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Genetics

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

doi: 10.3791/57561 Published: May 2, 2018

Summary

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

Abstract

공장 호스트와 관련 된 미생물의 친밀 한 상호작용 공장 피트 니스, 결정에 중요 한 이며 abiotic 스트레스와 질병을 향상 된 공차를 육성 하실 수 있습니다. 매우 복잡 한, 낮은-비용 식물 미생물 수, 16S rRNA 유전자의 amplicon 기반 시퀀싱 등 높은 처리량 방법의 미생물 조성과 다양성 특성화에 대 한 선호 많습니다. 그러나, 이러한 실험을 실시 하는 경우 적절 한 방법론의 선택이 어려운 분석 및 샘플 연구 사이의 비교를 만들 수 있는 편견을 감소 시키기를 위해 중요 합니다. 이 프로토콜 수집 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플에서 DNA 추출에 대 한 표준화 된 방법론을 세부 사항에 설명합니다. 또한, 우리이 샘플에서 세균성 지역 사회 구성의 탐사를 허용 하는 기초가 튼튼한 16S rRNA amplicon 시퀀싱 파이프라인을 선택 하 고 다른 마커 유전자에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 파이프라인 식물 종, 사탕수수, 옥수수, 밀, 딸기, 그리고 용 설 란, 등의 다양 한 검증 되었습니다 그리고 식물 세포에서 오염과 관련 된 문제를 극복 하는 것을 도울 수 있다.

Introduction

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역동적이 고 복잡 한 미생물 지역 사회 박테리아, archaea, 바이러스, 곰 팡이, 그리고 다른 진 핵 미생물의 구성 식물 관련 된 microbiomes에 의하여 이루어져 있다. 식물 질병의 원인에 그들의 잘 공부 역할, 식물 관련 미생물도 긍정적인 영향을 미칠 수 식물 건강 biotic 및 abiotic 스트레스에 내성 개선 하 고, 양분 가용성, 홍보 강화 통해 식물 성장 여 phytohormones의 생산입니다. 이러한 이유로, 특정 관심 taxa 식물 루트 endospheres, rhizospheres, 및 주위 토양 연관 특성화에 존재 합니다. 일부 미생물 실험실 생성 된 미디어에 고립에서 경작 될 수 있다, 하는 동안 많은 수 없습니다, 그들은 다른 미생물과 공생 관계에 따라 달라질 수 있기 때문에 일부 매우 느리게 성장 또는 랩 환경에서 복제 될 수 없는 조건을 요구. 때문에 재배에 대 한 필요를 circumvents 상대적으로 저렴 하 고 높은 처리량, 되었다 환경 및 호스트 관련 미생물 샘플 프로 파일링 계통 발생 시퀀스 기반 미생물 커뮤니티 시 금 선호 하는 방법 구성입니다.

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼1 다양 한에서 제공 하는 적절 한 시퀀싱 기술의 선택은 사용자의 요구에 따라 포함 하는 중요 한 요소: 원하는 범위, amplicon 길이, 예상 커뮤니티 다양성, 뿐만 아니라 오류 속도, 읽기-길이, 그리고는 비용-당-실행/megabase 시퀀싱. Amplicon 기반 시퀀싱 실험에서 고려 되어야 또 다른 변수 어떤 유전자 증폭 될 것 이며 어떤 뇌관을 사용 됩니다. 때 설계 또는 뇌관을 선택, 연구 결과 amplicons에서 달성 증폭의 보편성과 분류학 해상도 간의 절충이 종종 밖에 없습니다. 이러한 이유로 이러한 유형의 연구는 자주 뇌관 및 마커는 미생물의 특정 하위 집합을 대상으로 선택적으로 선택 했다. 세균성 지역 사회 구성 평가 연속 하나 이상의 세균의 16S rRNA 유전자2,3의 하이퍼 지역 일반적으로 수행 됩니다. 이 연구에서 설명 하는 기반 하는 amplicon 시퀀싱 프로토콜 NGS 플랫폼에 대 한 충분 한 다양성을 제공 하는 동안 세균 taxa의 넓은 확대를 위한 수 있는 세균의 16S rRNA 유전자의 그 대상 500 bp V3-V4 지역 개발 다른 taxa 사이 구별. 또한,이 프로토콜을 쉽게 다른 뇌관 집합, 버섯의 ITS2 마커 나 진핵생물의 18S rRNA 소 단위를 대상으로 함께 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.

다른 접근 같은 샷건 metagenomics, metatranscriptomics, 및 단일 셀 시퀀싱, 이점이 다른 해결된 미생물 게놈 및 커뮤니티 기능의 더 직접적인 측정을 포함 하 여, 이러한 기술은 일반적으로 더는 비싸고 계통 발생 프로 파일링 보다 계산 집중4여기 설명합니다. 또한, 루트 샘플에 샷건 metagenomics 및 metatranscriptomics을 수행 호스트 식물 게놈에 속하는 읽기의 큰 비율 수 있고이 한계를 극복 하는 방법을 여전히 개발된5,6되 고 있습니다.

어떤 실험 플랫폼와 마찬가지로 amplicon 기반 프로 파일링 하는 것은 실험적인 디자인 및 데이터 분석 하는 동안 고려 되어야 하는 잠재적인 편견의 수를 발생할 수 있습니다. 샘플 수집, DNA 추출, PCR 뇌관의 선택 및 라이브러리 준비를 수행 하는 방법을 방법을 포함 됩니다. 다른 방법을 생성 하 고, 사용 가능한 데이터의 양을 크게 영향을 미칠 수 고 또한 연구 사이 결과 비교 하는 노력을 방해 수 있습니다. 예를 들어 rhizosphere 박테리아7 와 다른 추출 기술의 사용 또는 DNA 추출 키트8,9 의 선택 제거 하는 방법 표시 되었습니다 크게 영향을 다운스트림 분석에 이르게 이 관한 미생물은 현재와 그들의 상대 나타났는데 되는 다른 결론 프로 파일링 amplicon 기반 사용자 지정할 수 있습니다, 이후 연구에서 비교를 만드는 전하실 수 있습니다. 지구 Microbiome 프로젝트 공장 관련 미생물 같은 복잡 한 시스템을 공부 하는 연구자의 응용 프로그램에 의해 발생 하는 변화를 최소화 하는 수단으로 표준화 된 프로토콜의 개발에서 도움이 될 것 이라고 제안 했다 연구10,11사이 다른 방법. 여기, 우리가 위의 주제의 대부분을 토론 하 고 어디 유용한 제안을 제공 적절 한.

프로토콜 색 사탕수수 에서 추출 DNA 기초가 DNA 분리 키트11를 사용 하 여 수집, rhizosphere, 토양과 루트 샘플 과정을 보여 줍니다. 또한, 우리의 프로토콜 세균성 지역 사회12,,1314의 구조를 결정 하는 일반적으로 이용한 NGS 플랫폼을 사용 하 여 자세한 amplicon 시퀀싱 워크플로 포함 합니다. 이 프로토콜 식물 뿌리, rhizosphere, 및 사탕수수 색, 지 시 메이 스, 그리고 Triticum aestivum15를 포함 하 여 18 monocot 종의 관련 된 토양의 최근 출판된 연구에 호스트의 넓은 범위에서 사용에 대 한 확인 되었습니다. 이 메서드는 또한 검증 된 다른 마커 유전자와 함께 사용 하기 위해 agave 미생물16,17 및 딸기 미생물 의 연구에 곰 팡이 ITS2 마커 유전자를 공부 하 고 그것의 성공적인 응용 프로그램에서와 같이 18.

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Protocol

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1. 수집 및 루트 Endosphere, Rhizosphere, 및 토양 샘플의 분리

  1. 이전에 소독을 필드, 압력솥 초순 (샘플 당 물 90 mL 이상)를 입력 합니다. KH246.75 g, 8.75 g의 K2HPO4, 살 균 물 1 l 트라이 톤 X-100의 1 mL를 추가 하 여 epiphyte 제거 버퍼 (샘플 당 적어도 25 mL)를 준비 합니다. 0.2 µ m 기 공 크기와 진공 필터를 사용 하 여 버퍼를 소독.
    1. 1.2 ~ 1.5 단계, 모든 에탄올 소독 깨끗 한 장갑을 착용 시간 하 고 오염을 방지 하기 위해 각 샘플 사이의 장갑 바꿉니다. 70% 에탄올과 모든 장비를 소독 하 고 깨끗 하 게 닦아 샘플 사이의 모든 장비. 샘플링, 전에 실험에 대 한 최적의 샘플링 깊이 결정 하 고 모든 토양 및 루트 컬렉션와 일치.
  2. 대량 토양 샘플을 수집 하기를 사용 하 여 에탄올 소독 토양 코어 수집기는 코어를 수집 하 여 식물의 뿌리는 토양 식물의 기지에서 약 23 ~ 30 cm.
  3. 비닐 봉지에 토양을 전송 하 고 부드러운 떨고 하 여 토양을 균질 한 2 mL 튜브를 채우기 위해 토양 샘플 (약 600 밀리 그램)의 약 수를 전송. 바로 드라이 아이스에 2 mL 튜브 또는 플래시 DNA 추출 (2 단계)와 진행 준비까지 액체 N2 에 튜브를 고정 합니다.
    1. 일부 환경에서는 주위 토양 식물 재료를 포함할 수 있습니다. 이 경우 멸 균된 2 mm 체를 사용 하 여 비닐 봉투에서 그것을 배치 하기 전에 토양에서 식물 파편을 분리.
  4. 루트 및 rhizosphere 수집, 많은 가능한 루트를 돌보는 공장을 발굴 하는 에탄올 소독 삽을 사용 합니다. 깊이 식물에 따라 달라 집니다. 반면 밀 등 작은 식물 사탕수수 30 cm 이상 필요할 수 있습니다와 같은 몇몇 센티미터, 더 큰 식물을 파고에 의해 제거할 수 있습니다. 루트 표면에 고착 하는 토양의 약 2 m m까지 부드럽게 뿌리에서 과잉 토양을 흔들어.
    참고: 작은 식물, 연약한 뿌리, 또는 건조 하 고, 높은 점토 콘텐츠 토양에서 작업할 때는 주의 합니다. 이상적으로,만 동요 후에 뿌리에 남아 있는 흙의 얇은 층 이어야 한다. 토양의 큰 집계 남아 있으면 부드럽게 촬영의 기지를 타격 하 여 토양을 꺼내 려 고무 망치를 사용할 수 있습니다. 경우 토양이이 과정 후 남은 금액을 초과 하거나 2 mm의 짧은 폭포, 대략 두께 지적 한다.
  5. 큰 식물에 대 한 뿌리의 대표적인 하위 섹션을 잘라 하 고 루트 조직의 500 밀리 그램의 최소 50 mL 원뿔 유리병을 소독가 위 또는 위를 사용 합니다. 작은 잔디에 대 한 유리병에 전체 루트 시스템을 배치. 플래시 동결 액체 N2샘플 또는 뿌리를 커버 다음 즉시 샘플 드라이 아이스에 충분 한 epiphyte 제거 버퍼를 추가 합니다.
    참고: 주의 하지 연극 50 mL 원뿔 유리병 세척 단계를 어렵게 만들 것입니다 그것으로. Epiphyte 버퍼가 바닥에 흐름, 유리병, 내내 뿌리를 둘러싸고 상단 커버 하는 충분 한 빈 공간이 이어야 한다. 일부 잔디 때문에 50 mL 원뿔 유리병에 맞는 것 보다 더 많은 루트 바이오 매스, 뿌리의 일부를 수집 해야 합니다. 그러나, 그것은 주목 해야한다 endophytic 박테리아 rhizosphere 분수에 밖으로 세척 되 고 이어질 수 뿌리 절단, 그래서 뿌리를 파괴를 최소화 한다. 샘플 랩 귀국 후 즉시 처리 되지 않습니다, 그들은 수 저장-80 ° c.에
  6. 뿌리에는 rhizosphere 구분, 얼음, 루트 샘플을 녹여 다음 160 W 30의 펄스와 10 분 동안 4 ° C에서 루트 샘플 sonicate 냉장된 (4 ° C)에 뿌리 30 미 전송으로 구분 s, 소독 집게를 사용 하 여 50 mL 튜브 청소. 버퍼와 토양, rhizosphere 분수 (그림 1)은 원래 튜브를 폐기 하지 마십시오.
  7. 포함 하는 버퍼 튜브 원심 및 rhizosphere 4000 x g. Decant 상쾌한, 4 ° C에서 10 분 플래시 동결 튜브 액체 N2에서 rhizosphere 분수를 포함 하 고 DNA와 진행 준비까지-80 ° C에서 rhizosphere 분수를 저장 추출 (2 단계)입니다.
  8. 뿌리를 씻어, 루트 분수를 냉장된 (4 ° C) 살 균 물의 약 20 mL를 추가 합니다. 적극적으로 (또는 의해 핸드 믹서, 15-30 s), 떨고 하 여 루트를 세척 하 고 물을 배수.
  9. 아무 토양도 루트 표면에 남아 때까지이 단계를 두 번 이상 반복 합니다. DNA 추출 (2 단계)는 즉시 수행 되지 않습니다, 뿌리 소독 알루미늄 호 일에 포장, 플래시 동결 액체 N2, 그리고 저장소-80 ° c까지 샘플 DNA 추출 진행 준비에 뿌리.

2. DNA 추출

참고: 단계 2와 3 단계를 통해 에탄올으로 소독 하는 깨끗 한 장갑 착용 한다 항상 고 에탄올으로 소독 하는 표면에 모든 작업을 수행 해야 합니다.

  1. 토양 및 rhizosphere 샘플에서 DNA를 추출 합니다.
    1. 사용 하 여 신속 하 게 별도 컬렉션 튜브로 1.3, 1.7 단계에서 토양 및 rhizosphere의 250 밀리 그램을 전송 하는 메 마른 주걱 상업 DNA 분리 키트에 제공 된 토양에서 추출 설계 다음 DNA 절연 키트 공급 업체를 사용 하 여 진행 프로토콜입니다.
    2. 방출 후 DNA 분리 kit에서 제공 하는 차입 버퍼에서 DNA 준비 3 단계 진행까지-20 ° C에서 DNA를 저장 합니다.
  2. 루트 샘플에서 DNA를 추출 합니다.
    1. 진정 소독된 박격포와 유 봉 액체 N2를 사용 하 여. 루트 조직의 600 700 mg에 밖으로 측정 하 고 박격포 조직을 넣습니다. 조심 스럽게 뿌리를 충당 하기 위해 충분 한 액체 N2 를 추가 합니다.
    2. 작은 조각으로 뿌리를 갈아. 액체 N2 를 추가 하 고 연 삭 과정을 계속 (적어도 두 번 샘플 사이 일관 되), 뿌리는 좋은 분말까지. 루트 조직이이 단계 동안 재개 하지 않습니다 확인 합니다.
      주의: 적절 한 개인 보호 장비 (연구실 코트와 극저온 장갑, 보호 안경,) 때 사용 액체 N2를 사용.
      참고: 낮은-품질 DNA 추출에 대 한 도움이 될 수 초과 뿌리 분말으로 갈아 분말-80 ° c.에 저장 하
    3. 신속 하 게, 루트 전에 분말 동, 메 마른 주걱을 사용 하 여 얼음에 미리 무게 1.5 mL 튜브에 루트 파우더를 전송 하기 시작 합니다. 튜브와 파우더의 무게를 기록 합니다. 일반적으로 300-400 mg 분말의 전송 됩니다.
    4. 신속 하 게 상용 DNA 분리 키트에 제공 된 컬렉션 튜브를 루트 파우더의 150 밀리 그램을 전송 하는 메 마른 주걱을 사용 하 여 토양에서 추출 설계 다음 DNA 절연 키트 공급 업체의 프로토콜을 사용 하 여 진행 합니다.
      참고: 일부 루트 샘플에 대 한 있을 수 있습니다 유기 물이 PCR, 특히 때 다른 DNA 추출 프로토콜 중 DNA의 확대를 방지 DNA 펠 릿에 남아의 높은 농도 (., CTAB 추출) 사용 됩니다. 필요한 경우 환경 DNA 정리 키트에 제공 된 지침에 따라 DNA를 청소.
  3. 고감도 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 모든 DNA 샘플의 농도 측정 합니다.
    1. 튜브 dsDNA 높은 민감도 분석 결과 키트에 제공 된 각 eluted DNA 샘플의 1-20 µ L를 추가 합니다. 200 µ L까지 fluorometer 작업 솔루션 (1: 200 염료: 버퍼)를 추가 합니다.
    2. 표준 2 (100 ng / µ L)의 DNA 표준 1 (0 기 / µ L DNA) 또는 10 µ L의 10 µ L을 포함 하는 두 개의 추가 튜브를 준비 하 고 각 표준 fluorometer 작업 솔루션의 190 µ L를 추가 합니다.
    3. 표준 및 각 샘플의 농도 측정 합니다. 자동으로 수행 하지, DNA 농도 흡 광도 출력에서 두 개의 표준 선형 회귀 계산 합니다.

3. Amplicon 라이브러리 준비 및 제출

  1. 증폭 반응에 대 한 자료를 설정 합니다.
    1. 4 ° C에서 DNA 샘플을 해 동 하 고 3 단계에 걸쳐 얼음에 그들을 유지. PCR (표 2)에 위치 편견을 최소화 하기 위해 DNA 샘플의 순서를 임의화
    2. 96-잘 PCR 접시에 희석 DNA 분자 급 물에 각 샘플에서 20 µ L. 추가 20 µ L 분자 급 물 4 코너 웰 스의 총 볼륨에서 5 ng / µ L에 확대 (공백) (표 2)에 대 한 부정적인 컨트롤.
    3. 다중 채널 피 펫 (그림 2)와 함께 추가할 수 있습니다 그런 바코드 뇌관 (10 µ M) PCR 스트립 튜브 또는 96 잘 접시에 배열.
    4. 3 중에서 각 DNA 샘플을 증폭 하는 충분 한 PCR 마스터 믹스를 준비 합니다. BSA (20 mg/mL)의 1.5 µ L, 미리 만든 2 마스터 믹스 (PCR 버퍼, MgCl2, dNTPs, Taq DNA 중 합 효소의 구성된) x 37.5 µ L, 엽록체 PNA의 0.57 µ L를 준비 (100 µ M), 미토 콘 드 리아 PNA의 0.57 µ L (100 µ M), 그리고 분자 학년 물 25.86 µ L.
    5. 멀티 채널 피 펫 저수지의 메 마른 25 mL로 마스터 믹스와 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 새로운 96-잘 PCR 플레이트의 각 음에 마스터 믹스의 66 µ L를 배포.
      참고: 마스터 믹스에 대 한 시 볼륨을 계산할 때 또한 접시 당 4 빈 우물을 포함 있는지 확인 합니다.
    6. 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 5 ng / µ L 마스터 믹스 플레이트 (표준화 된 DNA 접시)에서 DNA의 6 µ L를 추가 합니다. 각 열에 다른 앞으로 바코드 및 1.5 µ L 10 µ M의 각 행에는 다른 역방향 바코드 (그림 2)는 뇌관을 반대는 10 µ M 앞으로 뇌관의 마스터 플레이트 1.5 µ L에 추가 합니다.
      참고: 프라이 머를 추가 하기 전에 무작위로 접시와 마스터 혼합 사용 될 수 다른 뇌관 추가 된 경우 ITS 또는 ITS2 곰 팡이 유전자를 증폭 하는. 이 경우 유사한 뇌관 디자인을 사용할 수 있습니다.
    7. 3000 x g.에서 짧게 접시 아래로 회전 부드럽게, 혼합 후 반응 혼합물의 25 µ L 3 접시로 분할 다중 채널 피 펫을 사용 합니다.
      참고: 세 개의 복제는 엄격 하 게 필요 하지 않습니다, 비록 그것은 기술 변화의 영향 감소.
  2. Thermocycler 다음과 설정을 사용 하 여 각 접시에서 DNA를 증폭: 180 s 98 ° C에, 30의 주기: 45 98 ° C s (변성 시키기), 78 ° C 10 s (PNA 어 닐 링), 55 ° C 60 s (뇌관 어 닐 링), 그리고 72 ° C 90에 대 한 s (확장) 다음 600 72 ° c에서 4 ° c s 보유 단계. 증폭, 후 한 단일 96 잘 접시에 세 가지 복제 판 풀.
  3. 96 잘 접시 리더에서 고감도 fluorometer 시 약을 사용 하 여 DNA를 계량.
    1. Fluorometer 작업 솔루션 (1: 200 염료: 버퍼)의 98 µ L 함께 96-잘 microplate에 각 PCR 제품의 2 µ L를 추가 합니다. 표준으로 4 우물을 포함: 5 µ L의 DNA 표준 1 (0 기 / µ L DNA), 표준 2 (10 ng / µ L)의 1 µ L, 2 µ L의 표준 2 (20 ng / µ L), 및 표준 2 (50 ng / µ L)의 5 µ L. Fluorometer 100 µ L의 최종 볼륨에 대 한 작업 솔루션을 추가 합니다.
      참고: 각 샘플 수 측정 단계에서 설명한 2.3 플레이트 리더를 사용할 수 없는 경우에 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여.
    2. 4 개의 표준 선형 회귀 하 여 흡 광도 출력에서 DNA 농도 계산 합니다.
    3. 성공적으로 증폭 된 바코드에 대 한 제품 (그 농도 15 ng / µ L 보다 큰), 수영장 100 단일 1.5 mL 튜브 (표 2)에 각 샘플의 ng.
    4. 스프레드시트 프로그램에서 =AVERAGE() 함수를 사용 하 여 풀에 추가 하는 샘플의 평균 볼륨을 계산 합니다. 풀링된 샘플에 "빈" PCR 제품의 볼륨을 추가 합니다.
      참고: "공백" PCR 제품 그들의 자신의 고유한 바코드 조합 때문에, 그들은 수 수 시퀀싱 어떤 실험실 오염 물질에 대 한 확인.
  4. DNA의 단계, 2.3과 걸릴 600에 설명 된 대로 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 풀링된 제품의 농도 측정 하 고 1.5 mL 튜브에 100 µ L의 최종 볼륨을 분자 수준의 물에 희석. -20 ° c.에 나머지 풀링된 제품 저장
  5. 몇 가지 예외와 함께 96-잘 형태로 상자성 정화 구슬과 설립된 PCR 정화 과정에 따라 600 ng DNA aliquot 세척.
    1. 신선한 600 µ L 70% 에탄올의 aliquot 확인 합니다. 다시 바닥에 침전 하는 구슬 중단 자석 구슬의 병을 흔들어.
    2. DNA의 600 ng 약 수를 구슬 솔루션의 1 x 볼륨 (100 µ L)를 추가 합니다. 10 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분 동안 품 어.
    3. 마그네틱 스탠드 2 분 (또는 때까지 솔루션은 분명 하다)에 튜브를 놓고 비즈 솔루션에서 분리. 여전히 마그네틱 스탠드에서에서 튜브를 실행 하는 동안 자석 구슬, 건드리지 않고 맑은 상쾌한을 신중 하 게 발음 하 고 맑은 상쾌한 삭제.
      참고:이 시점에서, amplicon 제품에 바인딩됩니다 자석 구슬. 방해 또는 동안 포부는 어떤 구슬 DNA의 손실이 발생 합니다.
    4. 마그네틱 스탠드에 튜브를 두고 관;에 70% 에탄올의 300 µ L를 추가 에탄올 및 삭제 30 s. Aspirate에 대 한 실 온에서 품 어. 이 과정을 반복 하 고 두 번째 세척 후 모든 에탄올을 제거 합니다. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거 하 고 5 분 동안 건조 한 공기.
    5. 말린된 구슬에 분자 급 물 30 µ L을 추가 하 고 10 번 pipetting으로 혼합. 비즈 솔루션에서 분리 하는 2 분 1 분 마그네틱 스탠드에 반환 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 새로운 튜브는 eluate 전송.
      참고: 자석 구슬 다운스트림 반응 영향을 주지 않습니다.
  6. 청소, 2.3 단계에서 설명한 대로 벤치탑 fluorometer를 사용 하 여 풀링된 DNA의 최종 농도 측정 합니다. 10 약 수를 희석 농도에 또는 30 µ L의 최종 볼륨 및 볼륨 시퀀싱 시설 선호 nM.
  7. NGS 플랫폼, 300 bp 쌍-엔드 시퀀싱 x 2에 DNA 시퀀싱 하는 시퀀싱의 서비스를 활용 합니다.

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Representative Results

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일치 하는 각 샘플을 다시 하 고 어느 박테리아에 할당 될 수 있는 인덱싱된 쌍 간 읽기의 데이터 집합에서 발생 해야 권장된 프로토콜을 수행 조작 상 분류학 단위 (OTU) 또는 정확한 시퀀스 변종 (ESV, amplicon 라고도 시퀀스 변종 (ASV) 및 sub-operational 분류학 단위 (sOTU)), 다운스트림 분석에 따라. 높은-품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 해야 합니다 주의 샘플 간에 일관성을 유지 샘플 처리 또는 라이브러리 준비 하는 동안 어떤 잠재적인 편견의 도입을 최소화 하 고 각 단계에서. 수집, 처리, 및 (1 단계와 2 단계), 샘플에서 DNA를 추출 결과 eluate 표시 명확 하 고 증폭을 억제 하는 생명체의 무료 됩니다. Microvolume 분 광 광도 계를 통해 각 DNA 샘플을 측정 하 여 순도 확인할 수 있습니다, 하는 동안 우리 토양 DNA 추출 키트 안정적으로 모든 오염 물질을 제거 하는 것이 나타났습니다. 예측 가능한 DNA 품질, 결과로 특히 DNA 묶는 형광 기반 염료에 의존 하는 정량화 방법 UV 흡 광도19,,2021에 따라 그 보다 더 적절 한 있습니다. PCR 증폭, 전에 토양 및 rhizosphere 샘플 평균 약 10 ng / µ L DNA, 루트 샘플은 일반적으로 약 30 ng / µ L (표 2)의 평균 농도가지고 하는 동안.

(3 단계) 환경 DNA의 증폭에 따라 성공 또는 실패 결정 될 수 있다 가능 하다 면, 플레이트 리더에 벤치탑 fluorometer 시 약을 통해 PCR 제품의 농도 측정 하 여 또는 수동으로 (표 2). 우리의 경험에서는, 높은-품질 amplicon 데이터 성공적인 확대 15 ng / µ L PCR 제품 보다 큰 양보. 접시에 여러 오류 들이 있다면, 식물 및 실패 한 샘플의 샘플 유형 내 위치 배열 문제를 결정 도움이 됩니다. 예를 들어, 그들은 모든 접시에 인접 한 경우에, 그들은 모두 동일한 행 또는 열에 있다면, 그것은 특정 뇌관 문제 제안 수 있는 반면 피 펫 오류를 나타낼 수 있습니다 그것. 그들은 모두 같은 샘플 종류에 속해, 샘플 처리 또는 DNA 추출 문제를 제안 수도 있습니다.

그것은 실험적인 디자인 그들은 엽록체와 미토 콘 드리 아 16 유전자의 증폭을 차단 확인 하는 동안 특정 식물 시스템 bioinformatically와 보편적인 PNAs의 호환성을 확인 해야 합니다. 증폭 단계, 그것은 불분명 여부는 PNAs 성공적으로 바인딩된에 미토 콘 드리 아와 엽록체 템플릿; 이것은 시퀀싱 (그림 3) 후만 계시 된다. PNAs 오염 확대, 각 엽록체와 미토 콘 드리 아 16S rRNA 유전자 (복사본을 여러 개 있을 수 있습니다) 공장에 대 한 PNA 순서의 줄 맞춤을 효과적으로 차단 됩니다 보장 하기 위해 조사 되 고 호스트 어떤 불일치 공개 하지 해야 . PNA 클램프 가운데 특히 13 bp PNA 시퀀스에 단일 불일치도 제공된 엽록체 PNA 시퀀스의 경우와 엽록체 16S rRNA 유전자 왕고들빼기속 sativa로 구나 (상 추) ( 의 효과 획기적으로 줄일 수 있습니다. 그림 3).

때문에 증폭 된 DNA의 동일한 금액 읽기 수가 약도 받아야 샘플 당 시퀀싱 및 읽기 자신의 바코드 인덱스 (그림 4)에 따라 정렬 후 샘플, 거기 당 풀링된입니다. 이러한 읽기의 대부분은 세균 taxa를 일치 해야 합니다. 모든 진 핵, 미토 콘 드리 아, 엽록체 일치를 무시 해야 하는 또는. 분석 파이프라인 분류학 데이터베이스 선택에 따라, 엽록체와 미토 콘 드리 아 읽기 할당할 수 있습니다 실수로 세균성 계보, 종종 박테리아Rickesttia, 각각 (그림 3). 수동 큐레이터의 정도 종종 이러한 일반적인 잘못 할당 확인 하. 구체적인 내용을 분석, 선택에 따라 달라 집니다 있지만 일반적으로 관계 되는 풍부 프로필 비슷해야 (큰 차이) 생물 복제 및 토양, rhizosphere, 및 루트 샘플 (그림 5 사이 크게 다른 ). 단는 동안 생물 복제 사이 상당한 차이가 있을 수 있습니다, 그것은 당 적어도 3 개의 복제를 수집 하는 것이 중요 중요 하다.

이 실험에서 얻은 데이터를 해석 하기 위한 메서드는 미생물 생태학 사이 뜨겁게 토론 된다. 최근까지 amplicon 시퀀스 분석 OTUs 읽기 그룹화에 의존 하고있다. 그러나, 이것은 문제가 있기 때문에: 1) 그들은 97% 유사성의 다소 임의의 임계값 기반, 2) 다양성은 종종 과소 평가, 고 3) 있을 수 있습니다 낮은 분류학 해상도. 최근 DADA2, Deblur, 및 UNOISE222,,2324 같은 개발된 도구 ESVs, 제시 OTUs 사용할 때 몇 가지 문제를 해결에 읽기를 정렬 하실 수 있습니다. ESVs를 사용 하 여 주의 사항 포함: PCR 및 시퀀싱 오류25,26종, 고 2) 증가 된 감도에서 rRNA 복사본의 차이로 인해 다양성 1) 인공적인 증가.

Figure 1
그림 1: 루트와 rhizosphere 분수의 분리. 순서도 rhizosphere 루트 샘플, 뿌리 모든 나머지 rhizoplane 유기 체를 제거 하는 살 균 물으로 세척 하 여 뒤에서 분리 하는 단계를 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 증폭 및 판 내 배포에 대 한 재고 뇌관 레이아웃의 예. 주식 뇌관 (표 1) 96 잘 접시 (각 뇌관의 다른 색으로 표시 됩니다; 그리고 앞으로 뇌관 1-8에 대 한 퍼플 오렌지 전달 뇌관 역방향 뇌관 1-12에 대 한 9-16, 블루 내에서 최적의 분산에 대 한 스트립 튜브에 준비 하실 수 있습니다. 녹색 반전 뇌관 13-16.) 이 경우에, 16 고 16에 대 한 역방향 프라이 머 배포할 수 있습니다 효율적으로 다중 채널 피 펫으로는 잘 마다 고유한 바코드 조합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 엽록체 PNA는 효과적인 결과. Rhizosphere ("Rhizo"), 루트 및 치료 비 (NT) 또는 생물 토양 개정으로 (VT)를 치료 하는 상 추에서 토양 샘플에서 대표적인 결과. 대부분의 식물의 엽록체 오염 차단 하는 데 사용 되는 PNA 시퀀스 GGCTCAACCCTGGACAG27입니다. 그러나, 양상추 엽록체 16S ribosomal RNA 유전자 (GGCTCAACTCTGGACAG) 불일치를 포함합니다. 이 PNA 효과, rhizosphere 및 루트 샘플에서 박테리아를 일치 하는 읽기의 높은 상대적 풍요에 따른 렌더링 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 읽기의 분포 계산 라이브러리에 샘플 중. 수를 보여 주는 가로 막대형 차트에서 일치 하는 읽기에 바코드 조합에 의해 다른 샘플 (바, x 축), 수 (y 축) 읽기. 샘플 당 읽기 수; 라이브러리에 얼마나 많은 샘플에 따라 달라질 수 있습니다. 이 하위 집합은 192 샘플 라이브러리에 시퀀싱 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 루트, rhizosphere, 및 토양 지역에서 최고 12 클래스의 관계 되는 풍부. 6을 포함 하는 대표 16S 데이터 집합에 클래스의 관계 되는 풍부를 보여주는 누적 가로 막대형 차트는 각 샘플 형식 (대량 토양, rhizosphere, 루트 endosphere)에 대 한 복제 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: V3-V4 지역 16S rRNA 유전자의 증폭에 대 한 뇌관. 뇌관의, 순차적으로 구성 됩니다: 시퀀싱, 그리고 341F 또는 785R 16S rRNA 유전자의 증폭 보편적인 PCR 뇌관에 대 한 프레임 이동 하기 위하여 일반적인 NGS 플랫폼, 고유 바코드, NGS 위한 뇌관, 가변 길이 공백 지역에 대 한 어댑터. 필요한 뇌관의 수는 얼마나 많은 샘플 라이브러리; 당 시퀀싱 되 의존 16 고 16에 대 한 역방향 프라이 머의 결합은 244 샘플 (256 뇌관 조합 12 PCR (그림 2) 동안 빈 우물에 사용)에 대 한 충분 합니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

표 2: 무작위 DNA의 이전 및 확대에 따라 샘플. 예제 워크시트 샘플을 무작위 순서로 나열 하 고 뇌관 조합 그것에 할당 결정 하는 단일 96 잘 접시에 그들의 위치를 나타내는. 맨 아래 행에 수식을 설명 100을 추가 하기 위한 계산 정규화 된 접시 플러스 20 µ L를 도달 하는 물의 볼륨을 각 샘플의 ng. 증폭, 100의 볼륨에 따라 각 성공적인 제품의 ng 계산 및 최종 수영장에 추가. 최종 풀에 추가 하려면 "빈" PCR 제품의 다른 샘플의 평균 이다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 샘플 수집. 중 최소 루트 바이오 매스의 근사 때 수집 뿌리 조직의 이상 500 mg를 수집 하려고 합니다. 여기, 뿌리는 젊은 사탕수수 공장에서 수집 (왼쪽, 둘 다에 A와 B) 젊은 쌀 공장 (오른쪽) 옆에 (A)와 (B) 50 mL 원뿔 튜브 내부에 표시 됩니다. 그러나 두 샘플 약 1 g의 무게,, 그것은 중요 한 것이 체중이 루트를 포함 하는 rhizosphere 및 rhizosphere 무게는,이 경우에, 대략 반 총 무게. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 프로토콜에서는 루트 endosphere, rhizosphere, 및 샘플 처리 및 다운스트림 시퀀싱 필드 샘플링에서 토양 미생물 지역 사회 구성에 대 한 설립된 파이프라인을 보여 줍니다. 공부 루트 관련 microbiomes 선물 독특한 도전, 인해 일부 샘플링에서 고유한 어려움에 토양에서. 토양은 매우 변수 육체 및 화학 재산의 점에서 그리고 다른 토양 조건 만큼 약간 몇 밀리미터28,29에 의해 분리 될 수 있다. 이 상당히 다른 미생물 커뮤니티 구성 및 활동30,31인접 한 샘플링 사이트에서 수집 되는 샘플 발생할 수 있습니다. 따라서, 사용 하 여 토양 코어 수집과 삽 유지 일관 된 샘플링 깊이 이전 DNA 추출 균질 루트 미생물 연구에서 재현성에 필수적입니다. 그것은 또한 rhizosphere 및 루트 분수;을 효율적으로 분리에 필수적 더 보수적인 세척 루트 표면7에서 모든 미생물을 제거할 수 없습니다 하는 동안 루트 표면 살 균의 가혹한 방법을 사용 하 여 이전 DNA 추출, 뿌리에서 endophytes을 lyse 잠재적으로 수 있습니다. 수 있는 부정적인 영향을 시퀀싱 결과 방해 하는 또 다른 주요 요소는 세균 오염, 여러 소스에서 온 수 있으며 때때로 샘플링된 환경 박테리아32,33에서 구별 가능 하다. 이런 이유로 주의 살 균 샘플링 도구, 실험 재료, 그리고 작업 환경 오염을 방지 하기 위해 생명 이다.

샘플링, 후 고품질 DNA를 얻는 성공적인 다운스트림 분석에 대 한 우선 순위가 높은 것은. 우리의 경험에서는, DNA 추출 CTAB 기반 추출 통해와 같은 다른 방법을 통해 루트 샘플을 성장 하는 분야에서 자주 humic 산 및 rhizosphere 및 토양 샘플에 비해 다른 화합물의 실질적으로 큰 수량 포함. 이러한 화합물 중 낮은 농도34,35에서도 PCR 증폭, DNA 중 합 효소의 효소 활동을 방지할 수 있습니다. DNA 추출 키트 루트 샘플 뒤에 페 놀 CTAB 추출 반대에 토양을 위한 클로 프롬 정리, humic 산의 샘플을 효과적으로 제거 수 및 고품질 DNA36,37, 귀 착될 것 이다를 사용 하 여 38,39. 따라서, 뿐만 아니라 루트 샘플에 대 한 상용 DNA 추출 키트를 사용 하는 것이 좋습니다. 목표는 식물의 뿌리에서 미생물 게놈 DNA를 주목 한다. 따라서, 철저 하 고 일관 된 루트 연 삭은 식물 조직을 무 너 뜨 하 여 연 삭 압력 및 시간에 있는 변이 때문에 샘플 사이의 바이어스 없이 미생물 DNA를 풀어 미생물 세포를 lyse 중요 합니다.

샘플에서 DNA의 주의 추출, 다음과 같은 문제에 대 한 두 가지 주요 소스 동안 있다 증폭: 1) 공장 endosymbionts (엽록체와 미토 콘 드리 아)와 증폭 16S rRNA 영역의 선택 2) 식물 조직의 오염. 증폭 엽록체 나 미토 콘 드리 아 16S rRNA 시퀀스를 생성할 수 있습니다 > 루트에서 시퀀스의 8040, 샘플링 하 고 더 잎 조직에 비록 오염의 금액은 뇌관의 선택에 따라. 따라서, PNA 클램프 공장 호스트 엽록체와 미토 콘 드리 아 16S 오염27,41을 억제 하는 PCR 단계 동안 필요 하다. 그러나, 다른 식물 종의 엽록체와 미토 콘 드리 아 16S 시퀀스27; 변화를 가질 수 있습니다. 따라서, 식물 라이브러리 시퀀싱 전에 대체 PNA oligos 필요를 결정 하기 위하여 공부 되 고 (그림 3)의 16 기 미토 콘 드리 아 유전자는 엽록체의 시퀀스 확인 필수적 이다. 또한, 16S rRNA 유전자 9 하이퍼 지역 9 개 보수 지역;에 의해 형벌의 구성 있는 hypervariable 증폭된42입니다에 따라 같은 지역 사회에서 다른 결과 얻을 수 있습니다. 이전 연구 중 가장 신뢰할 수 있는 다른 광범위 한 미생물 조사11사용 되었습니다 분류43 그리고 그것 할당 될 V4 영역을 발견 했다. V3-V4 지역 대상 길어 다양성을 증가 하 고 분류학 해상도 향상을 여기 건의 된다.

이 프로토콜에서 우리 환경 샘플12의 미생물 커뮤니티 작곡 공부에 대 한 다음 세대 시퀀싱 (NGS) 통해 16S rRNA amplicon 시퀀싱을 수행 하는 파이프라인을 설명 했다. 그것은 상대적으로 저렴 한, 높은 처리량, 그리고 광범위 한 전산 전문 또는 분석 하는 자원이 필요 하지 않습니다 때문에 계통 발생 프로 파일링 도구로 amplicon 시퀀싱을 사용 하 여 것이 좋습니다. 우리의 방법은 세균 분수는 미생물의 분석에 초점을 맞추고, 하는 동안 균 류를 조사 하기 위해 쉽게 적응 수 있다. 프로토콜은 2 단계를 통해 동일 하 고 3 단계에서 유일한 차이점은 어떤 뇌관 증폭 하는 동안 사용 될 것입니다. 그러나, 그것은 가치가 아무것도 amplicon 기반 프로 파일링 아니다는 것을 제한 없이입니다. 단일 마커 유전자 시퀀싱, 사회의 기능 능력에 관한 어떠한 정보도 얻을. 또한, 분류학 해상도 새롭거나 미생물의 높은 백분율을 가진 환경에서 시퀀싱 하는 경우에 특히 매우 낮을 수 있습니다. 그러나 시퀀싱 기술이 빠르게 발전 하 고 있습니다, 그리고 이러한 단점의 일부 다른 시퀀싱 플랫폼 함께 사용 하기 위해이 프로토콜을 적응 하 여 거래 가능성이 기대. 마지막으로, 소개에서 설명 했 듯이, 샷건 metagenomics와 metatranscriptomics 쉽게 수행할 수 있습니다 토양 및 rhizosphere 샘플, 그리고 식물 조직에서 공장 오염 제거 하는 메서드는 현재 탐험 되 고. 실험 설계는 쌍 amplicon 기반 접근 및 다른 metagenomic 기법에에서 효과적일 수 있다 특히 어디 높은 종 다양성 taxa의 고르지 못한 표현 및 방지할 수 있습니다 샷건 데이터를 정확 하 게 복잡 한 사회 특성화는 덜 지배적인 회원을.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작업은 농 무부-ARS (CRI 2030-21430-008-00D)에 의해 투자 되었다. TS는 NSF 대학원 연구 친교 프로그램에 의해 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180
&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs - chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

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루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출
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Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).More

Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

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