Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Dorsalrodsganglier Isolation og primære kultur at studere Neurotransmitter frigivelse

Published: October 6, 2018 doi: 10.3791/57569
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, Department of Physiology and Pharmacology, Chang Gung University, 2Healthy Aging Research Center, Chang Gung University, 3Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital

Summary

Dorsalrodsganglier (DRG) primære kulturer er ofte bruges til at studere fysiologiske funktioner eller patologi-relaterede begivenheder i sensoriske neuroner. Her, demonstrere vi brugen af lumbal DRG kulturer til at registrere frigivelse af neurotransmittere efter neuropeptid FF receptor type 2 stimulation med en selektiv agonist.

Abstract

Dorsalrodsganglier (DRG) indeholder celle organer af sensoriske neuroner. Denne type af neuron er pseudo unipolære, med to axoner, der innerverer perifere væv, såsom hud, muskel og viscerale organer samt det centrale nervesystem spinal dorsale horn. Sensoriske neuroner sende somatiske sensation, herunder berøring, smerte, termiske og proprioceptive fornemmelser. Derfor, DRG primære kulturer er almindeligt anvendt til at undersøge de cellulære mekanismer af nociception, fysiologiske funktioner af sensoriske neuroner, og neurale udvikling. De kulturperler neuroner kan anvendes i undersøgelser, hvor Elektrofysiologi, signaltransduktion, neurotransmitter frigivelse eller calcium billeddannelse. Med DRG primære kulturer, forskere kan kultur dissocierede DRG neuroner for at overvåge biokemiske ændringer i én eller flere celler, at overvinde mange af begrænsningerne tilknyttet i vivo eksperimenter. I forhold til kommercielt er tilgængelige DRG-hybridom cellelinjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer, sammensætning og egenskaber af de primære celler meget mere ligner sensoriske neuroner i væv. På grund af det begrænsede antal kulturperler DRG primærelementer, der kan isoleres fra et enkelt dyr, er det imidlertid vanskeligt at udføre høj overførselshastighed skærme for drug målretning undersøgelser. I den nuværende artikel beskrives procedurer for DRG samling og kultur. Derudover viser vi behandlingen af kulturperler DRG celler med en agonist neuropeptid FF receptor type 2 (NPFFR2) til at fremkalde frigivelsen af peptid neurotransmittere (calcitonin gen-relateret peptid (CRGP) og substans P (SP)).

Introduction

Celle organer af sensoriske neuroner er indeholdt i DRG. Disse neuroner er pseudo unipolar og innerverer både perifere væv og centralnervesystemet. De perifere nerveender af sensoriske neuroner findes i muskel, hud, indre organer og knogler, blandt andre væv. De sender perifere sensation signaler til nerve endelser i spinal dorsal Hornet og signaler sendes derefter til hjernen via forskellige opstigende veje af somatiske sensation1,2. Somatiske sensation gør det muligt for kroppen til at føle sig (dvs., touch, smerte og termisk fornemmelser) og opfatte bevægelse og rumlig orientering (proprioceptive fornemmelser)1,3. Der er fire underklasser af primære afferente axoner, herunder gruppe I (Aα) fibre, der reagerer på proprioception af skeletmuskulatur, gruppe II (Aβ) fibre, der reagerer på mechanoreceptors af huden, og gruppe III (Aδ) og gruppe V C fibre, der reagerer på smerte og temperatur. Kun C fibrene er unmyelinated, mens resten er myelinerede til forskellige grader.

Nociceptorer er primære sensoriske neuroner, som aktiveres ved skadelige stimuli (mekanisk, termisk og kemisk stimulation), der bærer risikoen for vævsskader. Disse neuroner er sammensat af myelinerede Aδ-fibre og unmyelinated C fibre1,4. Aδ-fibre express receptorer for nerve vækstfaktor (NGF, trkA receptor), CGRP og SP. C fibre er klassificeret som enten peptidergic og ikke-peptidergic C-fibre. På den anden side express den ikke-peptidergic C fibre receptorer for glial-afledte neurotrope faktor (GDNF, RET og GFR receptorer), isolectin IB4 og ATP-gated ion-kanal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptorer kan skelnes ved ekspression af ionkanaler og aktiveres af neurotrope faktorer, cytokiner, neuropeptider, ATP eller andre kemiske forbindelser8. Ved stimulation, kan neurotransmittere, herunder CGRP, SP og glutamat frigives fra sensorisk neuron terminaler i spinal dorsal Hornet sende nociceptive signaler2. DRG er ikke kun består af neuroner, men også indeholder satellit glial celler. Satellit celler omgiver de sensoriske neuroner og give mekanisk og metaboliske støtte9,10. Det er interessant, at der er en voksende mængde af beviser der angiver, at satellit glial celler i DRG kan være involveret i reguleringen af smerte sensation11.

Sensoriske neuroner er blevet rapporteret til at være mest ofte primære neuronale celler12 og har været udnyttet til Elektrofysiologi, signaltransduktion og neurotransmitter frigivelse undersøgelser. De er også almindeligt anvendt til at undersøge de cellulære mekanismer af neuronal udvikling, inflammatorisk smerte, neuropatiske smerter, hud følelse (som kløe) og axon udvækst12,13,14,15. DRG primære kulturer kan være kulturperler som dissocierede neuroner til at vurdere biokemiske ændringer i én eller flere celler, at lade forskere at udføre undersøgelser, der ikke kan udføres i eksperimentelle emner. For nylig, DRG var med held kulturperler fra menneskelige organdonorer, som kan få stor gavn Translationel forskning16. Sensoriske neuroner kan på den anden side også være kulturperler, som DRG explants. DRG explants bevare den oprindelige væv arkitektur af neuroner, herunder Schwann celler og satellit glial celler, og er især nyttig til at studere samspillet mellem neuronal og ikke-neuronale celler17. DRG primære kulturer kan tilberedes nemt inden for 2,5 h. Celle sammensætning og egenskaber er meget reflekterende af kilde DRG, og som sådan er specifikke DRG (lumbal eller brysthule DRG) kan afhentes efter eksperimentel krav. Kulturer af embryonale og neonatal DRG neuroner kræver NGF at overleve og fremkalde axon udvækst, men kulturer af voksne neuroner kræver ingen tilføjelsen af neurotrope faktorer til media12,17. Der er også kommercielt tilgængelige DRG-hybridom cellelinjer som Sd7/23 og F11, der ikke kræver anvendelse af forsøgsdyr. Men manglen forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1) udtryk (en vigtig markør for små sensoriske nociceptive neuroner) og inkongruente gen expression profiler begrænse deres programmer18. For nylig, udødeliggjort DRG neuronal celle linjer er afledt fra rotte (50B11)19 og mus (MED17.11)20, som er egnet til brug i høj overførselshastighed skærme for drug målretning undersøgelser. Genekspression profilering for disse cellelinjer har dog endnu skal udføres. Validering eksperimenter sammenligne disse udødeliggjort celler til sensoriske neuroner er således stadig pågår.

NPFFR2 er syntetiseret i DRG og omplantes til sensoriske nerve terminalerne i spinal dorsale horn21. I denne artikel leverer vi en protokol for dyrkning af lumbal DRG celler og behandle dem med en agonist for NPFFR2 til at fremkalde frigivelsen af neurotransmittere, CGRP og SP. Afhængigheden af NPFFR2 er yderligere testet ved hjælp af NPFFR2 lille interfererende RNA (siRNA), som kan være transfekteret i kulturperler DRG celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder, der beskrives heri, at bruger forsøgsdyr blev godkendt af institutionelle Animal Care og bruge udvalg (IACUC) af Chang Gung Universitet (CGU 13-014).

1. indsamle lumbal DRG fra eksperimentelle rotter

  1. Bruge 2 til 3 uger gamle Sprague-Dawley (SD) rotter for lumbal DRG samling.
    Bemærk: DRG neuroner indsamlet fra rotter over 4 uger vokser ikke godt under kultur betingelserne beskrevet heri.
  2. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter i en autoklave.
  3. Bedøver rotte med en 1:1 blanding af Tiletamin og zolazepam (20 mg/kg; intraperitoneal injektion (IP)) og vente, indtil dyret viser ingen mund-tilbagetrækning svar i en tå-knivspids test.
    Bemærk: Forskellige anæstesi strategier kan bruges med succes i denne protokol.
  4. Ofre rotten ved halshugning med en kommerciel guillotinen.
  5. Brug guillotinen for at isolere krop stammen af rotte mellem forelimb og lårbenet. Se figur 1A for et diagram over regionen skal indsamles.
    Bemærk: De caudale cut linje skal være bare rostralt til lårbenet. Lumbal L6 DRG vil blive skåret ud hvis webstedet snit er for høj i rygsøjlen.
  6. Skær langs brystbenet og fjerne alle organer/væv med dissektion saks (figur 2A-en).
  7. Skær langs siden af stammen til at indsamle den dorsale del af rotten og fjern skindet. Se figur 1B for et fotografi af dissekerede dorsale stammen.
  8. Forberede væv på is før indsamling DRG. Ren pels og blod fra handsker, og sterilisere dem med 75% ethanol, før du fortsætter til næste trin.
  9. Fjern de muskler, der omfatter lændehvirvelsøjlen. Du skal først to snit langs siderne af rygsøjlen (venstre og højre) og ét tværgående snit til at markere det rostralt omfanget af columna lumbalis. Fjern derefter de dorsale musklerne i ryggen med knogle opskæring pincet (figur 2A-b).
  10. Fjerne den dorsale del af ryghvirvler med knogle opskæring pincet og udsætte rygmarven.
  11. Fjerne rygmarven med dissektion saks (figur 2A-c) og pincet (figur 2A-d).
  12. Identificere den lumbale DRG ved at tælle ryghvirvler fra den sidste ribben (thorax ryghvirvel 13). Se figur 1 c for et diagram af ryghvirvler positioner.
  13. Indsamle de bilaterale lumbal DRG (L1-L6) med micro-saks (figur 2A-f) i en 35-mm kultur skål med 2 mL iskold serumfrit medium. Fjern neuronal fibrene (som angivet i figur 1 c) fra forbinder DRG, derefter overføre det til kultur parabol til forbedre renheden af kulturer.
    Bemærk: De indsamlede DRG kan holdes i medium på isen for ca 1 time. I mellemtiden, flere rotter kan aflives for at skabe en større pulje af DRG.

2. primære kultur af rotte tømmer DRG

Bemærk: Følgende trin skal udføres i en laminar flow hætte.

  1. Forberede næringssubstratet indeholdende 10% føtal bovint serum, 100 mM natrium pyruvat og 1 x penicillin/streptomycin i 1 x DMEM-F12.
  2. Frakke i cellekultur behandlet 24-godt plade med 200 µg/mL poly-L-lysin for 2 h og derefter vaske med steriliseret vand.
  3. Pre Inkuber kultur fadet med 1 mL næringssubstratet i et 37 ° C CO2 inkubator før brug i mindst 30 min.
  4. Overføre DRG-holdige 35 mm fadet i en laminar hætte, og vask DRG med serumfrit medium 3 gange med pipette.
    Bemærk: Ydersiden af skålen bør rengøres med 75% ethanol før overførsel i hætten. 35 mm parabol kan indeholde DRG fra en række af rotter (dette afhænger krav af forsøgets udformning).
  5. Flytte DRG (fra en enkelt rotte eller kombineret fra flere rotter) til en ny 35 mm kultur fad, som indeholder 2 mL af collagenase type IA (1 mg/mL i serumfrit medium) med en steril pincet (figur 2A-e).
    Bemærk: Collagenase løsning bør være steriliseret ved, at det gennem et 0,22 µm sprøjte filter.
  6. Fordøje DRG i collagenase løsning i et 37 ° C CO2 inkubator i 30 min.
  7. Fjerne collagenase løsning og vask DRG 3 gange i 2 mL Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS).
    Bemærk: Der kan være resterende fibre eller væv, der kommer fra DRG oploesningen. Fjerne dem med pipette med vask løsning.
  8. Tilføj 2 mL pre varmede 0,05% trypsin-EDTA i DRG-holdige 35 mm fad og fordøje DRG i et 37 ° C CO2 inkubator i 30 min.
  9. Overføre 2 mL af DRG-holdige løsning til en 15 mL centrifugeglas af glas pipette.
    Bemærk: DRG kan holde til glas pipette, så dette trin skal udføres med omhu. DRG tab kan undgås ved at holde den DRG-holdige løsning i den tilspidsede ende af glas pipette (ca. 0,5 mL) og overførsel af opløsningen i centrifugeglasset langsomt men uden pause.
  10. Centrifugeres løsning på 290 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tilføje en anden 2-mL serumfrit medium for at resuspend DRG.
  11. Gentag trin 2.10 2 gange men ændring i serumfrit medium til pre varmede næringssubstratet på sidste gang.
  12. Manuelt hakkede DRG ca 60 gange ved hjælp af en flamme-poleret Pasteur pipette (længde 230 mm og spids hoved indre diameter 1 mm). Se figur 2B for et fotografi sammenligne blænde af en flamme-poleret Pasteur pipette til en ikke-poleret pipette.
    Bemærk: Indvendigt diameter af flamme-poleret Pasteur pipette er ca 10% mindre end kontrol pipette og indersiden af den tilspidsede ende skal glattere. Vær omhyggelig med ikke at skabe bobler, når triturating cellerne.
  13. Fjerne den poly-L-lysin-belagte fad fra CO2 inkubator. Opsug rugede næringssubstratet fra fadet, og seed de dissocierede celler på det belagte fad.
  14. Seed DRG celler fra en rotte (bilaterale samling fra L1-L6, for 12 samlede DRG) i fire brønde af en 24-godt plade; der er ca 5 x 104 celler i en godt af en 24-godt plade.
    Bemærk: Denne massefylde er egnet til påvisning af de frigivne CGRP eller SP og også egnet til immunfarvning. For vestlige skamplet eller RNA udvinding, seed DRG celler fra en rotte (bilaterale L1-L6) i en brønd på en 6-godt plade.
  15. Erstatte næringssubstratet den følgende dag med tilsætning af 10 µM cytarabine (Ara-C) og 100 ng/mL NGF, og Opdater mediet hver to dage derefter.
    Bemærk: Thorax DRG også kan også være kulturperler af denne protokol, hvis de har været indsamlet fra den brysthvirvelsøjlen.

3. Transfektion af NPFFR2 siRNA i DRG celler

  1. Udføre Transfektion af NPFFR2 siRNA og styre siRNA ifølge producentens protokol.
    Bemærk: Protokollen skal tilpasses, hvis den valgte Transfektion reagens er forskellig fra den, vi brugte (Se Tabel af materialer).
  2. På dag 3 efter celle plating, ændre mediet til 0,5 mL pre varm serumfrit medium og inkuberes DRG i et 37 ° C CO2 inkubator for 1 h.
  3. Tilføje 50 nM af siRNA (i 1 µL RNase-fri vand) til 12,5 µL serum-frit medium.
  4. Tilføje 2,5 µL Transfektion reagens i 10 µL serum-frit medium.
  5. Bland løsning fra trin 3.3 og 3.4 af, og der inkuberes denne blandede Transfektion løsning i 10 min ved stuetemperatur.
  6. Tilføj Transfektion løsning i en DRG-holdige 24-godt plade og bland løsningen med medium af blid ryster.
    Bemærk: Flere Transfektion løsninger bør implementeres på samme tid, hvis flere brønde skal være transfekteret.
  7. Inkuber DRG i et 37 ° C CO2 inkubator for 6 h.
  8. Der tilsættes 0,5 mL/godt af næringssubstratet indeholdende 20% føtal bovint serum, 100 mM natrium pyruvat og 1 x penicillin/streptomycin i 1 x DMEM-F12, med tilsætning af 10 µM Ara-C og 100 ng/mL NGF, i 24-godt pladen.
  9. Inkuber DRG i et 37 ° C CO2 inkubator for en anden 66 h (refresh medium på 48 h).

4. frigivelsen af neurotransmittere fra primære DRG celler

  1. På dag 6 efter celler blev forgyldt (72 h efter siRNA Transfektion), ændre næringssubstratet til 200 µL serum-frit medium, og der inkuberes celler i et 37 ° C CO2 inkubator i 30 min.
  2. Tilføj 1 µL stimulation præparatet og bland forsigtigt medierne af pipettering. Inkuber fad i et 37 ° C CO2 inkubator i det angivne tidspunkt.
    Bemærk: I denne artikel, de dyrkede celler blev stimuleret med NPFFR2 agonist, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2, 5 nmol) for 1 h.
  3. Indsamle næringssubstratet fra kultur parabol og centrifugeres ved 5.000 x g i 5 min. ved 4 ° C for at fjerne enhver suspenderet urenheder.
  4. Indsamle supernatanten fra centrifugeringen og fortynd prøver med fosfatbufferet saltopløsning (PBS), efter behov. Analysen niveauer af neurotransmittere med enzym immunoassay (VVM) kits.
    Bemærk: Her, at analysere blev fortyndet 1: 100 før analysere niveauet af CGRP. Supernatanten var ikke fortyndes før analysere niveauet af SP.

5. CGRP og SP VVM

  1. Analysere prøver straks efter CGRP eller SP EIA kit fabrikanten protokol.
    Bemærk: Protokollen vil variere afhængigt af kit bruges.
  2. Skyl CGRP EIA wells 5 gange med wash buffer leveres i kittet.
  3. Tilsæt 100 µL prøver med 100 µL anti-CGRP acetylcholinesterase (AChE) tracer i CGRP EIA brønd, og tilsæt 50 µL prøver, 50 µL anti-SP AChE tracer og 50 µL anti-SP antiserum i SP VVM brønde.
  4. Forsegle CGRP og SP brøndene med plastfolie, der er leveret inden for kits.
  5. Inkubér brøndene natten over ved 4 ° C.
  6. Brøndene vaskes 5 gange med CGRP eller SP vaske buffer og fjerne alle de resterende løsning fra brøndene.
  7. Tilsæt 200 µL Ellman reagens i de CGRP eller SP brønd, som er leveret inden for de tilsvarende VVM kits.
  8. Inkubér CGRP brøndene i 30 min. ved stuetemperatur, og der inkuberes SP brønde i 90 min ved stuetemperatur. Beskytte brøndene fra lys til begge assays.
  9. Læs plader på bølgelængde 414 nm og beregne resultaterne i henhold til de tilsvarende VVM instrument.
    Bemærk: Undgå at røre bunden af brøndene i hånden hele tiden og rense vand pletter fra at nå bunden af linse rengøring klude før du tilføjer den Ellman reagens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rotte lumbal DRG neuroner, kulturperler i en 24-godt plade, blev dyrket i dyrkningsmediet med yderligere Ara-C til at hæmme glial celleproliferation og NGF støtte neuronal vækst. Morfologi af levende DRG celler blev observeret. Som vist i figur 3, var cellen kroppen af en enkelt neuron fastgjort i bunden af et fad på dag 1 og markeret til observation. Axon vækst blev overvåget fra dag 1-3. De gliaceller dubleres og udvidet processer at omgive cellen kroppen af den sensoriske neuron. I en anden kultur, var CGRP protein farvet for at afsløre form af neuroner. I figur 4vises CGRP protein farvning i cytoplasma og axoner i sensoriske neuroner. De nukleare morfologier af neuroner og gliaceller er tydelig, når farves med DAPI. Neuroner har en større og mere afrundet kerne end gliaceller. Sammenligning er kerner om glia mere ovalt (figur 4B).

Selektiv NPFFR2 agonist, dNPA, blev brugt til at stimulere frigivelsen af CGRP og SP. Derudover blev afhængighed af dNPA-stimuleret neurotransmitter frigivelse NPFFR2 testet af transfecting celler med NPFFR2 siRNA. NPFFR2 siRNA eller kontrol siRNA var transfekteret i de primære DRG celler 72 h før agonist behandling. DRG celler blev behandlet med dNPA (5 nmol) for 1 h og udgivelsen af CGRP og SP blev målt ved særskilt VVM kits. Simulering af DRG med dNPA øget niveau af CGRP og SP i medierne (figur 5A, B). Dog var kun de dNPA-induceret CGRP udgivelse hæmmet af udtryk af NPFFR2 siRNA i kulturperler DRG celler. Resultaterne vist i figur 5 blev ændret fra en tidligere publikation og bruges her med tilladelse22.

Figure 1
Figur 1: væv forarbejdning diagrammer. Lumbal DRG er indsamlet fra 3 uger gamle rotter. (A) de positioner, hvor guillotinen bør anvendes til at skære dyret angives med stiplede linjer. (B) den dorsale trunk med hud fjernet og (C) placeringen af lumbal DRG (fra L1-L6) er vist. Indsæt repræsenterer DRG og forbinder fibre (som er angivet med pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: særligt udstyr til isolere DRG primære kulturer. (A) kirurgiske instrumenter, der anvendes i samlingen af DRG. Fra venstre mod højre: (et) dissektion saks (large), (b) knogle opskæring pincet, (c) dissektion saks (lille), (d, e) punkt (f) mikro-saks og pincet. (B) en regelmæssig Pasteur pipette og en flamme-poleret Pasteur pipette. "a" angiver indvendigt diameter af regelmæssige Pasteur pipette, og "b" betegner indvendigt diameter af flamme-poleret Pasteur pipette. b / a ≒ 0,9. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: morfologi af levende DRG celler. Live DRG celler blev overvåget af mikroskopi. Celler er vist (A) en dag efter såning, (B) to dage efter såning, og (C) tre dage efter såning. Pilene angiver neuron og pilespidser angive glia. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: immunfarvning af kulturperler DRG celler. DRG celler blev immunostained med anti-CGRP antistof vise neuroner, og 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) for kerner af neuroner og gliaceller. (A) CGRP protein blev udtrykt i sensorisk neuron celle organer og axon fibre. (B) kerner af neuroner og glia var plettet med DAPI. (C) fusioneret billede fra A og B. pil angiver en neuron og pilespids angiver en glial celler. Skalalinjen = 30 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: frigivelse af neurotransmittere fra kulturperler DRG celler. Selektiv NPFFR2 agonist, dNPA, blev brugt til at stimulere frigivelsen af CGRP og SP fra DRG kulturer. Afhængigheden af neurotransmitter frigivelse af NPFFR2 blev kontrolleret af transfecting celler med NPFFR2 siRNA. (A og B) efter DRG celler blev transfekteret med NPFFR2 siRNA eller ikke-målrettet kontrol siRNA (72 h), dNPA (5 nmol) blev anvendt til 1 h at inducere frigivelsen af CGRP og SP. Data udtrykkes som gennemsnit ± standard fejl af middelværdien (SEM) og blev analyseret af t wo-vejs variansanalyse (ANOVA) med Bonferroni post hoc test. p < 0,01, ***p < 0,001; i forhold til tilsvarende køretøj kontrol (N = 12 pr. gruppe). Paneler A og B er blevet ændret fra Lin et al. 22 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel, vi vise indsamling, enzym-dissociation og kultur af rotte lumbal DRG. Med neurotrope støtte fra NGF udvidet axoner af DRG neuroner senest 3 dage efter celle såning. De udvidede axoner var klart observerbare efter celler blev farvet for CGRP protein, der er syntetiseret i celle soma og transporteret langs axon fibre. Processerne af satellit celler også udvidet, så disse delende glial celler at omgive neuronerne i dage. De primære DRG celler dyrkes af denne protokol er egnet til undersøgelser af de cellulære mekanismer, der regulerer sensoriske neuroner. Her, stimulere vi frigivelsen af neuropeptider, CGRP og SP, fra kulturperler DRG neuroner ved en selektiv NPFFR2 agonist, dNPA. NPFFR2 er den beslægtet receptor for NPFF og er blevet rapporteret til at deltage i smerte sensation og forordning veje22,23. NPFFR2-afhængighed af CGRP og SP frigivelsen blev yderligere bekræftet ved brug af NPFFR2 siRNA.

DRG kulturer indeholde både sensoriske neuroner og satellit glial celler. Satellit gliaceller give metaboliske støtte til neuroner og vedligeholde neuronal funktioner9,10. Immunfarvning billeder, er det let at identificere neuroner og gliaceller, da deres kerner er formet forskelligt (Vis i figur 4B). Eksistensen af satellit celler i kultur parabol kan blive problematisk, hvis der er en eksperimentel efterspørgsel til at skelne mellem den specifikke funktion af neuroner og glia. For eksempel, er det ubestrideligt, at satellit celler er involveret i udvikling og vedligeholdelse af smerte11,24, og i nogle undersøgelser, handlinger af neuroner og gliaceller ville være vanskeligt at skelne, ved hjælp af DRG kulturer.

I denne protokol er der et par vigtige skridt, som kræver ekstra forsigtighed. Først, da DRG er indsamlet uden for laminar hætten, ekstra pleje bør tages under væv samling proces at undgå celle kontaminering. Der bør ikke være nødvendigt at skabe et sterile rum, ligesom en menneskelig kirurgisk Room, men instrument sterilisation og en ren betjeningsplads er afgørende. Tips til at undgå forurening omfatter at holde de steriliserede instrumenter på sterilisation pose når den ikke er i brug og undgå berøring af alle unødvendige elementer. Også, kontaminerende organismer kan udføres på pels, der kan holde til rotte krop trunk eller handsker. Som sådan, bør pels og blodpletter på handsker fjernes ved rengøring med 75% ethanol. Det er også nyttigt for operatøren til at bære en kirurgisk maske for at forhindre overførsel af organismer fra ånde eller spyt. 35-mm parabol bør desuden holdes lukket på alle tidspunkter og kun åbnes, når placere dissekeret DRG inde. Det er vigtigt at erstatte 35 mm parabol med en ny parabol før enzym fordøjelsen. Under enzym fordøjelse, ikke udvide inkubationstiden, da over fordøjelsen kan beskadige neuroner. Sørg for at pre varme trypsin-EDTA til 37 ° C for at opnå passende fordøjelse effektivitet. Effektiviteten vil reduceres dramatisk i lavere temperaturer, og det vil være vanskeligt at opnå en enkelt cellesuspension når triturating DRG af flamme-poleret Pasteur pipette. Flamme polering pipetten vil udjævne blænde og forhindre skarpe glas kant fra sårede neuroner. Dog overophedning pipette med en flamme vil gøre indvendigt diameter for lille, og som indeholder væv eller celle løsning vil blive vanskelig at passere. Denne reducerede diameter kan også forårsage mange bobler til at danne stadiet ændring, hvilket reducerer collectable antallet af DRG neuroner. Endelig, DRG kulturer skal håndteres forsigtigt på alle tidspunkter, især når skiftende medium eller udfører narkotikabehandling.

DRG neuroner er rapporteret til at være mest anvendte primære kulturperler neuronale celler12. De kan udnyttes til en lang række forskellige undersøgelser, lige fra Elektrofysiologi eller celle biologi til at udforske de fysiologiske eller patologiske funktioner af sensoriske neuroner. Den store begrænsning af DRG primære kulturer er, at de ikke er velegnet til high throughput screening. Antallet af celler, der kan indsamles fra DRG af en enkelt rotte er begrænset, og neuronerne er i stand til at dublere i kultur. På grund af den begrænsede celle nummer, er flere DRG-hybridom cellelinjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer udviklet til at erstatte primær kulturer18,19,20. Men protein udtrykket profiler af DRG cellelinjer kan ikke være den samme som den oprindelige DRG, og således hver modelsystemet skal kontrolleres omhyggeligt. Bortset fra at isolere cellerne i laboratoriet, er rotte embryonale eller neonatal DRG neuroner blevet gjort kommercielt tilgængelige. Derfor, køb fra kommercielle kilder kan være et levedygtigt alternativ til frisklavet DRG kulturer.

DRG primære kulturer har været brugt i mange år som en værdifuld eksperimentelle værktøj, der er for det meste vedtaget i smerte-relaterede studier. Denne modelsystem er usandsynligt, at blive erstattet i den nærmeste fremtid. Med god kvalitet DRG neuroner, kan forskere få stabile og reproducerbare resultater, der gavner mange områder af neurovidenskab undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker Dr. M. Calkins for engelske redigering. Dette arbejde blev støttet af Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universitet, sund aldring Research Center (EMRPD1G0171) og ministeriet for videnskab og teknologi (105-2320-B-182-012-MY2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) Virbac Zoletil 50 anaesthetic
Fetal bovine serum Biological Industries 04-001-1 Culture Medium
sodium pyruvate Sigma S8636 Culture Medium
penicillin/streptomycin Biological Industries 03-033-1 Culture Medium
DMEM-F12 Invitrogen 12400024 Culture Medium
Poly-l-lysine Sigma P9011 Coating dish
Collagenase IA Sigma 9001-12-1 Enzyme digestion
Hank's balanced salt solution Invitrogen 14170-112 Culture Medium
Trypsin EDTA Biological Industries 03-051-5 Enzyme digestion
Pasteur pipette Hilgenberg 3150102 Cell trituration
Cytarabine (Ara-C) Sigma C6645 Culture Medium
NGF Millipore NC011 Culture Medium
NPFFR2 siRNA Dharmacon L-099691-02-0005 Transfection
Non-targeting siRNA Dharmacon L-001810-10-05 Transfection
NeuroPORTER Reagent Genlantis T400150 Transfection reagent
dNPA Genemed Synthesis N/A NPFFR2 agonist
CGRP ELISA Cayman 589001 EIA
SP ELISA Cayman 583751 EIA
CGRP antibody Calbiochem PC205L IHC
DAPI Roche 10236276001 IHC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. Neuroscience: exploring the brain. , 3 edn, Lippincott Williams & Wilkins. (2007).
  2. Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
  3. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. Principles of neural science. , 3 edn, McGraw-Hill, Health Professions Division. (2000).
  4. Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
  5. Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
  6. Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
  7. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  8. Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
  9. Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
  10. Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
  11. Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
  12. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
  13. Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
  14. Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
  15. Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
  16. Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
  17. Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  18. Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
  19. Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
  20. Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
  21. Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
  22. Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
  23. Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
  24. Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).

Tags

Neurovidenskab spørgsmål 140 dorsalrodsganglier DRG primære kultur neuronal kulturer CGRP substans P neurotransmitter sensoriske neuron smerte smerter transmission nociception
Dorsalrodsganglier Isolation og primære kultur at studere Neurotransmitter frigivelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root… More

Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. J. Vis. Exp. (140), e57569, doi:10.3791/57569 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter