Summary
脊髄領域における一過性受容体電位バニロイドタイプ1(TRPV1)は、脳機能においていくつかの役割を果たすと示唆されている。ここで説明する、マウスにおける上髄TRPV1脱感作のためのリントレーブレベンタリシンのリントレーバラトキシン注射のためのプロトコルである。いくつかの疼痛検査の手順も提示される。
Abstract
一過性受容体電位バニロイドタイプ1(TRPV1)は、熱感受性カチオンチャネルであり、末梢神経の疼痛を引き起こすことが知られている。その末梢機能に加えて、脳機能への関与も示唆されている。超強力なTRPV1アゴニストであるレジンイフェラトキシン(RTX)は、TRPV1の長期脱感作を誘発することが知られており、この脱感作はTRPV1発現細胞の生理的関連性を調べる代替アプローチとなっています。ここでは、マウスにおけるRTXによるイントレーブレブロナーリク(i.c.v.)治療のためのプロトコルについて説明する。末梢TRPV1刺激(RTX試験)および機械的刺激(テール圧試験)に対する分光試験の手順を説明する。RTX i.c.v.を投与されたマウスの不可解な応答は対照群のものと同等であったが、RTX-i.c.v.投与マウスはアセトアミノフェンの鎮痛効果に鈍感であったが、i.c.v.RTX治療は脊髄選択的TR1脱感作を誘導できることを示唆した。本マウスモデルは、脳/脊髄機能におけるTRPV1の役割を研究するための便利な実験システムとして使用することができる。これらの技術は、他の薬物の中心的な作用の研究にも適用することができる。
Introduction
動物は、周辺神経のセンサーを通じて、環境から様々な物理的および化学的刺激を受けます。一過性受容体電位バニロイドタイプ1(TRPV1)は、熱センサ1、2、2およびTRPV1の活性化および/または変調として作用する熱感受性、非選択的カチオンチャネルの1つであり、正常および炎症性の両方の文脈におけるノシセプションの重要なステップであることが知られている3。全体的な発現パターンは議論の余地があるが、TRPV1の発現は、脊髄領域において、様々な脳活動(ノシセプション4、体温調節5、不安6、注意欠陥多動性障害7、およびてんかん8を含む)に関与することが示唆されている。さらに、最近、広く使用されている鎮痛剤であるアセトアミノフェンが、その鎮痛作用9,1010を惹起する中枢TRPV1の活性化を媒介することが示唆されている。
動物にカプサイシンおよびレジンイフェラトキシン(RTX)を含む過剰なTRPV1アゴニストの投与は、TRPV1陽性ニューロンの死およびTRPV1アゴニスト11、12,12への長期脱感作をもたらす。局所的な適用(内テカル13、14、内膜13,1515、16、17、16,17および神経節内18)と組み合わせることで、この化学的アブレーションアプローチは、TRPV1の生理学的機能を調査する別の方法を提供している。我々は最近、イントレーレブロナートラリカル(すなわち.c.v.)の注入がマウスにおけるアセトアミノフェンの鎮痛効果を阻害することを報告し、上髄選択的TRPV1脱感作19を示唆している。本稿では、i.c.v.注射とその後の疼痛検査のための正確なプロトコルを提示する。
脳の心室への薬物の直接注入は、任意の末梢効果を最小限に抑えながら、その中心的な効果を研究することが可能になります.ここで示すi.c.v.射出手順は、ヘイリーとマコーミック20によって報告された方法の変更です。この方法は、冠状縫合を通して側心室に注射針を挿入することを含む簡単であり、cannulationのための特別な装置または外科的処置を必要としない。
TRPV1アゴニストの末梢局所応用は、灼熱の痛みの感覚および神経因性炎症を呼び起こす。RTXで全身処理されるマウス、およびTRPV1-KOマウスは、この刺激13に対して無神経である。RTX-i.c.vにおける末梢TRPV1の保存を確認するために、RTX(RTX試験)の板腔内注入を行った。マウス。この方法は、従来のホルマリン試験21の改変である。
RTXおよびTRPV1-KOマウスで全身的に処置されたマウスは、機械的刺激11、13、2213,22に対して正常な閾値を示すことを報告されている。11ここでは、アセトアミノフェンの鎮痛効果の変化をテストするためのテール圧力試験の手順を提示します。
これらの手順はすべて正統性と汎用性があり、他の薬物の研究に適用することができます。
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Protocol
ここで使用される実験プロトコルはすべて武蔵野大学動物の世話と使用委員会によって承認されました。雄のddYマウス(SLC、静岡、日本)は、水と食物のアドリビタムの実験の前に、少なくとも7日間、12時間の明暗サイクル下で飼育した。5週齢または6週齢のマウスを実験に使用した。
1. 薬物の調製
-
Rtx
注:アルコール性RTX溶液は、重度の皮膚の火傷や目の損傷を引き起こす可能性があります。取扱い時には、必ずゴム手袋とメガネを使用してください。このストックソリューションは6ヶ月間使用できます。- 500 μLのエタノールを1mgのRTXに加えます。
- ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートを上記の溶液に500μL加え、渦をよく加えます。
- 混合物と渦によく生理食塩水の4 mLを加えます。
- アリコート40 μLの溶液を1.5mLスクリューキャップチューブに入れ、-40°Cで保管します。
-
アセトアミノフェン
- 30 mg/mLの濃度でアセトアミノフェンに20%w/vプロピレングリコール溶液を加え、超音波処理器で溶解します。アセトアミノフェンは溶解後数時間後に室温で沈殿することがあるので、使用する直前に準備するか、使用するまで溶液を暖かく保ちます。
2. RTXの皮下またはイントレーレブロナーキュラー注射
- 1.1で調製したストックされた溶液を解凍します。上記と(mM)からなる生理食塩水または人工脳脊髄液(ACSF)で20μg/mLにそれを希釈する:119 NaCl、2.5 KCl、1 NaH2PO4、26NaHCO3、11グルコース、1.3 MgSO 4、2.5 CaCl2平衡化95%O2および5%COH(p.7)。42 2
- ペントバルビタールナトリウム塩(60mg/kg、腹腔内)でマウスを麻酔し、右反射の喪失を確認する。
- s.c. 治療の場合は、体重0.1 mL/10gの体積で、首の後部にRTX(20 μg/mL)を注入します。対照群については、同じように車両(10%エタノール、10%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレ酸塩および80%生理食い物)を注入する。
- i.c.v.治療の場合は、5 μL の RTX (20 μg/mL) を右側心室に注入します。対照群に対して、同じように車両(10%エタノール、10%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートおよび80%ACSF)を注入する。
- 使い捨ての27-G針を金属管(0.8mm I.D.)を通して針の3.0~3.5mm先端を露出させる(図1A)。
- マウスの頭部を70%アルコールで消毒し、指でマウスの扁間骨をしっかりと保持する(図1B)。
注:これらの突起は、注射のランドマークとして機能するので、スクワモサル突起の位置に注意してください。 - 頭皮の上で針を横に動かし、針の先端が縫合糸に引っ掛かるように矢状縫合を見つける。
- 先端を1mm程度右に動かしてから、先端をロストラリーに動かし、2.4.3と同様に冠状縫合糸を見つけます。(図1B)。
- 針をゆっくりと縦に挿入し、約10秒間にRTX溶液を注入し、約10秒間保持します。
- 針をゆっくり引き出し、マウスをホームケージに戻します。出血は通常最小限または不在です。大出血が起こった場合は、別のマウスの使用を考慮する必要があります。
- 前処理されたマウスをRTXテストまたはテール圧試験の被験者として割り当てます(ステップ3と4はそれぞれ)。
3. RTX テスト
注: テストは午前 10:00 から午後 5:00 の間に実行されます。試験室は200ルクスと24-26 °Cに維持されています。
- RTX(ステップ2.)による前処理の1週間後に、試験開始の少なくとも60分前にマウスを試験室に移す。
- 各マウスを個別に重量を量り、プレキシガラスケージ(29.5×17.5×13.5 cm3 の高さ)に入れて、環境に順応できるようにテストを開始する前に少なくとも30分を取ります。
注: テストの順序は、前処理グループ間で相殺する必要があります。 - 試験の20分前にマウス腹腔内にアセトアミノフェン(300mg/kg)を投与する。
- 小さな布袋にマウスをゆるく持ち、右後足のかかとに30ゲージの針を挿入します。ニードルを皮下に歩行パッドの近くに進め、20 μLのRTX溶液(0.05 μg/mL)を注入します。
- 各5分ブロックの影響を受けた足のグラブラス領域における舐め/噛み付き行動の期間を測定します。
4. テール圧力試験
注意:ランドール-セリット型圧力計は、急性機械的なノシセプションの閾値を評価するために使用されます。テストは午前 10:00 から午後 5:00 の間に実行されます。試験室は200ルクスと24-26 °Cに維持されています。
- RTX(ステップ2.)による前処理の1週間後、マウスを試験室に移し、各マウスをプレックスガラスケージに個別に計量して配置する。
- 尾の基部から1.5と2.5cmのスポットをマークします。
- 小さな布袋にマウスをゆるく持ち、鈍いプローブでスポットに圧力を加えます。
注意:250 gのカットオフ圧力はティッシュの損傷を避けるために課される。 - エスケープ動作(尾の泡立て、ねじれ、きしむ)を引き出すために必要な圧力を決定し、2つのスポットで決定された圧力を平均化することによって、ノシケイブ閾値を計算します。
- 手順 4.3 を繰り返します。4.4に。15分ごとに。
- ベースラインを得た後、アセトアミノフェン(300mg/kg)をマウス腹腔内に投与する。管理後、手順 4.3 を繰り返します。そして15分ごとに4.4。
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Representative Results
i.c.v.処理マウスは、その外観、自発的な活動、体重19 およびコア体温に明らかな異常を示さない(車両処置群、38.4±0.3°C、n=6;RTX処理基は、38.7±0.2°C、n=6)。
図2A-B-Bは、RTXの板腔内注射に対するs.c.-またはi.c.v.処置マウスの応答性を示す。車両処置マウスの舐め/噛み付き行動は、最初の10分19で顕著であった。s.c.前処理マウスは舐め/噛み付き行動を全く示さなかったが、i.c.v.前処理マウスは通常RTXの足底注入に反応した。さらに、図2Bに示すように、アセトアミノフェン(300mg/kg)の腹腔内投与は、車両i.c.v.処置マウスの舐め/噛み挙動を減少させたが、RTX-i.c.v.処置マウスの舐め行動は減少しなかった。
図2C は、尾圧試験におけるアセトアミノフェン(300mg/kg)の鎮痛効果を示す。アセトアミノフェンは、両方の試験で車両前処理マウスの可聴性応答を低下させたが、RTXで前処理されたマウスではアセトアミノフェンの鎮痛効果が阻害された。
図1:i.c.v.インジェクションの写真と概略図(A) i.c.v. 注射に使用される針。 (B) マウスの頭蓋骨のスキーマと針先の動き。スカモサルの骨は青で示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:RTXを用いてs.c.またはi.c.v.を前処理したマウスの不可解な反応。(A)s.c.前処理マウスのタイムコース(左パネル)と舐め/噛み付き行動の合計時間(右パネル)。RTXは、時間0(矢印頭で示される)で足底領域に注入された。(B)時間経過(左パネル)とi.c.v.前処理マウスの舐め/噛み付き行動の合計時間(右パネル)。アセトアミノフェン(300mg/kg)またはその車両(20%プロピレングリコール)のいずれかを、RTXの板前注射の20分前に腹腔内投与した(矢印頭で示す)。 (C) (C)i.c.v.前処置マウスの尾部における機械的疼痛閾値およびアセトアミノフェンの鎮痛効果。全てのデータは平均±SEMとして表した。各グループのマウスの数は括弧で示されています。両側のマン・ホイットニーU検定は、2つのグループのデータを比較するために使用されました。P<0.05 での違いは重要であると考えられました。AcAP, アセトアミノフェン;PG、プロピレングリコール;n.s.、重要ではありません。i.pl、板腔内注射。これらの数値は福島ら19から修正された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
これらの実験で最も重要なステップは、i.c.v. インジェクションの成功です。ここで使用される i.c.v. 射出技術は非常に簡単ですが、いくつかの練習が必要です。実験の前に、染料(例えば生理食糸で0.5%トリパンブルー)を用いて練習することをお勧めします。注射が正しく行われる場合、針マークは冠状縫合糸に明らかであり、注入された染料は対側心室と第3心室に存在するべきである。また、挿入の強制は、注射中に避けるべきである。針先が正しくコロナ縫合糸に置かれている場合、針は頭蓋骨を滑らかに貫通する必要があります。
このi.c.v.技術は、目覚め、非麻酔薬のマウスにも適用することができ、我々はこの技術23、24,24を使用して調べた薬物の急性中心効果を報告した。本手順は、カヌレーションのための特別な装置が必要としない点で有利であるが、i.c.v.注入は1回しか行われない。薬物の繰り返し投与が必要な場合は、カヌル化が必要である。
ここで示すRTXテストは、周辺TRPV133,1919の機能を評価するための使いやすいアプローチです。切欠性挙動は、1〜10 ng RTXの用量で最も顕著に観察され、カプサゼピンの共注射によって阻害され、TRPV1アンタゴニスト1919、2525である。ホルマリン試験では、いくつかのグループが実験をビデオテープで撮影するが、マウスは影響を受けた足を頭部と体で覆う傾向があるため、ポストホックの観察はしばしば困難である。そこで、実験者は、直接舐め/噛み付き行動を観察し、測定します。このシナリオでは、マウスを邪魔しないように注意する必要があります。また、疼痛検査では、マウスを十分に落ち着かせることが非常に重要です。過度に強い把持と騒がしい環境は、ストレス誘発性鎮痛を引き起こす可能性があり、不可解な反応を遅らせる可能性があります。
RTXでi.c.v.前処理されたマウスは、RTXテストおよびテール圧試験において正常な樹液化応答を示す。しかしながら、これらのマウスは、アセトアミノフェンの鎮痛作用に対して無神経であり、これは、TRPV199,1010の中枢を仲介することが示唆されている。これらの結果は、上脊髄選択的TRPV1脱感作がRTX-i.c.vで誘導できることを示唆している。マウス。TRPV1脱感作は、ア,ゴニスト,13、14、15、16、17、18の局所適用で行われているが、脊髄選択的脱感作法はまだ達成されていない。13,14,15,161718The RTX-i.c.v.ここで提示される注入の議定書は、上髄機能におけるTRPV1の役割を研究するための便利な実験モデルを提供する。
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Disclosures
著者は、宣言する利害の対立を持っていません
Acknowledgments
なし。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
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