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Genetics

Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere

doi: 10.3791/57561 Published: May 2, 2018

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Amplikons Sequenzdaten von Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere mikrobiome zu erhalten. Diese Informationen kann verwendet werden, um die Zusammensetzung und Vielfalt der Anlage verbundenen mikrobieller Gemeinschaften zu untersuchen, und eignet sich für den Einsatz mit einer Vielzahl von Pflanzenarten.

Abstract

Die intime Interaktion zwischen Pflanze Host und dem damit verbundenen Mikroorganismen ist von entscheidender Bedeutung bei der Bestimmung der Pflanze Fitness und verbesserte Toleranz gegenüber abiotischem Stress und Krankheiten fördern kann. Als die Pflanze Microbiome hochkomplexe, Low Cost sein, werden Hochdurchsatz-Methoden wie Amplikons-basierte Sequenzierung der 16 s rRNA-gen oft bevorzugt zur Charakterisierung der mikrobiellen Zusammensetzung und Vielfalt. Allerdings ist die Auswahl der geeigneten Methodik bei der Durchführung von solchen Experimenten entscheidend zur Reduzierung von Verzerrungen, die die Analysen und Vergleiche zwischen Proben und Studien erschweren können. Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine standardisierte Methodik für die Erfassung und Extraktion von DNA aus Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben. Darüber hinaus wir markieren eine etablierte 16 s rRNA Amplikons Sequenzierung Pipeline, die für die Erforschung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften in diesen Proben erlaubt, und kann leicht für andere Markergene angepasst werden. Diese Pipeline wurde für eine Vielzahl von Pflanzenarten, darunter Sorghum, Mais, Weizen, Erdbeere und Agave, validiert und kann helfen, Probleme im Zusammenhang mit der Kontamination von pflanzlichen Organellen zu überwinden.

Introduction

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Pflanze-assoziierten mikrobiome bestehen aus dynamischen und komplexen mikrobieller Gemeinschaften bestehend aus Bakterien, Archaeen, Viren, Pilze und andere eukaryotischen Mikroorganismen. Neben ihrer gut untersuchte Rolle bei der Entstehung von Pflanzenkrankheiten können Anlage-assoziierten Mikroben auch Pflanzengesundheit positiv durch Verbesserung der Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress, Förderung der nährstoffverfügbarkeit und Pflanzenwachstum durch Verbesserung die Produktion von Phytohormonen. Aus diesem Grund besteht besonderes Interesse bei der Charakterisierung der Taxa, die Pflanze Wurzel Endospheres, rhizosphären und das umgebende Erdreich zugeordnet. Während einige Mikroben isoliert im Labor erzeugten Medien kultiviert werden können, viele nicht, zum Teil, weil sie auf Symbiotische Beziehungen mit anderen Mikroben berufen können, wachsen sehr langsam, oder erfordern Bedingungen, die in einer Testumgebung nicht repliziert werden können. Weil es die Notwendigkeit für den Anbau umgeht und relativ kostengünstig und hohem Durchsatz ist, Sequenz-basierte phylogenetische Profilierung der Umwelt- und Host-assoziierten mikrobielle Proben eine bevorzugte Methode für die Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft geworden Zusammensetzung.

Die Auswahl der geeigneten Sequenziertechnologien zur Verfügung gestellt von verschiedenen nächste Generation sequencing (NGS) Plattformen1 richtet sich auf die Bedürfnisse der Nutzer, mit wichtigen Faktoren wie: gewünschte Abdeckung, Amplifikate Länge erwartet Gemeinschaft Vielfalt sowie Sequenzierung Fehlerquote lesen-Länge und die Kosten-pro-Lauf/Megabase. Eine weitere Variable, die in Amplikons-basierte Sequenzierung Experimenten berücksichtigt werden muss ist welches gen verstärkt werden und welche Primer verwendet werden. Bei der Gestaltung oder der Wahl der Primer, sind Forscher oft gezwungen, Kompromisse zwischen der Universalität der Verstärkung und die taxonomische Auflösung aus der daraus resultierenden Amplifikate erreichbar machen. Aus diesem Grund wählte diese Arten von Studien oft Primer und Marker, die selektiv bestimmte Teilmengen der das Mikrobiom abzielen. Beurteilung der Zusammensetzung der bakteriellen Gemeinschaften geschieht häufig durch Sequenzierung eine oder mehrere der hypervariablen Regionen der bakteriellen 16 s rRNA gen2,3. In dieser Studie beschreiben wir eine Amplikons basierte Sequenzierung Protokoll entwickelt für eine NGS-Plattform dieser Ziele der 500 bp V3-V4 Region der bakteriellen 16 s rRNA-gen, ermöglicht eine breite Verstärkung der bakteriellen Taxa und gleichzeitig ausreichend Variabilität, unterscheiden Sie zwischen verschiedenen Taxa. Darüber hinaus kann dieses Protokoll problemlos für die Verwendung mit anderen Primer-Sets, wie die Ausrichtung auf die ITS2 Marker von Pilzen oder 18 s rRNA Untereinheit der Eukaryoten angepasst werden.

Während andere Ansätze wie Schrotflinte Metagenomik, Metatranscriptomics und einzellige Sequenzierung, andere Vorteile einschließlich gelöst mikrobieller Genome und mehr direkte Messung des Community-Funktion bieten, sind diese Techniken in der Regel mehr teuer und rechenintensiven als die phylogenetische Profilierung hier4beschrieben. Darüber hinaus sind durchführen Schrotflinte Metagenomik und Metatranscriptomics auf Wurzelproben ergibt sich einen großen Prozentsatz der Zugehörigkeit zu dem Host Pflanzengenom liest, und Methoden, um diese Einschränkung zu umgehen immer noch entwickelten5,6.

Wie bei jeder experimentelle Plattform kann Amplikons-basierten profiling eine Reihe von potenziellen Verzerrungen einführen, die bei der experimentellen Design und Daten-Analyse berücksichtigt werden sollten. Dazu gehören die Methoden der Probenentnahme, DNA-Extraktion, Auswahl der PCR Primer und wie Bibliothek Vorbereitung durchgeführt wird. Verschiedene Methoden können die nutzbare erzeugte Datenmenge erheblich beeinträchtigen und können auch behindern die Bemühungen, Ergebnisse von Studien zu vergleichen. Zum Beispiel die Methode zur Entfernung von Rhizosphäre Bakterium7 und die Verwendung von verschiedenen Fördertechniken oder Wahl der DNA Extraktion Kits8,9 haben gezeigt, dass erhebliche Auswirkungen nachgelagerte Analyse führt zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen in Bezug auf die Mikroben Gegenwart und ihrer relativen Häufigkeiten sind. Seit der Amplifikate basierende Profilerstellung angepasst werden kann, kann es schwierig sein, Vergleiche über Studien. Die Erde Microbiome Projekt hat vorgeschlagen, dass die Entwicklung eines standardisierten Protokolls als Mittel zur Minimierung der Variabilität, verursacht durch die Anwendung der Forscher komplexe Systeme wie die Pflanze-assoziierten Microbiome profitieren würden verschiedene Methoden zwischen Studien10,11. Hier diskutieren wir viele der oben genannten Themen und bieten Anregungen, best practices-wo angebracht.

Das Protokoll zeigt den Prozess der Erhebung Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben aus Sorghum bicolor und Extraktion von DNA mit Hilfe einer etablierten DNA-Isolierung Kit11. Darüber hinaus enthält unser Protokoll einen detaillierte Amplikons Sequenzierung Workflow, mit Hilfe einer häufig eingesetzten NGS-Plattform zur Bestimmung der Struktur der bakteriengemeinschaften12,13,14. Dieses Protokoll wurde für den Einsatz in einer Vielzahl von Pflanze-Hosts in einer kürzlich veröffentlichten Studie der Rhizosphäre, Wurzeln und verbundenen Böden 18 Monocot Arten einschließlich Sorghum bicolor, Zea Mays, und Triticum Aestivum15validiert. Diese Methode ist auch für die Verwendung mit anderen Markergene validiert worden, wie durch seine erfolgreiche Bewerbung zum Studium der Pilzen ITS2 Markergens in Studien der Agave Microbiome16,17 und Erdbeer Microbiome 18.

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Protocol

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1. Sammlung und Trennung von der Wurzel Endosphere, Rhizosphäre und Bodenproben

  1. Vor dem Betreten des Feldes, Autoklaven Reinstwasser (mindestens 90 mL Wasser pro Probe) zu sterilisieren. Bereiten Sie Epiphyten Entfernung Puffer (mindestens 25 mL pro Probe vor) durch Hinzufügen von 6,75 g KH2PO4, 8,75 g K2HPO4und Triton x-100, 1 mL bis 1 L steriles Wasser. Sterilisieren Sie den Puffer mit einem Vakuum-Filter mit 0,2 µm Porengröße.
    1. Für Schritte 1.2 bis 1.5 saubere Handschuhe sterilisiert mit Ethanol zu allen Zeiten und ersetzen die Handschuhe zwischen jeder Probe um Kontaminationen zu vermeiden. Sterilisieren Sie alle Geräte mit 70 % Ethanol zu und wischen Sie alle Geräte zwischen Proben. Bestimmen Sie vor der Probenahme die optimale Sampling-Tiefe für den Test, und entsprechen allen Boden- und Wurzel Sammlungen.
  2. Um lose Bodenproben zu sammeln, verwenden einen Ethanol-sterilisierte Erde Kern Sammler Boden zu erhalten, die frei von Pflanzenwurzeln ist durch das Sammeln von einem Kern etwa 23 bis 30 cm von der Basis der Pflanze.
  3. Übertragen Sie den Boden auf eine Plastiktüte, Homogenisieren des Bodens durch sanftes schütteln und übertragen ein Aliquot der Bodenprobe (etwa 600 mg), eine 2 mL-Tube zu füllen. Stellen Sie sofort die 2 mL-Tube auf Trockeneis oder Blitz einfrieren das Rohr in Flüssigkeit N2 bis bereit zum Fortsetzen der DNA-Extraktion (Schritt 2).
    1. In einigen Umgebungen kann das umgebende Erdreich Pflanzenmaterial enthalten. In diesem Fall verwenden Sie ein sterilisierte 2 mm Sieb, um die Pflanzenreste aus dem Boden vor dem einsetzen es in die Plastiktüte zu trennen.
  4. Um die Wurzel und der Rhizosphäre sammeln, verwenden Sie eine Ethanol sterilisiert Schaufel zu um Graben, bis die Pflanze kümmert sich um so viel von der Wurzel wie möglich zu erhalten. Tiefe ist abhängig von der Pflanze. Während kleine Pflanzen wie Weizen durch graben einige Zentimeter entfernt werden können, erfordern größere Pflanzen wie Sorghum 30 cm oder mehr. Schütteln Sie sanft überschüssige Erde von den Wurzeln bis ca. 2 mm des Bodens an der wurzeloberfläche ist.
    Hinweis: Achten Sie darauf, beim Arbeiten mit kleinen Pflanzen mit empfindlichen Wurzeln oder in trockenen, hohen Ton Inhalt Böden. Im Idealfall sollte nur eine dünne Schicht des Bodens, die noch auf die Wurzeln nach dem schütteln. Wenn große Aggregate des Bodens bleiben, kann ein Gummihammer, den Boden zu verdrängen, indem Sie sanft auf der Basis des Sprosses verwendet werden. Wenn der Betrag des Bodens bleibt nach diesem Prozess überschreitet oder 2 mm hinter dem zurückbleibt, ist die ungefähre Dicke anzumerken.
  5. Verwenden Sie für große Anlagen sterile Schere und/oder Scheren, schneiden Sie einen repräsentativen Teilbereich der Wurzeln und ein Minimum von 500 mg Wurzel Gewebe in ein 50 mL konische Fläschchen. Legen Sie für kleinere Gräser das gesamte Wurzelsystem in das Fläschchen. Fügen Sie genügend Epiphyten Entfernung Puffer, um die Wurzeln zu decken, dann legen Sie die Probe sofort auf Trockeneis oder Blitz Einfrieren der Probe in Flüssigkeit N2.
    Hinweis: Achten Sie darauf nicht die 50 mL konische Durchstechflasche Überfüllsicherung wie Waschen Schritt erschweren wird. Es sollte genug Leerraum so sein, dass der Epiphyten-Puffer in der Lage ist, nach unten fließen, umgibt die Wurzeln in das Fläschchen und decken Sie die Spitze. Da einige Gräser mehr Wurzel Biomasse haben als in ein 50 mL konische Fläschchen passen, sollten ein Unterabschnitt der Wurzeln gesammelt werden. Allerdings ist anzumerken, dass Schneiden der Wurzeln endophytische Bakterien in der Rhizosphäre Bruch ausgewaschen werden könnte, also Wurzeln brechen sollte minimiert werden. Wenn die Proben nicht unmittelbar nach seiner Rückkehr nach Labor verarbeitet werden, können sie bei-80 ° c gelagert werden
  6. Um die Rhizosphäre von den Wurzeln zu trennen, die Wurzel-Probe auf dem Eis Auftauen, dann beschallen die Wurzelproben bei 4 ° C für 10 min mit Pulsen von 160 W für 30 s, getrennt durch 30 S. Übertragung der Wurzeln in einem gekühlt (4 ° C), 50 mL-Tube mit steriler Pinzette zu reinigen. Bewahren Sie den original Schlauch mit Puffer und des Bodens, die die Rhizosphäre Bruchteil (Abbildung 1).
  7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen mit Puffer und Rhizosphäre für 10 min bei 4 ° C, 4.000 x g. Dekantieren des Überstandes flash Einfrieren das Röhrchen mit der Rhizosphäre Bruch in Flüssigkeit N2und speichern den Rhizosphäre Bruch bei-80 ° C bis bereit zum Fortsetzen der DNA Extraktion (Schritt 2).
  8. Fügen Sie ca. 20 mL steriles Wasser gekühlt (4 ° C hinzu) um die Wurzeln zu waschen, die Wurzel Bruchteil. Waschen Sie die Wurzel durch Schütteln energisch (per Hand oder Mixer für 15-30 s), und dann lassen Sie das Wasser ab.
  9. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens zweimal, bis keine Erde auf der wurzeloberfläche bleibt. Wenn die DNA-Extraktion (Schritt 2) nicht sofort ausgeführt wird, die Wurzeln in sterile Alufolie wickeln, Blitz Einfrieren der Wurzeln in Flüssigkeit N2und laden die Proben bei-80 ° C bis bereit zum Fortsetzen der DNA-Extraktion.

(2) DNA-Extraktion

Hinweis: In Schritt 2 und 3, saubere Handschuhe sterilisiert mit Ethanol sollte getragen werden, zu allen Zeiten und alle Arbeiten durchgeführt werden, auf einer Oberfläche mit Ethanol sterilisiert.

  1. Die Boden- und Rhizosphäre Proben extrahieren Sie DNA.
    1. Verwendung eines sterilen Spatel schnell 250 mg des Bodens und der Rhizosphäre von Schritte 1,3 und 1,7 in getrennten Röhren übertragen in den kommerziellen DNA-Isolierung-Kit zur Verfügung gestellt zur Extraktion aus dem Boden, dann fahren Sie mit DNA-Isolierung mit dem Ausrüster Protokoll.
    2. Nach eluierenden DNA in der Elution Puffer durch die DNA-Isolierung-Kit, speichern die DNA bei-20 ° C bis bereit zu fahren Sie mit Schritt 3 fort.
  2. Die Wurzelproben extrahieren Sie DNA.
    1. Chill, einem sterilisierten Mörser und Stößel mit Flüssigkeit N2. 600 bis 700 mg Wurzel Gewebe Messen Sie ab und legen Sie das Gewebe in den Mörtel. Fügen Sie sorgfältig, genug Flüssigkeit N2 um die Wurzeln zu decken.
    2. Schleifen Sie die Wurzeln in kleine Stücke. Fahren Sie fort, Hinzufügen von Flüssigkeit N2 und Schleifen (mindestens zwei Mal zwischen Proben konsequent sein), bis die Wurzeln ein feines Pulver sind. Sicherstellen Sie, dass das Gewebe der Wurzel während dieses Schrittes nicht Auftauen.
      Achtung: Verwenden Sie geeignetsten persönlichen Schutzausrüstung (Laborkittel, Schutzbrille und Kryo-Handschuhe) beim Arbeiten mit Flüssigkeit N2.
      Hinweis: Für eine minderwertige DNA-Extraktion, kann es vorteilhaft sein, überschüssige Wurzeln zu Pulver zermahlen und das Pulver bei-80 ° c Lagern
    3. Schnell, vor der Wurzel beginnt Pulver zu tauen, übertragen die Wurzel-Pulver in vorgewogene 1,5 mL Röhrchen auf Eis mit einem sterilen Spatel. Nehmen Sie das Gewicht des Rohres und Pulver. In der Regel ist die 300-400 mg Pulver übertragen.
    4. Verwendung eines sterilen Spatel übertragen schnell 150 mg Wurzelpulver auf dem Sammelrohr in den kommerziellen DNA-Isolierung-Kit zur Verfügung gestellt für die Extraktion aus dem Boden ausgelegt, dann gehen mit DNA-Isolierung mit dem Ausrüster-Protokoll.
      Hinweis: Für einige Wurzelproben, es kann eine hohe Konzentration organischer Stoffe noch in das DNA-Pellet, die die Amplifikation der DNA während der PCR, vor allem, wenn ein anderes DNA-Extraktion-Protokoll verhindert (zB., CTAB Extraktion) dient. Reinigen Sie gegebenenfalls die DNA anhand der Anweisungen im ökologischen DNA-Aufräum Kit enthalten.
  3. Messen Sie die Konzentration aller DNA-Proben mit einem hochempfindlichen Benchtop-Fluorometer.
    1. Fügen Sie 1-20 µL jeder eluierten DNA-Probe in Röhren im DsDNA hochempfindlichen Assay Kit enthalten. Fluorometer funktionierende Lösung (1: 200 Farbstoff: Puffer) bis zu 200 µL hinzufügen.
    2. Bereiten Sie zwei zusätzliche Röhrchen mit 10 µL DNA standard 1 (0 ng/µL DNA) oder 10 µL standard 2 (100 ng/µL), und jede Norm fügen Sie 190 µL Arbeitslösung Fluorometer hinzu.
    3. Messen Sie die Konzentration des Standards und jede Probe. Wenn es nicht automatisch geschieht, berechnen Sie die DNA-Konzentration aus der Extinktion Ausgabe durch eine lineare Regression der beiden Standards.

(3) Amplikons Bibliothek Vorbereitung und Einreichung

  1. Materialien für die Amplifikation Reaktion eingerichtet.
    1. Tauen Sie DNA-Proben bei 4 ° C auf und halten sie auf dem Eis in Schritt 3. Zufällige Reihenfolge der DNA-Proben zu minimieren Verzerrungen aufgrund der Lage auf die PCR-Platte (Tabelle 2).
    2. Verdünnen Sie in einer 96-Well-PCR-Platte DNA von jeder Probe in molekularen Grade Wasser bis 5 ng/µL in einem Gesamtvolumen von 20 µL. Fügen Sie 20 µL des molekularen Grade Wasser in die vier Ecken Vertiefungen als Negativkontrollen für Verstärkung (leere) (Tabelle 2).
    3. Ordnen Sie die Barcode-Primer (10 µM) in PCR-Streifen Röhren oder einer 96-Well-Platte, so dass sie mit einem Multi-Kanal-Pipette (Abbildung 2) hinzugefügt werden können.
    4. Bereiten Sie genügenden PCR-master-Mix, jede DNA-Probe in dreifacher Ausfertigung zu verstärken. Bereiten Sie 1,5 µL der BSA (20 mg/mL), 37,5 µL vorgefertigte 2 x master-Mix (bestehend aus PCR-Puffer, MgCl2, dNTPs und Taq -DNA-Polymerase), 0,57 µL der Chloroplasten PNA (100 µM), 0,57 µL der mitochondrialen PNA (100 µM), und 25.86 µL Molekulare Grade Wasser.
    5. Gießen Sie den master-Mix in einem sterilen 25 mL Mehrkanal-Pipette Reservoir und verteilen Sie 66 µL des master-Mix in jede Vertiefung eine neue 96-Well-PCR-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette zu.
      Hinweis: Bei der Berechnung der Reagenz Bände für den master-Mix stellen Sie sicher, dass auch die 4 leere Brunnen pro Platte.
    6. Fügen Sie mithilfe einer Multi-Kanal-Pipette 6 µL 5 ng/µL DNA (von der normalisierten DNA-Platte) auf den master-Mix-Teller. Fügen Sie auf der master Platte 1,5 µL 10 µM vorwärts Grundierung, derart, daß jede Spalte hat, einem anderen vorwärts Barcode und 1,5 µL 10 µM Grundierung rückgängig zu machen, so dass jede Zeile einen anderen reverse Barcode (Abbildung 2).
      Hinweis: Vor dem Hinzufügen von Grundierungen, die randomisierte Platten und master-Mix ließe sich die ITS oder ITS2 Pilz Gene zu verstärken, wenn verschiedene Primer hinzugefügt wurden. Wenn dies der Fall ist, kann ein ähnliche besser gekleideteres Design verwendet werden.
    7. Spin-down die Platte kurz auf 3.000 x g. verwenden eine Multi-Kanal-Pipette vorsichtig mischen, dann teilen Sie in drei Platten mit 25 µL des Reaktionsgemisches.
      Hinweis: Obwohl drei Wiederholungen nicht unbedingt notwendig sind, verringert es die Auswirkungen der technischen Variabilität.
  2. Verstärken die DNA in jeder Platte mit einem Thermocycler legen Sie mit den nachfolgenden Bedingungen: 180 s bei 98 ° C, 30 Zyklen: 98 ° C für 45 s (Denaturierung), 78 ° C für 10 s (PNA glühen), 55 ° C für 60 s (Primer annealing) und 72 ° C für 90 s (Erweiterung) , dann 600 s bei 72 ° C, gefolgt von einer 4 ° C halten Schritt. Nach der Verstärkung bündeln Sie die drei replizieren Platten in einem einzigen 96-Well-Platte.
  3. Quantifizieren Sie die DNA mit Hilfe hoher Empfindlichkeit Fluorometer Reagenzien in einem 96-Well-Platte-Reader.
    1. Fügen Sie 2 µL des PCR Produktes zu einer 96-Well-Mikrotestplatte zusammen mit 98 µL Arbeitslösung Fluorometer (Farbstoff: Puffer 1: 200). 4 Brunnen als Standards gehören: 5 µL DNA standard 1 (0 ng/µL DNA), 1 µL standard 2 (10 ng/µL), 2 µL standard 2 (20 ng/µL) und 5 µL standard 2 (50 ng/µL). Dann fügen Sie Fluorometer funktionierende Lösung für ein Endvolumen von 100 µL.
      Hinweis: Jede Probe ist messbar mit einem Benchtop-Fluorometer, wie im Schritt 2.3 beschrieben, wenn ein Platte Leser nicht verfügbar ist.
    2. Berechnen Sie die DNA-Konzentration aus der Extinktion Ausgabe durch eine lineare Regression der vier Standards.
    3. Für die erfolgreich verstärkte Barcode Produkten (diejenigen, die eine größer als 15 ng/µL Konzentration), pool 100 ng jeder Probe in ein einzelnes 1,5 mL Röhrchen (Tabelle 2).
    4. Berechnen Sie die durchschnittliche Lautstärke von Proben, die dem Pool mithilfe der =AVERAGE()-Funktion in einem Tabellenkalkulationsprogramm hinzugefügt. Die gepoolten Proben das Volumen der "leere" PCR-Produkte hinzufügen.
      Hinweis: Da die "leere" PCR-Produkte ihre eigenen eindeutigen Barcode-Kombinationen haben, können sie sequenziert um Verunreinigungen Labor überprüfen.
  4. Messen der Konzentration der gepoolten Ware mit einem Benchtop-Fluorometer, wie in Schritt 2.3 und nehmen 600 ng DNA beschrieben und im molekularen Grade Wasser zu einem Endvolumen von 100 µL in einem 1,5 mL Röhrchen verdünnen. Bewahren Sie die restlichen gepoolte Produkt bei-20 ° C.
  5. Waschen Sie die 600 ng DNA aliquoten durch Anschluss an die etablierten PCR Reinigungsprozess mit paramagnetischen Reinigung Perlen in einem 96-Well-Format mit ein paar Ausnahmen.
    1. Machen Sie einen frischen 600 µL aliquoten von 70 % Ethanol. Schütteln Sie die Flasche des magnetischen Beads, Perlen wieder auszusetzen, die nach unten zu begleichen.
    2. Die 600 ng aliquoten DNA 1 X Volumen (100 µL) der Perle Lösung hinzufügen. Mischen Sie durch pipettieren 10 mal gründlich. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    3. Legen Sie das Rohr auf dem magnetischen Ständer für 2 min (oder bis die Lösung klar ist), Perlen von Lösung zu trennen. Während das Rohr noch in die Magnetstativ, Aspirieren des klare Überstands vorsichtig ohne Berührung der magnetischen Beads, und den klare überstand verwerfen.
      Hinweis: an dieser Stelle sind die Amplifikate Produkte an die magnetische Beads gebunden. Alle Perlen, die gestört oder verloren während der Aspiration sind führt zu einem Verlust der DNA.
    4. Lassen Sie das Rohr in die Magnetstativ und das Rohr 300 µL 70 % Ethanol hinzu; 30 S. Aspirat aus Ethanol und verwerfen bei Raumtemperatur inkubieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, und entfernen Sie alle Ethanol nach der zweiten Wäsche. Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ, und an der Luft trocknen für 5 Minuten.
    5. Die getrockneten Perlen 30 µL Molekulare Grade Wasser hinzu und mischen Sie, indem Sie 10 mal pipettieren. Inkubation bei Raumtemperatur für 2 min. Rückkehr das Rohr in die Magnetstativ für 1 min um die Perlen von Lösung zu trennen. Übertragen Sie das Eluat auf einen neuen Schlauch.
      Hinweis: Magnetische Beads werden nachgeschaltete Reaktionen nicht beeinträchtigen.
  6. Messen Sie die Endkonzentration von gereinigt, gepoolte DNA mit Hilfe einer Benchtop-Fluorometer, wie unter Punkt 2.3 beschrieben. Verdünnen Sie eine Aliquote bis 10 nM in einem Endvolumen von 30 µL oder zur Konzentration und Volumen durch die Sequenzierung Anlage bevorzugt.
  7. Nutzen Sie die Dienste einer Einrichtung der Sequenzierung die DNA auf einer Plattform NGS, 2 x 300 bp gepaart-End Sequenzierung sequenziert.

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Representative Results

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Durchführung der empfohlenen Protokoll sollte in einem Dataset indizierten gepaart Ende liest, die zurück zu jeder Probe angepasst und entweder eine bakterielle zugewiesen werden können führen operative taxonomischen Einheiten (OTU) oder genaue Reihenfolge Variante (ESV, auch bezeichnet als Amplifikate Sequenz-Variante (ASV) und ineffektiv taxonomischen Einheit (sOTU)), abhängig von nachgelagerten Analyse. Um qualitativ hochwertige Daten zu erhalten, muss darauf geachtet werden, bei jedem Schritt Konsistenz zwischen Proben und die Einführung von jeder potenzielle Verzerrung bei der Probenaufbereitung oder Bibliothek Vorbereitung minimieren. Nach der Erhebung erscheint Verarbeitung und Extrahieren von DNA aus Proben (Schritte 1 und 2), das daraus resultierende Eluat klar und frei von organischen Stoffen, die Verstärkung hemmen würde. Während Reinheit überprüft werden kann, durch jede DNA-Probe über eine Microvolume Spektralphotometer Messen, haben wir festgestellt, dass der Boden DNA-Extraktion Kit zuverlässig alle Verunreinigungen entfernt. Aufgrund der vorhersehbaren DNA-Qualität sind Quantifizierungsmethoden, die auf Fluoreszenz basierende Farbstoffe, die spezifisch DNA binden besser geeignet sind als solche auf Basis von UV-Absorption-19,-20,-21. Vor der PCR-Amplifikation durchschnittlich Boden-und Rhizosphäre ca. 10 ng/µL DNA, während Wurzelproben in der Regel eine mittlere Konzentration von etwa 30 ng/µL (Tabelle 2 haben).

Im Anschluss an die Verstärkung der Umwelt DNA (Schritt 3), Erfolg oder Misserfolg kann durch Messung der Konzentration des PCR Produktes über Benchtop Fluorometer Reagenzien auf ein Lesegerät, Platte, falls vorhanden, bestimmt werden oder manuell (Tabelle 2). Nach unserer Erfahrung liefern erfolgreiche Vergrößerungen, die qualitativ hochwertige Amplikons Daten führen größer als 15 ng/µL-PCR-Produkte. Wenn mehrere Fehler auftreten auf einer Platte, kann die positionelle Anordnung innerhalb der Anlage und Probentyp gescheiterten Proben helfen das Problem zu ermitteln. Wenn sie alles auf dem Teller angrenzen, kann dies zum Beispiel Pipette Fehler hinweisen, während wenn sie alle in der gleichen Zeile oder Spalte sind, könnte es Probleme mit einer spezifischen Primer empfehlen. Wenn sie alle in der gleichen Probentyp gehören, könnte es Probleme mit der Probenverarbeitung oder DNA-Extraktion vorschlagen.

Es ist wichtig, überprüfen die Kompatibilität der universellen PNAs mit Ihren spezifischen Anlage System Bioinformatically während experimentelles Design, um sicherzustellen, dass sie Verstärkung von Chloroplasten und Mitochondrien 16 s Gene blockieren. Nach der Verstärkung Schritt, es ist nicht klar, ob die PNAs erfolgreich zu mitochondrialen gebunden und Chloroplasten Vorlagen; Dies geht nur hervor, nach der Sequenzierung (Abbildung 3). Um sicherzustellen, dass die PNAs effektiv Verunreinigung Verstärkung, eine Angleichung der PNA-Sequenz zu jedem Chloroplasten und Mitochondrien 16 s rRNA-gen blockieren werden (möglicherweise gibt es mehrere Kopien) für das Werk sollte Host untersucht keine Diskrepanzen aufdecken. . Sogar ein einzelnes Missverhältnis zur 13 bp PNA Sequenz, besonders in der Mitte der PNA-Klemme, kann die Effektivität, wie der Fall der bereitgestellten Chloroplasten-PNA-Sequenz und die Chloroplasten 16 s rRNA-gen von Lactuca Sativa (Kopfsalat) ( drastisch reduziert. Abbildung 3).

Da die gleiche Menge amplifizierten DNA pro Probe, es gebündelt ist eine etwa auch Anzahl der Lesevorgänge pro Probe erhalten werden sollte, nach der Sequenzierung und Sortierung basierend auf ihren Barcode-Index (Abbildung 4) liest. Der Großteil dieser liest sollte auf bakterielle Taxa übereinstimmen. Alle eukaryotischen, Mitochondrien, oder Chloroplasten Spiele sollten entsorgt werden. Je nach Analyse Pipeline und taxonomische Datenbank gewählt, Chloroplasten und Mitochondrien liest können fälschlicherweise zugeordnet werden bakterielle Linien, oft Cyanobakterien und Rickesttia, bzw. (Abbildung 3). Eine gewisse manuelle Kuration ist oft ratsam, auf diesen gemeinsamen MIS Zuordnungen überprüft. Spezifische Details hängt die Wahl der Analyse, sondern relative Häufigkeit Profile sollten in der Regel ähnlich sein (kein signifikanter Unterschied) unter biologischer Replikate und signifikant zwischen Boden, Rhizosphäre und Wurzelproben (Abbildung 5 ). Es ist wichtig, Beachten jedoch, dass es gibt zwar keinen signifikanten Unterschied zwischen biologischer Replikate, es wichtig ist, mindestens drei Wiederholungen pro sammeln.

Methoden für die Interpretation der in diesen Experimenten gewonnenen Daten sind unter mikrobiellen Ökologen kontrovers diskutiert. Bis vor kurzem wurde Amplikons Sequenzanalyse Gruppierung liest in OTUs abhängig. Diese sind jedoch problematisch weil: 1) basieren auf einem etwas willkürlich Schwellenwert von 97 % Ähnlichkeit, 2) Vielfalt wird oft unterschätzt, und (3) Es kann niedriger taxonomischer Auflösung. Vor kurzem sind entwickelten Tools wie DADA2, Deblur und UNOISE222,23,24 liest in ESV, das löst einige Probleme bei der Verwendung von OTUs zu sortieren. Vorsichtsmaßnahmen zur Verwendung von ESV gehören: (1) künstliche Erhöhungen der Vielfalt aufgrund der unterschiedlichen rRNA Kopien innerhalb einer Spezies, und (2) erhöhte Empfindlichkeit, PCR und Sequenzierung Fehler25,26.

Figure 1
Abbildung 1: Trennung von Root und Rhizosphäre Brüche. Flussdiagramm zeigt die Schritte für die Trennung der Rhizosphäre Wurzelproben, gefolgt vom Waschen Sie der Wurzeln mit sterilem Wasser, alle restlichen Rhizoplane Organismen zu entfernen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Beispiel für Lager Grundierung Layout zur Verstärkung und Verteilung in Platten. Lager Primer (Tabelle 1) können in Streifen Röhren für optimale Verteilung in 96-Well Platten (jeder Streifen von Primern ist durch eine andere Farbe dargestellt; lila für forward Primer 1-8, Orange für forward Primer 9-16, blau für reverse Primer 1-12 vorbereitet werden und grün für reverse Primer 13-16.) In diesem Fall können 16 vorwärts- und 16 rückwärts Primer effizient mit einer Multi-Kanal-Pipette verteilt werden, so dass jeder auch eine eindeutigen Barcode-Kombination hat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Ergebnisse, die vorschlagen, Chloroplasten PNA ist unwirksam. Repräsentatives Ergebnis von Rhizosphäre ("Rhizo"), Wurzel und Bodenproben aus Kopfsalat, die (VT) mit biologischen Bodenverbesserer behandelten oder unbehandelten (NT) wurden. Die PNA-Sequenz verwendet, um Chloroplasten Kontamination der meisten Pflanzen blockieren ist GGCTCAACCCTGGACAG27. Salat enthält jedoch eine Diskrepanz in den Chloroplasten 16 s ribosomaler RNA-gen (GGCTCAACTCTGGACAG). Dadurch wird die PNA unwirksam, wodurch eine hohe relative Häufigkeit der Lesevorgänge, die an Cyanobakterien in Rhizosphäre und Wurzel Proben entsprechen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Verteilung der gelesenen zählt zu Proben in einer Bibliothek. Balkendiagramm zeigt Anzahl der lesen zählt (y-Achse) von verschiedenen Proben (Bars, x-Achse) einher, die Barcode-Kombination in der Readme. Die Anzahl der Lesevorgänge pro Probe kann variieren basierend auf wie viele Proben in der Bibliothek befinden; Dieser Teil wurde in einer Bibliothek von 192 Proben sequenziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Relative Häufigkeit der Top 12 Klassen in Root, Rhizosphäre und Boden Gemeinschaften. Gestapeltes Balkendiagramm zeigt die relative Häufigkeit der Klassen anwesend in einem Vertreter 16 s-Dataset enthält 6 Wiederholungen für jede Probe (Bulk Boden, Rhizosphäre und Wurzel Endosphere). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Primer zur Verstärkung der V3-V4-Region von der 16 s rRNA-gen. Grundierungen bestehen aus, gegenüber dem Vorquartal: ein Adapter für eine gemeinsame Plattform der NGS, einen eindeutigen Barcode, die Grundierung für NGS ein Spacer Region mit variabler Länge, den Rahmen für die Sequenzierung und eine universelle PCR-Primer, die entweder 341F oder 785R der 16 s rRNA-gen verstärkt zu verlagern. Die Anzahl der Primer benötigt ist abhängig, wie viele Proben pro Bibliothek sequenziert werden; eine Kombination aus 16 vorwärts- und 16 rückwärts Primer ist ausreichend für 244 Proben (256 Grundierung Kombinationen mit 12 verwendet für leere Brunnen während der PCR (Abbildung 2)). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Tabelle 2: Normalisierung der randomisierten DNA Proben vor und nach Amplifikation. Beispielarbeitsblatt Proben in einer randomisierten Reihenfolge auflisten und Angabe ihrer Lage auf eine einzelne 96-Well-Platte, die bestimmt auch die Grundierung Kombination zugewiesen. Formeln in der untersten Zeile beschreiben Berechnungen für das Hinzufügen von 100 ng jeder Probe die normalisierten Platte plus das Volumen des Wassers um 20 µL zu erreichen. Anschluss an Verstärkung, das Volumen von 100 ng jeder erfolgreichen Produkts berechnet und eine endgültige Pool hinzugefügt. Das Volumen der "leere" PCR-Produkt der letzten Pool hinzufügen ist der Durchschnitt der anderen Proben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Ergänzende Abbildung1: Angleichung der minimalen Wurzel Biomasse während der Entnahme von Proben. Beim Sammeln von Wurzeln, versuchen, mindestens 500 mg des Gewebes zu sammeln. Hier Wurzeln gesammelt von einer jungen Sorghum-Pflanze (Links, in den beiden A und B) und eine junge Reispflanze (rechts) neben (A) und innen (B) 50 mL konische Röhrchen dargestellt. Beide Proben wiegen ca. 1 g, es ist jedoch wichtig zu beachten, dass dieses Gewicht Rhizosphäre und Wurzel umfasst und die Rhizosphäre Gewicht in diesem Fall etwa die Hälfte das Gesamtgewicht ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

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Dieses Protokoll zeigt eine etablierte Pipeline Wurzel Endosphere, Rhizosphäre und Boden mikrobiellen Gemeinschaft Kompositionen aus Bereich Probenahme, Probenaufbereitung und nachgelagerte Sequenzierung zu erkunden. Studium Wurzel-assoziierten mikrobiome präsentiert einzigartige Herausforderungen aufgrund teilweise die Schwierigkeiten bei der Probenahme aus dem Boden. Böden sind sehr variabel in Bezug auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften und unterschiedlichen Bodenverhältnissen können von nur wenigen Millimetern28,29getrennt werden. Dies führt zu der Proben, die von benachbarten Meßstellen mit deutlich unterschiedlichen mikrobiellen Gemeinschaft Kompositionen und Aktivitäten30,31gesammelt werden. So verwenden Boden Kern Sammler und Schaufeln um zu pflegen, dass konsequente Probenahme tiefen und Homogenisierung vor DNA-Extraktion für die Reproduzierbarkeit innerhalb Wurzel Microbiome Studien unverzichtbar sind. Es ist auch wichtig, effizient die Rhizosphäre und Wurzel-Fraktionen zu trennen; mit einer harten Methode der Wurzel Oberfläche Sterilisation kann potenziell lyse Endophyten in Wurzeln vor DNA-Extraktion, während eine konservativere waschen nicht alle Mikroben von der Wurzel Oberfläche7entfernen kann. Ein weiterer wichtiger Faktor, der negativ beeinflussen oder stören Sequenzierung Ergebnisse ist bakterielle Kontamination, die kann aus vielen Quellen stammen und ist manchmal unmöglich zu unterscheiden, die Stichprobe umweltbakterien32,33. Aus diesem Grund vorsichtig Sterilisation der Probenahme Werkzeuge, experimentelle Materialien und Arbeitsumgebungen sind unerlässlich, um Verunreinigungen zu vermeiden.

Nach der Probenahme ist die Beschaffung hochwertiger DNA für erfolgreiche nachgeschalteten Analysen einen hohen Stellenwert. Nach unserer Erfahrung DNA-Extraktion aus Feld gewachsen Wurzelproben durch alternative Methoden, wie z. B. durch CTAB-basierte Extraktion, enthalten oft wesentlich größere Mengen an Huminsäuren und andere Verbindungen im Vergleich zu Rhizosphäre und Bodenproben. Diese Verbindungen können die enzymatische Aktivität der DNA-Polymerase während PCR Verstärkung, auch bei geringen Konzentrationen34,35verhindern. Mit DNA-Extraktion Kits konzipiert für Böden an Wurzelproben, im Gegensatz zu einer CTAB-Extraktion, gefolgt von einem Phenol chloroform Aufräumen, können effektiv befreien Proben von Huminsäuren und führt zu qualitativ hochwertige DNA-36,37, 38,39. Daher empfehlen wir, mit den im Handel erhältlichen DNA-Extraktion Kit für Wurzelproben sowie. Es sei darauf hingewiesen, dass das Ziel, mikrobielle genomischen DNA von Pflanzenwurzeln zu erhalten. Daher ist es wichtig zu brechen das Pflanzengewebe und lösen Sie die mikrobiellen Zellen zum mikrobiellen DNA lösen ohne Vorspannung zwischen Proben aufgrund der Variation in Schleifen, Druck und Zeit, gründliche und konsequente Wurzel zu Schleifen.

Nach sorgfältiger Extraktion von DNA aus Proben, gibt es zwei Hauptquellen für Probleme während der Verstärkung: 1) die Kontamination von Pflanzengewebe mit Pflanze Endosymbionts (Chloroplasten und Mitochondrien) und (2) Auswahl der 16 s rRNA Region zu verstärken. Die Verstärkung von Chloroplasten und Mitochondrien 16 s rRNA-Sequenzen können generieren > 80 % der Sequenzen in Wurzel Proben40und mehr im Blatt Gewebe, aber die Höhe der Kontamination ist abhängig von der Wahl der Primer. So sind PNA Klemmen notwendig während der PCR Schritt Pflanze Host Chloroplasten und Mitochondrien 16 Verunreinigungen27,41zu unterdrücken. Verschiedene Pflanzenarten haben jedoch die Variation in den Chloroplasten und Mitochondrien 16 s Reihenfolge27; Daher ist es wichtig, die Reihenfolge der die Chloroplasten und Mitochondrien 16 s Gene der Pflanze untersucht vor der Bibliothek Sequenzierung, um festzustellen, ob alternative PNA Oligos benötigt werden (Abbildung 3) bestätigen. Darüber hinaus besteht der 16 s rRNA-gen aus neun hypervariablen Regionen flankiert von neun konservativen Regionen; unterschiedliche Ergebnisse können aus der gleichen Gemeinde, je nachdem, welche hypervariablen Region verstärkte42ist. Frühere Studien haben herausgefunden, dass die V4-Region zu einem der zuverlässigsten für die Zuweisung von Taxonomie43 und es für andere umfangreiche Microbiome Umfragen11verwendet worden ist. Verlängerung des Ziels für die V3-V4-Region wird hier vorgeschlagen, um Variabilität zu erhöhen und taxonomische Auflösung verbessert.

In diesem Protokoll haben wir eine Pipeline zum Ausführen der 16 s rRNA Amplikons Sequenzierung über nächste Generation Sequencing (NGS) für das Studium der mikrobiellen Gemeinschaft Kompositionen von Umweltproben12gezeigt. Wir empfehlen Amplikons Sequenzierung als Werkzeug für die phylogenetische Profilierung, denn es relativ preiswert und hohem Durchsatz ist und keine erfordert umfangreiche rechnerische Kompetenzen oder Ressourcen zu analysieren. Während unsere Methode konzentriert sich auf die Analyse des bakteriellen Bruchteil das Mikrobiom, kann es leicht angepasst werden, um Pilze zu untersuchen. Das Protokoll ist durch Schritt 2 identisch, und der einzige Unterschied in Schritt 3 ist welche Grundierungen während der Verstärkung verwendet werden würde. Allerdings ist es nichts Wert, dass Amplikons basierten profiling nicht ohne Einschränkungen. Durch Sequenzierung ein einziges Markergen, erhält keine Informationen über die Funktionsfähigkeit der Gemeinschaft. Darüber hinaus kann die taxonomische Auflösung ziemlich niedrig sein, besonders wenn von Umgebungen mit einem hohen Anteil des fußgelenkes Mikroben Sequenzierung. Jedoch Sequenziertechnologien sind rasant und wir erwarten das Potenzial, einige dieser Mängel zu lösen durch eine Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit anderen Plattformen Sequenzierung. Schließlich, wie in der Einleitung erwähnt, Schrotflinte Metagenomik und Metatranscriptomics können leicht durchgeführt werden auf Boden-und Rhizosphäre und Methoden zur Pflanze Kontamination von Pflanzengewebe eliminieren werden derzeit erforscht. Experimentellen Designs welche paar Amplikons-basierte Ansätze und andere metagenomische Techniken besonders wirksam bei komplexen Gemeinschaften kann wo hohe Artenvielfalt und ungleichmäßige Darstellung der Taxa Schrotflinte Daten aus genau verhindern können Charakterisierung der weniger dominante Mitglieder.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch die USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D) finanziert. TS wird durch die NSF Graduate Research Fellowship Program unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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Die Wurzel Mikrobiom zu erkunden: Extrahieren von Bakteriengemeinschaft Daten aus dem Boden, die Rhizosphäre und die Wurzel Endosphere
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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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