Summary
Le récepteur transitoire potentiel de type 1 (TRPV1) dans la région supraspinale a été suggéré pour jouer certains rôles dans la fonction cérébrale. Décrit ici est un protocole pour l’injection intracerebroventriculaire de resiniferatoxin pour la désensibilisation supraspinale TRPV1 chez les souris. Des procédures pour certains tests de douleur sont également présentées.
Abstract
Le récepteur transitoire potentiel vanilloid type 1 (TRPV1), un canal thermosensible de cation, est connu pour déclencher la douleur dans les nerfs périphériques. En plus de sa fonction périphérique, sa participation aux fonctions cérébrales a également été suggérée. La resiniferatoxine (RTX), un agoniste ultrapotent TRPV1, a été connue pour induire la désensibilisation à long terme de TRPV1, et cette désensibilisation a été une approche alternative pour étudier la pertinence physiologique des cellules exprimant TRPV1. Ici, nous décrivons un protocole pour le traitement intracerebroventriculaire (c.c.v.) avec RTX chez les souris. Les procédures sont décrites pour tester la nociception à la stimulation périphérique TRPV1 (essai RTX) et la stimulation mécanique (test de pression de la queue) puis suivent. Bien que les réponses nociceptives des souris qui avaient été administrées RTX i.c.v. étaient comparables à celles des groupes témoins, les souris administrées par RTX-i.c.v.étaient insensibles à l’effet analgésique de l’acétaminophène, ce qui suggère que le traitement i.c.v. RTX peut induire une désensibilisation supraspinal-sélective TRPV1. Ce modèle de souris peut être utilisé comme un système expérimental pratique pour étudier le rôle de TRPV1 dans la fonction cérébrale/supraspinale. Ces techniques peuvent également être appliquées à des études des actions centrales d’autres médicaments.
Introduction
Les animaux reçoivent divers stimuli physiques et chimiques de leur environnement grâce à des capteurs sur les nerfs périphériques. Le récepteur transitoire potentiel vanilloid type 1 (TRPV1) est l’un des canaux thermosensibles, non sélectifs cation qui agissent comme capteurs de chaleur1,2, et l’activation et / ou la modulation de TRPV1 est connu pour être une étape clé pour la nociception dans les contextes normaux et inflammatoires3. Bien que le modèle d’expression globale soit controversé, l’expression de TRPV1 a également été suggérée dans les régions supraspinales, étant impliquée dans diverses activités de cerveau (y compris nociception4, thermorégulation5, anxiété6, trouble d’hyperactivité de déficit d’attention7, et épilepsie8). En outre, il a été récemment suggéré que l’acétaminophène, un analgésique largement utilisé, sert de médiateur à l’activation du TRPV1 central pour obtenir son action analgésique9,10.
L’administration d’un agoniste trpv1 excédentaire, y compris la capsaïcine et la résine (RTX) aux animaux conduit à la mort de neurones TRPV1 positifs et à une désensibilisation durable aux agonistesTRPV1 11,12. Combinée à l’application locale (intrathécal13,14, intracisternale15,16,17, et intraganglional18), cette approche d’ablation chimique a fourni une autre façon d’étudier les fonctions physiologiques de TRPV1. Nous avons récemment signalé que l’injection intracerebroventriculaire (c.c.v.) de RTX inhibe l’effet analgésique de l’acétaminophène chez les souris, suggérant la désensibilisation supraspinal-sélective trpv119. Dans ce manuscrit, nous présentons le protocole précis pour l’injection i.c.v. et les tests de douleur subséquents.
L’injection directe de médicaments dans les ventricules du cerveau permet d’étudier leurs effets centraux tout en minimisant les effets périphériques. La procédure d’injection i.c.v. présentée ici est une modification de la méthode rapportée par Haley et McCormick20. Cette méthode est simple impliquant l’insertion d’une aiguille d’injection dans les ventricules latéraux par la suture coronale et ne nécessite aucun équipement spécial ou des procédures chirurgicales pour la cannulation.
L’application locale périphérique des agonistes trpv1 évoque une sensation de douleur brûlante et une inflammation neurogénique. Les souris qui sont traitées systématiquement avec RTX, et les souris TRPV1-KO, sont insensibles à cette stimulation13. Nous avons effectué l’injection intraplantaire de RTX (test RTX) pour confirmer la préservation du TRPV1 périphérique dans RTX-i.c.v. Souris. Cette méthode est une modification du test de formaline classique21.
Il a été rapporté que les souris traitées systématiquement avec des souris RTX et TRPV1-KO montrent un seuil normal pour les stimuli mécaniques11,13,22. Ici, nous présentons une procédure pour le test de pression de la queue pour tester les changements dans l’effet analgésique de l’acétaminophène.
Toutes ces procédures sont orthodoxes et polyvalentes, et peuvent être appliquées à des études d’autres médicaments.
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Protocol
Tous les protocoles expérimentaux utilisés ici ont été approuvés par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Université de Musashino. Les souris mâles ddY (SLC, Shizuoka, Japon) ont été conservées pendant au moins 7 jours dans le cadre d’un cycle de 12 h de lumière/obscurité avant d’avoir des expériences avec de l’eau et des aliments ad libitum. Des souris de 5 ou 6 semaines ont été utilisées pour les expériences.
1. Préparation de médicaments
-
Rtx
REMARQUE : La solution RTX alcoolique peut causer de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires. Assurez-vous d’utiliser des gants et des lunettes en caoutchouc pour vous protéger lors de la manipulation. Cette solution stock peut être utilisée pendant 6 mois.- Ajouter 500 μL d’éthanol à 1 mg de RTX.
- Ajouter 500 μL de polyoxyéthylène (20) monooléate sorbitan à la solution ci-dessus et vortex bien.
- Ajouter 4 mL de solution saline physiologique au mélange et bien vortex.
- Aliquot 40 μL de la solution dans des tubes à vis de 1,5 m L et les stocker à -40 °C.
-
Acétaminophène
- Ajouter une solution propylèneglycol de 20 % w/v à l’acétaminophène à une concentration de 30 mg/mL, et dissoudre avec un sonicateur. Puisque l’acétaminophène peut se précipiter à température ambiante plusieurs heures après la dissolution, préparer juste avant l’utilisation ou garder la solution au chaud jusqu’à ce qu’elle soit utilisée.
2. Injection sous-cutanée ou intracerebroventriculaire de RTX
- Décongeler la solution en stock préparée en 1.1. ci-dessus et le diluer à 20 μg/mL dans le liquide céphalo-rachidien saline ou artificiel (ACSF) composé de (en mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glucose, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2 équilibré avec 95% O2 et 5% CO2 (pH 7.2).
- Anesthésiez les souris avec du sel de sodium pentobarbital (60 mg/kg, intrapéritoneally), et vérifiez la perte du réflexe de droit.
- Pour le traitement s.c., injectez rtx (20 μg/mL) dans l’arrière du cou à un volume de 0,1 mL/10 g de poids corporel. Pour le groupe témoin, injectez le véhicule (10 % d’éthanol, 10 % de polyoxyéthylène (20) de sorbitan monooléate et 80 % de solution saline) de la même manière.
- Pour le traitement i.c.v., injectez 5 μL de RTX (20 μg/mL) dans le ventricule latéral droit. Pour le groupe témoin, injectez le véhicule (10 % d’éthanol, 10 % de polyoxyéthylène (20) de sorbitan et 80 % d’ACSF) de la même manière.
- Passer une aiguille jetable de 27 G à travers un tube métallique (0,8 mm d’I.D.) pour exposer la pointe de 3,0 à 3,5 mm de l’aiguille (figure 1A).
- Désinfecter la tête de la souris avec 70% d’alcool, et tenir fermement les os squamosal de la souris avec les doigts (Figure 1B).
NOTE: Faites attention aux positions des protubérances squamosales, puisque ces protubérances serviront de repères pour l’injection. - Déplacez l’aiguille sur le cuir chevelu, et trouver la suture sagittale que la pointe de l’aiguille est accroché à la suture.
- Déplacez la pointe d’environ 1 mm vers la droite, puis déplacez la pointe rostrally, et trouver la suture coronale comme avec 2.4.3. (Figure 1B).
- Insérez l’aiguille lentement et verticalement, injectez la solution RTX en environ 10 secondes et maintenez-la pendant environ 10 secondes.
- Retirez l’aiguille lentement et retournez la souris dans sa cage. Les saignements sont généralement minimes ou absents. Si des saignements majeurs se produisent, l’utilisation d’une autre souris doit être envisagée.
- Assignez les souris prétraitées comme sujets pour le test RTX ou le test de pression de la queue (étape 3 et 4, respectivement).
3. Test RTX
REMARQUE : Les tests sont effectués entre 10h00 et 17h00. La salle d’essai est maintenue à 200 lux et 24-26 °C.
- Une semaine après les prétraitements avec RTX (étape 2.), transférer les souris à la salle d’essai au moins 60 min avant de commencer le test.
- Pesez et placez chaque souris individuellement dans une cage en plexiglas (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 hauteur) au moins 30 min avant de commencer l’essai afin de lui permettre de s’acclimater à l’environnement.
REMARQUE : L’ordre des tests doit être contrebalancé entre les groupes de prétraitement. - Administrer l’acétaminophène (300 mg/kg) à la souris intraperitoneally 20 min avant le test.
- Tenez la souris lâchement dans un petit sac en tissu et insérez une aiguille de calibre 30 dans le talon de la patte arrière droite. Avancez l’aiguille sous-cutanéement jusqu’à proximité des plaquettes de marche et injectez 20 μL de solution RTX (0,05 μg/mL).
- Mesurer la période de léchage / comportement mordant dans la région de la patte affectée dans chaque bloc de 5 minutes.
4. Essai de pression de queue
REMARQUE : Un compteur de pression de type Randall-Selitto est utilisé pour évaluer le seuil de nociception mécanique aiguë. Les tests sont effectués entre 10h00 et 17h00. La salle d’essai est maintenue à 200 lux et 24-26 °C.
- Une semaine après les prétraitements avec RTX (étape 2.), transférer les souris à la salle d’essai, et peser et placer chaque souris individuellement dans une cage en plexiglas.
- Marquer les taches à 1,5 et 2,5 cm à partir de la base de la queue.
- Tenez la souris lâchement dans un petit sac en tissu, et appliquez la pression aux taches avec une sonde émoussée.
REMARQUE : Une pression de coupure de 250 g est imposée pour éviter les dommages tissulaires. - Déterminez la pression requise pour provoquer un comportement d’échappement (fouet, torsion et grincement de queue) et calculez le seuil nociceptif en faisant la moyenne de la pression déterminée aux deux endroits.
- Répétez les étapes 4.3. à 4.4. toutes les 15 minutes.
- Après avoir obtenu la ligne de base, administrer l’acétaminophène (300 mg/kg) à la souris intraperitoneally. Après l’administration, répétez les étapes 4.3. et 4,4 toutes les 15 minutes.
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Representative Results
Les souris traitées par c.c.v. ne présentent aucune anomalie apparente dans leur apparence, leurs activités spontanées, leur poids corporel19 et leur température corporelle (groupe traité par le véhicule, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; Groupe traité par RTX, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).
Figure 2A-B montre la réactivité des souris traitées par s.c.- ou c.c.v. à l’injection intraplantaire de RTX. Le comportement de léchage/morsure des souris traitées par véhicule était remarquable dans les 10 premières minutes19. Bien que les souris prétraitées par le s.c. n’aient pas montré le comportement de léchage/morsure du tout, les souris prétraitées i.c.v.ont normalement répondu à l’injection plantaire de RTX. De plus, comme le montre la figure 2B,l’administration intrapéritonéale de l’acétaminophène (300 mg/kg) a réduit le comportement de léchage/morsure des souris traitées par véhicule i.c.v., mais pas celle des souris traitées par RTX-i.c.v..
La figure 2C montre les effets analgésiques de l’acétaminophène (300 mg/kg) dans le test de pression de la queue. L’acétaminophène a réduit la réponse nociceptive des souris prétraitées dans les deux essais, mais les effets analgésiques de l’acétaminophène ont été inhibés chez les souris qui ont été prétraitées i.c.v. avec RTX.
Figure 1 : Vues photographiques et schématiques de l’injection d’i.c.v. (A) Aiguille utilisée pour l’injection par c.c. (B) Schéma du crâne de la souris et le mouvement de la pointe de l’aiguille. Les os squamosal sont représentés en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Réponses nociceptives de souris qui ont été prétraitées s.c. ou i.c.v. avec RTX. (A) Cours de temps (panneau gauche) et temps total de léchage/comportement mordant (panneau droit) de souris prétraitées. RTX a été injecté dans la zone plantaire au moment zéro (indiqué par la tête de flèche). (B) Cours de temps (panneau gauche) et temps total de léchage/comportement mordant (panneau droit) de souris prétraitées par i.c.v.. Soit l’acétaminophène (300 mg/kg) ou son véhicule (20% de propylèneglycol) a été administré intrapéritoneally 20 min avant l’injection intraplantaire de RTX (indiqué par la tête de flèche). (C) Seuil de douleur mécanique dans la queue des souris prétraitées par i.c.v. et l’effet analgésique de l’acétaminophène. Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± SEM. Le nombre de souris dans chaque groupe est indiqué entre parenthèses. Le test U Mann-Whitney à deux queues a été utilisé pour comparer les données de deux groupes. Les différences à P<0,05 ont été considérées comme significatives. AcAP, acétaminophène; PG, propylèneglycol; n.s., non significatif; i.pl., injection intraplantaire. Ces chiffres ont été modifiés à partir de Fukushima et al19. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’étape la plus critique de ces expériences est le succès de l’injection d’i.c.v. La technique d’injection i.c.v. utilisée ici est assez simple mais nécessite une certaine pratique. Avant les expériences, la pratique avec des colorants (p. ex. 0,5 % de bleu trypan en solution saline) est recommandée. Si l’injection est effectuée correctement, une marque d’aiguille doit être évidente sur la suture coronale et le colorant injecté doit être présent dans le ventricule contralatéral et le troisième ventricule. En outre, l’insertion forcée doit être évitée pendant l’injection. Si la pointe de l’aiguille est correctement placée sur la suture coronale, l’aiguille doit pénétrer le crâne en douceur.
Cette technique i.c.v. peut également être appliquée aux souris éveillées et non anesthésiées, et nous avons signalé les effets centraux aigus des médicaments examinés à l’aide de cette technique23,24. Bien que la procédure actuelle soit avantageuse en ce qu’aucun équipement spécial pour la cannulation n’est nécessaire, l’injection i.c.v. ne peut être effectuée qu’une seule fois. Si une administration répétée de médicaments est nécessaire, la cannulation est nécessaire.
Le test RTX présenté ici est une approche facile à utiliser pour évaluer la fonction du périphérique TRPV13,19. Le comportement nociceptif peut être observé le plus en évidence à une dose de 1-10 ng RTX et inhibé par la co-injection de capsazepine, un antagoniste TRPV119,25. Dans le test de formaline, certains groupes enregistrent les expériences, mais l’observation post-hoc est souvent difficile parce que les souris ont tendance à couvrir la patte affectée avec la tête et le corps. Par conséquent, les expérimentateurs de notre laboratoire observent et mesurent directement le comportement léchant/mordant. Dans ce scénario, il faut prendre soin de ne pas déranger les souris. En outre, dans les tests de douleur, il est très important de calmer suffisamment la souris. Une préhension excessivement forte et un environnement bruyant pourraient produire une analgésie induite par le stress et retarder la réponse nociceptive.
Les souris qui sont prétraitées par i.c.v. avec RTX montrent une réponse nociceptive normale dans le test RTX et le test de pression de la queue. Cependant, ces souris sont insensibles aux effets analgésiques de l’acétaminophène, qui a été suggéré pour médiation centrale TRPV19,10. Ces résultats suggèrent que la désensibilisation supraspinal-sélective trpv1 peut être induite dans RTX-i.c.v. Souris. Bien que la désensibilisation TRPV1 ait été effectuée avec l’application locale des agonistes13,14,15,16,17,18, la désensibilisation supraspinal-sélective n’a pas encore été réalisée. Le RTX-i.c.v. les protocoles d’injection présentés ici fourniront un modèle expérimental pratique pour étudier le rôle de TRPV1 dans la fonction supraspinale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à déclarer
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
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