Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release
Summary
Dorsal root ganglia (DRG) primaire culturen worden vaak gebruikt om te studeren fysiologische functies of pathologie-gerelateerde gebeurtenissen in de sensorische neuronen. Wij tonen hier, het gebruik van lumbale DRG culturen te detecteren het vrijkomen van neurotransmitters nadat neuropeptide FF receptor 2 stimulatie met een selectieve agonist.
Abstract
Dorsal root ganglia (DRG) bevatten cel organen van de sensorische neuronen. Dit type van neuron is pseudo-unipolaire, met twee axonen die perifere weefsels, zoals huid, spier en viscerale organen, alsmede de spinale dorsale Hoorn van het centrale zenuwstelsel innervate. Sensorische neuronen zenden somatische sensatie, met inbegrip van de aanraking, pijn, thermische en proprioceptieve sensaties. Daarom worden DRG primaire culturen veel gebruikt om te studeren de cellulaire mechanismen van Nociceptie, fysiologische functies van de sensorische neuronen, en neurale ontwikkeling. In studies waarbij electrofysiologie, signaaltransductie, neurotransmitter release of calcium beeldvorming kunnen de beschaafde neuronen worden toegepast. Met DRG primaire culturen, wetenschappers kunnen cultuur gedissocieerde DRG neuronen als u wilt controleren van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, het overwinnen van veel van de beperkingen die zijn gekoppeld aan in vivo experimenten. Ten opzichte van commercieel zijn beschikbare DRG-hybridoma cellijnen of vereeuwigd DRG neuronale cellijnen, de samenstelling en eigenschappen van de primaire cellen veel meer vergelijkbaar met de sensorische neuronen in weefsel. Vanwege het beperkt aantal gekweekte DRG primaire cellen die geïsoleerd uit een enkel dier worden kunnen, is het echter moeilijk uit te voeren van high-throughput schermen voor drug targeting studies. In het huidige artikel, worden procedures voor het verzamelen van de Deutsche Reichsbahn en cultuur beschreven. Daarnaast tonen we de behandeling van gekweekte DRG cellen met een agonist van neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) voor het opwekken van de release van peptide neurotransmitters (calcitonine-gen-gerelateerde peptide (CRGP) en stof P (SP)).
Introduction
De organen van de cel van de sensorische neuronen bevinden zich in de Deutsche Reichsbahn. Deze neuronen zijn pseudo-unipolaire en innervate zowel perifere weefsels en het centrale zenuwstelsel. De perifere zenuwuiteinden van de sensorische neuronen zijn gevonden in de spier, huid, viscerale organen en bot, onder andere weefsels. Zij zenden perifere sensatie signalen aan de zenuw uitgangen in de spinale dorsale hoorn en de signalen worden vervolgens doorgestuurd naar de hersenen via verschillende oplopende trajecten voor somatische sensatie1,2. Somatische sensatie maakt het lichaam te voelen (dat wil zeggen, aanraking, pijn en thermische gewaarwordingen) en het waarnemen van verkeer en ruimtelijke oriëntatie (proprioceptief sensaties)1,3. Er zijn vier subklassen van primaire afferent axonen, met inbegrip van groep I (Aα) vezels die inspelen op de proprioceptie van skeletspieren, groep II (Aβ) vezels die inspelen op de mechanoreceptors van de huid, en groep III (Aδ) en groep V C vezels die inspelen op de pijn en temperatuur. Alleen de C vezels zijn unmyelinated, terwijl de rest zijn myelinated op verschillende graden.
Nociceptors zijn de primaire sensorische neuronen, die worden geactiveerd door schadelijke stimuli (mechanische, thermische en chemische stimulatie) die potentieel voor weefselschade dragen. Deze neuronen zijn samengesteld uit myelinated Aδ vezels en unmyelinated C vezels1,4. De vezels van de Aδ express de receptoren voor zenuw groeifactor (NGF, trkA receptor), CGRP en SP. De C-vezels worden geclassificeerd als ofwel peptidergic en niet-peptidergic C-vezels. Aan de andere kant, express de niet-peptidergic C vezels de receptoren voor gliale-afgeleide neurotrophic factor (GDNF, RET en GFR-receptoren), isolectin IB4 en ATP-gated ion kanaal subtype (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan onderscheiden door de expressie van ionenkanalen en geactiveerd door neurotrophic factoren, cytokines, neuropeptides, ATP of andere chemische verbindingen8. Bij stimulatie, worden neurotransmitters, waaronder CGRP, SP en glutamaat vrijgesteld van sensorisch neuron terminals in de spinale dorsale hoorn voor het verzenden van Nociceptieve signalen2. Deutsche Reichsbahn zijn niet alleen bestaat uit neuronen, maar bevatten ook satelliet gliacellen. Satelliet cellen rondom de sensorische neuronen en bieden ondersteuning voor mechanische en metabole9,10. Interessant, is er een groeiend lichaam van aanwijzingen waaruit blijkt dat satelliet gliale cellen in de DRG kunnen worden betrokken bij de regulering van pijn sensatie11.
Sensorische neuronen zijn bij de meest vaak gebruikte primaire neuronale cellen12 en hebben gebruikt voor electrofysiologie, signaaltransductie en neurotransmitter release studies gemeld. Ze worden ook vaak gebruikt om te verkennen van de cellulaire mechanismen van neuronale ontwikkeling, inflammatoire pijn, neuropathische pijn, gevoel van de huid (zoals jeuk) en axon uitgroei12,13,14,15. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen worden gekweekt als gedissocieerde neuronen te beoordelen van biochemische veranderingen in één of meerdere cellen, zodat wetenschappers voor het uitvoeren van studies die in experimentele onderwerpen kunnen niet worden uitgevoerd. Onlangs, DRG werden met succes gekweekt uit menselijke orgaandonoren die misschien veel profijt hebben van translationeel onderzoek16. Aan de andere kant, kunnen sensorische neuronen ook worden gekweekt zoals DRG explants. De DRG explantaten behouden de oorspronkelijke architectuur van het weefsel van de neuronen, met inbegrip van cellen van Schwann en satelliet gliale cellen, en zijn met name nuttig zijn te onderzoeken van interacties tussen neuronale en non-neuronale cellen17. Deutsche Reichsbahn primaire culturen kunnen gemakkelijk worden voorbereid binnen 2,5 uur. De cel samenstelling en eigenschappen zijn weerspiegelend van de bron van de Deutsche Reichsbahn, en als zodanig, specifieke DRG (lumbale of thoracale DRG) kan worden verzameld volgens experimentele eisen. Culturen van embryonale en neonatale DRG neuronen vereist NGF om te overleven en induceren axon uitgroei, maar culturen van volwassen neuronen vereisen niet de toevoeging van neurotrophic factoren de media12,17. Er zijn ook commercieel beschikbare DRG-hybridoma cellijnen zoals ND7/23 en F11, die niet dat het gebruik van proefdieren eisen. Echter het gebrek aan de potentiële catie van voorbijgaande receptor onderfamilie V lid 1 (TRPV1) kanaal expressie (een belangrijke marker voor kleine zintuiglijke Nociceptieve neuronen) en elkaar gene expressieprofielen beperken hun toepassingen-18. Onlangs, vereeuwigd DRG neuronale cel lijnen zijn afgeleid van de rat (50B11)19 en muis (MED17.11)20, die geschikt zijn voor gebruik in high-throughput schermen voor drug targeting studies. Genexpressie profilering voor deze cellijnen moet echter nog worden uitgevoerd. De experimenten van de validatie vergelijken deze vereeuwigd cellen te sensorische neuronen zijn dus nog aan de gang.
NPFFR2 wordt gesynthetiseerd in de DRG en translocated aan op de ingangen van de sensorische zenuw in de spinale dorsale hoorn21. In dit artikel bieden wij een protocol voor het kweken van lumbale DRG-cellen en hen te behandelen met een agonist van NPFFR2 voor het opwekken van de vrijlating van neurotransmitters, CGRP en SP. De afhankelijkheid van NPFFR2 is verder getest met behulp van NPFFR2 Klein Mengend RNA (siRNA), die kan zijn transfected in de gekweekte cellen van de Deutsche Reichsbahn.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel, tonen we de collectie enzym-dissociatie en de cultuur van rat lumbale DRG. Met de steun van de neurotrophic van de NGF uitgebreid de axonen van neuronen van de DRG binnen 3 dagen na het zaaien van de cel. De uitgebreide axonen waren duidelijk waarneembare nadat cellen werden gekleurd voor CGRP eiwit, die wordt gesynthetiseerd in de cel soma en vervoerd worden langs de axon vezels. De processen van satelliet cellen ook uitgebreid, waardoor deze scheidslijn gliale cellen te omringen de neuronen binnen dagen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. M. Calkins voor Engelse bewerken. Dit werk werd gesteund door de Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung Universiteit, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) en Ministerie van wetenschap en technologie (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
References
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
