C. 4. Store aliquots at -20 to -30°C. |
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Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (w/o Ca2+ and Mg2+) | Dissolve pouch in 1 Liter of water to yield 1 liter of medium at 9.6 grams of powder per liter of medium. Store at 2-8 °C. | ||
Forskolin stock solution (4.2 mg/ml; 1000X) | Add 1 ml of sterile DMSO to 50 mg Forskolin in bottle (Sigma-F6886) and pipette until resuspended. Transfer to a 15 ml centrifuge tube and add 11 ml of sterile DMSO to bring to 4.2 mg/ml. Aliquot (e.g. 20 µl) and store at -20°C. | ||
Hank’s balanced salts (HBSS) (Sigma | 1. Measure 900 ml of water (temperature 15-20 °C) in a cylinder and stir gently. 2. Add the power and stir until dissolved. 3. Rinse original package with a small amount of water to remove all traces of the powder. 4. Add to the solution in step 2. 5. Add 0.35 gr of sodium bicarbonate (7.5% w/v) for each liter of final volume. 6. Keep stirring until dissolved. 7. Adjust the pH of the buffer while stirring to 0.1-0.3 units below pH= 7.4 since it may rise during filtration. The use of 1N HCl or 1N NaOH is recommended to adjust the pH. 8. Add additional water to bring the final volume to 1L. 9. Sterilize by filtration using a membrane with a porosity of 0.22 microns. 10. Store at 2-8 °C. |
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Insulin stock solution (4000 µg/ml) | Thaw the bottle and aliquot 25 µl per microcentrifuge tube and store at -20°C. | ||
Laminin solution | Slowly thaw laminin in the cold (2°C to 8°C) to avoid gel formation. Then, aliquot into polypropylene tubes. Store at 5° C to -20° C in aliquots (e.g. 20 µl) and do not freeze/thaw repeatedly. Laminin may be stored at these temperatures for up to six months. | ||
Magnetic Cell Sorting (MCS) Buffer | Prepare the solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.2, and 0.5% bovine serum albumin (BSA), 0.5 mM EDTA, 5µg/ml Insulin, 1 g/L Glucose. Sterilize and degas by filtration the buffer by passing it through a 0.22 µm Millex filter. Store the buffer at 4°C until use | ||
N-Acetyl-L-cysteine (NAC) stock solution (5mg/ml; 1000X) | Dissolve N-Acetyl-L-cysteine (Sigma-A8199) at 5 mg/ml in DMEM (e.g. 50 mg NAC in 10 ml B27NBMA). Filter sterilize and aliquot (e.g. 20 µl). Store at -20°C. | ||
NT3 stock solution (1 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (450-03). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot), in buffer (e.g. DPBS + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1 µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
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PDGF stock solution (10 µg/ml; 1000X) | Master stock: Order from Peprotech (100-13A). Make up at 0.1 to 1 mg/ml according to manufacturer’s instructions (may vary from lot to lot) in buffer (e.g. DPBS) + 0.2% BSA). Store at -80°C. Working stock (1µg/ml; 1000X): 1. Make on 0.2% BSA in DPBS solution and filter sterilize. 2. Dilute master stock aliquot to 1µg/ml in sterile, chilled 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (e.g. 20µl/tube) and snap freeze in liquid nitrogen. 4. Store aliquots at -80°C. |
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Poly-D-lysine (1mg/ml; 100X) | Resuspend poly-D-lysine, molecular weight 70-150 kD (Sigma P6407) at 0.5mg/ml in 0.15M boric acid pH 8.4 (e.g. 50mg in 50ml borate buffer). Filter sterilize and aliquot (e.g. 100µl/tube). Store at -20°C. Prior to use, dilute the 100X stock (1mg/ml) to 50 µg/ml in sterile water. | ||
Oligodendrocyte proliferation media | see Supplementary Table 1 | ||
Oligodendrocyte differentiation media | see Supplementary Table 1 | ||
Sato supplement (100X) | see Supplementary Table 1 | ||
References: the list of reagents and recipes were adopted from the protocols previously described by Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) and Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012)) |