Dorsalrodsganglier Isolation og primære kultur at studere Neurotransmitter frigivelse
Summary
Dorsalrodsganglier (DRG) primære kulturer er ofte bruges til at studere fysiologiske funktioner eller patologi-relaterede begivenheder i sensoriske neuroner. Her, demonstrere vi brugen af lumbal DRG kulturer til at registrere frigivelse af neurotransmittere efter neuropeptid FF receptor type 2 stimulation med en selektiv agonist.
Abstract
Dorsalrodsganglier (DRG) indeholder celle organer af sensoriske neuroner. Denne type af neuron er pseudo unipolære, med to axoner, der innerverer perifere væv, såsom hud, muskel og viscerale organer samt det centrale nervesystem spinal dorsale horn. Sensoriske neuroner sende somatiske sensation, herunder berøring, smerte, termiske og proprioceptive fornemmelser. Derfor, DRG primære kulturer er almindeligt anvendt til at undersøge de cellulære mekanismer af nociception, fysiologiske funktioner af sensoriske neuroner, og neurale udvikling. De kulturperler neuroner kan anvendes i undersøgelser, hvor Elektrofysiologi, signaltransduktion, neurotransmitter frigivelse eller calcium billeddannelse. Med DRG primære kulturer, forskere kan kultur dissocierede DRG neuroner for at overvåge biokemiske ændringer i én eller flere celler, at overvinde mange af begrænsningerne tilknyttet i vivo eksperimenter. I forhold til kommercielt er tilgængelige DRG-hybridom cellelinjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer, sammensætning og egenskaber af de primære celler meget mere ligner sensoriske neuroner i væv. På grund af det begrænsede antal kulturperler DRG primærelementer, der kan isoleres fra et enkelt dyr, er det imidlertid vanskeligt at udføre høj overførselshastighed skærme for drug målretning undersøgelser. I den nuværende artikel beskrives procedurer for DRG samling og kultur. Derudover viser vi behandlingen af kulturperler DRG celler med en agonist neuropeptid FF receptor type 2 (NPFFR2) til at fremkalde frigivelsen af peptid neurotransmittere (calcitonin gen-relateret peptid (CRGP) og substans P (SP)).
Introduction
Celle organer af sensoriske neuroner er indeholdt i DRG. Disse neuroner er pseudo unipolar og innerverer både perifere væv og centralnervesystemet. De perifere nerveender af sensoriske neuroner findes i muskel, hud, indre organer og knogler, blandt andre væv. De sender perifere sensation signaler til nerve endelser i spinal dorsal Hornet og signaler sendes derefter til hjernen via forskellige opstigende veje af somatiske sensation1,2. Somatiske sensation gør det muligt for kroppen til at føle sig (dvs., touch, smerte og termisk fornemmelser) og opfatte bevægelse og rumlig orientering (proprioceptive fornemmelser)1,3. Der er fire underklasser af primære afferente axoner, herunder gruppe I (Aα) fibre, der reagerer på proprioception af skeletmuskulatur, gruppe II (Aβ) fibre, der reagerer på mechanoreceptors af huden, og gruppe III (Aδ) og gruppe V C fibre, der reagerer på smerte og temperatur. Kun C fibrene er unmyelinated, mens resten er myelinerede til forskellige grader.
Nociceptorer er primære sensoriske neuroner, som aktiveres ved skadelige stimuli (mekanisk, termisk og kemisk stimulation), der bærer risikoen for vævsskader. Disse neuroner er sammensat af myelinerede Aδ-fibre og unmyelinated C fibre1,4. Aδ-fibre express receptorer for nerve vækstfaktor (NGF, trkA receptor), CGRP og SP. C fibre er klassificeret som enten peptidergic og ikke-peptidergic C-fibre. På den anden side express den ikke-peptidergic C fibre receptorer for glial-afledte neurotrope faktor (GDNF, RET og GFR receptorer), isolectin IB4 og ATP-gated ion-kanal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptorer kan skelnes ved ekspression af ionkanaler og aktiveres af neurotrope faktorer, cytokiner, neuropeptider, ATP eller andre kemiske forbindelser8. Ved stimulation, kan neurotransmittere, herunder CGRP, SP og glutamat frigives fra sensorisk neuron terminaler i spinal dorsal Hornet sende nociceptive signaler2. DRG er ikke kun består af neuroner, men også indeholder satellit glial celler. Satellit celler omgiver de sensoriske neuroner og give mekanisk og metaboliske støtte9,10. Det er interessant, at der er en voksende mængde af beviser der angiver, at satellit glial celler i DRG kan være involveret i reguleringen af smerte sensation11.
Sensoriske neuroner er blevet rapporteret til at være mest ofte primære neuronale celler12 og har været udnyttet til Elektrofysiologi, signaltransduktion og neurotransmitter frigivelse undersøgelser. De er også almindeligt anvendt til at undersøge de cellulære mekanismer af neuronal udvikling, inflammatorisk smerte, neuropatiske smerter, hud følelse (som kløe) og axon udvækst12,13,14,15. DRG primære kulturer kan være kulturperler som dissocierede neuroner til at vurdere biokemiske ændringer i én eller flere celler, at lade forskere at udføre undersøgelser, der ikke kan udføres i eksperimentelle emner. For nylig, DRG var med held kulturperler fra menneskelige organdonorer, som kan få stor gavn Translationel forskning16. Sensoriske neuroner kan på den anden side også være kulturperler, som DRG explants. DRG explants bevare den oprindelige væv arkitektur af neuroner, herunder Schwann celler og satellit glial celler, og er især nyttig til at studere samspillet mellem neuronal og ikke-neuronale celler17. DRG primære kulturer kan tilberedes nemt inden for 2,5 h. Celle sammensætning og egenskaber er meget reflekterende af kilde DRG, og som sådan er specifikke DRG (lumbal eller brysthule DRG) kan afhentes efter eksperimentel krav. Kulturer af embryonale og neonatal DRG neuroner kræver NGF at overleve og fremkalde axon udvækst, men kulturer af voksne neuroner kræver ingen tilføjelsen af neurotrope faktorer til media12,17. Der er også kommercielt tilgængelige DRG-hybridom cellelinjer som Sd7/23 og F11, der ikke kræver anvendelse af forsøgsdyr. Men manglen forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1) udtryk (en vigtig markør for små sensoriske nociceptive neuroner) og inkongruente gen expression profiler begrænse deres programmer18. For nylig, udødeliggjort DRG neuronal celle linjer er afledt fra rotte (50B11)19 og mus (MED17.11)20, som er egnet til brug i høj overførselshastighed skærme for drug målretning undersøgelser. Genekspression profilering for disse cellelinjer har dog endnu skal udføres. Validering eksperimenter sammenligne disse udødeliggjort celler til sensoriske neuroner er således stadig pågår.
NPFFR2 er syntetiseret i DRG og omplantes til sensoriske nerve terminalerne i spinal dorsale horn21. I denne artikel leverer vi en protokol for dyrkning af lumbal DRG celler og behandle dem med en agonist for NPFFR2 til at fremkalde frigivelsen af neurotransmittere, CGRP og SP. Afhængigheden af NPFFR2 er yderligere testet ved hjælp af NPFFR2 lille interfererende RNA (siRNA), som kan være transfekteret i kulturperler DRG celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikel, vi vise indsamling, enzym-dissociation og kultur af rotte lumbal DRG. Med neurotrope støtte fra NGF udvidet axoner af DRG neuroner senest 3 dage efter celle såning. De udvidede axoner var klart observerbare efter celler blev farvet for CGRP protein, der er syntetiseret i celle soma og transporteret langs axon fibre. Processerne af satellit celler også udvidet, så disse delende glial celler at omgive neuronerne i dage. De primære DRG celler dyrkes af denne protokol er egnet til undersøgelser af de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. M. Calkins for engelske redigering. Dette arbejde blev støttet af Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universitet, sund aldring Research Center (EMRPD1G0171) og ministeriet for videnskab og teknologi (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
