Summary
수프라스피날 영역에서 일시적인 수용체 잠재적 인 바닐라 노이드 유형 1 (TRPV1)은 뇌 기능에 있는 몇몇 역할을 하기 위하여 건의되었습니다. 여기에 설명된 마우스에서 수지 척추 TRPV1 둔감화를 위한 수지성 관절 의 주입을 위한 프로토콜이 설명되어 있다. 일부 통증 검사에 대한 절차도 제시됩니다.
Abstract
과도 수용체 잠재적 인 바닐라노이드 유형 1 (TRPV1), 열민감성 양이온 채널, 말초 신경에 통증을 트리거하는 것으로 알려져있다. 주변 기능 외에도 뇌 기능에 대한 참여도 제안되었습니다. 수지압창신(RTX)은 TRPV1의 장기 둔감화를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 둔감은 TRPV1 표현 세포의 생리적 관련성을 조사하기 위한 대안적인 접근법이었다. 여기에서 우리는 마우스에 있는 RTX를 가진 intracerebroventricular (i.c.v.) 처리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 절차는 주변 TRPV1 자극 (RTX 테스트) 및 기계적 자극 (꼬리 압력 테스트)에 고드름을 테스트하기 위해 설명된 다음 다음과 같습니다. RTX i.c.v.를 투여한 마우스의 단각 반응은 대조군의 반응과 비교할 수 있었지만, RTX-i.c.v.-투여된 마우스는 아세트아미노펜의 진통 효과에 민감하지 않았으며, i.c.v. RTX 치료가 수척추 선택적 TRPV1 desensit화를 유도할 수 있음을 시사한다. 이 마우스 모델은 뇌/수피척추 기능에서 TRPV1의 역할을 연구하기 위한 편리한 실험 시스템으로 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 또한 다른 약물의 중심 행동의 연구에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
동물은 말초 신경에 센서를 통해 자신의 환경에서 다양한 물리적 및 화학 자극을받습니다. 과도 수용체 전위 바노이드 타입 1(TRPV1)은 열 센서1,2,2및 TRPV1의 활성화 및/또는 변조역할을 하는 열민감성 비선택적 양이온 채널 중 하나이며 정상 및 염증성 문맥3모두에서 노치프션을 위한 핵심 단계로 알려져 있다. 전반적인 발현 패턴은 논란의 여지가 있지만, TRPV1의 발현은 또한 다양한 뇌 활동(nociception4,온도 조절5,불안6,주의력 결핍 과잉 행동 장애7및 간질8)에관여하는 등 다양한 뇌 활동에 관여하는 등 초라척추 지역에서도 제안되고 있다. 더욱이, 최근에는 널리 사용되는 진통제인 아세트아미노펜이 중앙 TRPV1의 활성화를 중재하여 진통 작용9,,10을유도하는 것이 제안되고 있다.
동물에 대한 캡사이신 및 수지독소(RTX)를 포함한 과잉 TRPV1 작용제의 투여는 TRPV1 양성 뉴런의 죽음과 TRPV1 작용제에 대한 장기간 둔감화를 초래한다11,,12. 국소 적용(인트라더칼13,,14,인종 차별성15,,16, 17,및 및 대간절내18)과결합된 이 화학 절제 접근법은 TRPV1의 생리적 기능을 조사하는 대안을 제공하고 있다.17 우리는 최근에 RTX의 intracerebroventricular (즉, v.) 주사가 마우스에서 아세트아미노펜의 진통 효과를 억제한다는 것을 보고했으며, 이는 수프라스피날 선택적 TRPV1 둔감화19를시사한다. 이 원고에서는 i.c.v. 주입 및 후속 통증 검사를 위한 정확한 프로토콜을 제시합니다.
뇌의 심실로 약물을 직접 주입하면 주변 효과를 최소화하면서 중앙 효과를 연구 할 수 있습니다. 여기에 제시된 i.c.v. 주입 절차는 헤일리와맥코믹(20)에의해 보고된 방법의 수정이다. 이 방법은 관상 봉합사를 통해 측면 심실에 주입 바늘을 삽입하는 것을 포함하고 수통을 위한 특별한 장비 또는 외과 적 절차를 필요로하지 않습니다.
TRPV1 작용제의 주변 지역 응용 프로그램은 불타는 통증 감각과 신경 유발 염증을 불러 일으킵니다. RTX및 TRPV1-KO 마우스로 체계적으로 처리되는 마우스는, 이자극(13)에민감하지 않습니다. 우리는 RTX-i.c.v에서 주변 TRPV1의 보존을 확인하기 위해 RTX (RTX 테스트)의 인트라 플라네타르 주입을 수행했습니다. 마우스. 이 방법은 종래의 포르말린시험(21)을수정하는 것이다.
RTX와 TRPV1-KO 마우스로 체계적으로 처리된 마우스가 기계적자극(11,13,22)에대한 정상임계값을나타낸다는것이 보고되었다. 여기서 우리는 아세트 아미노펜의 진통 효과의 변화를 테스트하기위한 꼬리 압력 테스트 절차를 제시한다.
이러한 절차의 모든 정통 하 고 다양 한, 그리고 다른 약물의 연구에 적용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 사용되는 모든 실험 프로토콜은 무사시노 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. 수컷 ddY 마우스(SLC, 시즈오카, 일본)는 물과 음식 광고 리비툼을 실험하기 전에 12h 빛/어두운 주기하에서 적어도 7일 동안 보관하였다. 5-6주 된 마우스는 실험을 위해 사용되었다.
1. 마약 제제
-
Rtx
참고: 알코올 RTX 용액은 심한 피부 화상과 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 취급 시 보호하려면 고무 장갑과 안경을 사용해야 합니다. 이 스톡 솔루션은 6 개월 동안 사용할 수 있습니다.- RTX 의 1 mg에 에탄올의 500 μL을 추가합니다.
- 위의 용액에 폴리옥세틸렌(20)의 500 μL을 추가하고 소용돌이를 잘 피하십시오.
- 혼합물과 소용돌이에 생리식염수 4mL를 잘 넣습니다.
- 용액의 Aliquot 40 μL은 1.5mL 나사 캡 튜브로 저장하여 -40 °C에 저장합니다.
-
아 세트 아미노 펜
- 30 mg /mL의 농도에서 아세트 아미노펜에 20 % w / v propyleneglycol 솔루션을 추가하고 초음파 처리기로 용해하십시오. 아세트아미노펜은 용해 후 몇 시간 후에 실온에서 침전될 수 있으므로 사용 직전에 준비하거나 사용전까지 용액을 따뜻하게 유지하십시오.
2. RTX의 피하 또는 무산성 주입
- 1.1에서 준비된 재고 용액을 해동합니다. 상기 및 식염수 또는 인공 뇌척수액(ACSF)으로 구성된 20 μg/mL(mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4,26 NaHCO3,11 포도당, 1.3 MgSO4,2.5 CaCl2p를 95% O2및 2.2%로2 희석시켰다.
- 펜토바르비탈 나트륨 소금 (60 mg/kg, 인과시간)으로 마우스를 마취하고 오른쪽 반사반사의 손실을 확인합니다.
- s.c. 치료를 위해 0.1 mL/10g의 체적으로 목 뒤쪽에 RTX(20 μg/mL)를 주입하십시오. 대조군의 경우, 차량(10% 에탄올, 10% 폴리옥세틸렌(20) 소비탄 모노올레네이트 및 80% 식염수를 같은 방식으로 주입한다.
- i.c.v. 치료를 위해 오른쪽 측면 심실에 RTX(20 μg/mL)의 5μL을 주입하십시오. 대조군의 경우, 차량(10% 에탄올, 10% 폴리옥세틸렌(20) 소비탄 모노올레네이트 및 80% ACSF를 같은 방식으로 주입한다.
- 일회용 27G 바늘을 금속 튜브(0.8mm I.D.)를 통과하여 바늘의 3.0-3.5 mm 끝을 노출시다(도1A).
- 마우스의 머리를 70% 알코올로 소독하고 손가락으로 마우스의 스쿼모살 뼈를 단단히 고정시다(도1B).
참고: 이러한 돌출이 주입의 랜드마크역할을 하기 때문에 스쿼모살 돌출의 위치에 주의를 기울이세요. - 바늘을 두피에 측면으로 옮기고 바늘 끝이 봉합사에 매여 있는 동안 처진 봉합사를 찾습니다.
- 팁을 오른쪽으로 약 1mm 이동한 다음 팁을 rostrally로 이동한 다음 2.4.3과 마찬가지로 관상 봉합사를 찾습니다. (그림1B).
- 바늘을 천천히 수직으로 삽입하고 RTX 용액을 약 10초 만에 주입하고 약 10초 동안 보관합니다.
- 바늘을 천천히 철회하고 마우스를 홈 케이지로 돌려놓습니다. 출혈은 일반적으로 최소또는 결석입니다. 주요 출혈이 발생하면 다른 마우스를 사용하는 것이 고려해야 합니다.
- RTX 테스트 또는 꼬리 압력 테스트(각각 3단계 및 4단계)를 위한 피험자로 전처리된 마우스를 할당합니다.
3. RTX 테스트
참고: 테스트는 오전 10:00에서 오후 5:00 사이에 수행됩니다. 시험실은 200럭스와 24-26°C로 유지됩니다.
- RTX (단계 2.)로 사전 치료 후 1 주일, 테스트를 시작하기 전에 적어도 60 분 시험실로 마우스를 전송.
- 무게를 측정하고 환경에 적응할 수 있도록 테스트를 시작하기 전에 적어도 30 분 전에 플렉시 유리 케이지 (29.5 × 17.5 × 13.5 cm높이)에 각 마우스를 개별적으로 배치합니다.
참고: 시험순서는 전처리군에서 균형을 유지해야 합니다. - 아세트아미노펜을 투여(300 mg/kg) 마우스에 20분 전에 시험전에 투여한다.
- 마우스를 작은 천 가방에 느슨하게 넣고 오른쪽 뒷발의 발 뒤꿈치에 30 게이지 바늘을 삽입합니다. 바늘을 보행 패드 근처로 피하로 진행하고 20 μL의 RTX 용액(0.05 μg/mL)을 주입한다.
- 각 5분 블록에서 영향을 받는 발의 글래브로스 영역에서 핥기/물기 동작의 기간을 측정합니다.
4. 꼬리 압력 테스트
참고: 랜달 셀리토 형 압력 계는 급성 기계적 고치에 대한 임계 값을 평가하는 데 사용됩니다. 테스트는 오전 10:00에서 오후 5:00 사이에 수행됩니다. 시험실은 200럭스와 24-26°C로 유지됩니다.
- RTX (단계 2.)로 사전 치료 후 1 주일 후, 시험실로 마우스를 전송하고, 무게와 플렉시 글라스 케이지에 개별적으로 각 마우스를 배치합니다.
- 꼬리 의 기지에서 1.5 및 2.5cm에서 반점을 표시합니다.
- 마우스를 작은 천 가방에 느슨하게 잡고 무딘 프로브로 반점에 압력을 가합니다.
참고: 조직 손상을 피하기 위해 250g의 차단 압력이 부과됩니다. - 탈출 동작(꼬리 휘젓기, 비틀림 및 삐걱거리는 소리)을 유도하는 데 필요한 압력을 결정하고 두 지점에서 결정된 압력을 평균화하여 향각 임계값을 계산합니다.
- 4.3 단계를 반복합니다. 4.4. 매 15분마다.
- 기준선을 얻은 후, 아세트아미노펜(300 mg/kg)을 마우스 내역으로 투여한다. 투여 후 4.3 단계를 반복합니다. 15분마다 4.4.
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Representative Results
i.c.v.-treated 마우스는 외모, 자발적활동, 체중19 및 코어 체온(차량 처리군, 38.4±0.3°C, n=6; RTX 처리 군, 38.7 ± 0.2 °C, n = 6).
도2A-B는 RTX의 인트라플라터 주입에 s.c.- 또는 i.c.v.-treated 마우스의 반응성을 나타낸다. Figure 2A 차량 처리 마우스의 핥기/물기 동작은 처음 10 분19에서현저했습니다. s.c.-전처리된 마우스는 핥기/물기 행동을 전혀 보여주지 않았지만, i.c.v.-전처리된 마우스는 일반적으로 RTX의 발바닥 주입에 반응했습니다. 더욱이, 도 2B에도시된 바와 같이, 아세트아미노펜(300 mg/kg)의 복막 투여는 차량-i.c.v.-treated 마우스의 핥기/물기 거동을 감소시키지만 RTX-i.c.v.-치료마우스의 것은 아니었다.
도 2C는 꼬리 압력 테스트에서 아세트아미노펜(300 mg/kg)의 진통 효과를 나타낸다. 아세트아미노펜은 두 테스트에서 차량 전처리 된 마우스의 결각 반응을 감소시켰지만, 아세트아미노펜의 진통 효과는 RTX로 전처리 된 마우스에서 억제되었다.
그림 1: i.c.v. 주사의 사진 및 회로도 보기. (A) 주사에 사용되는 바늘. (B) 마우스 두개골의 스키마와 바늘 끝의 움직임. 스쿼모살 골격은 파란색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: RTX를 통해 s.c. 또는 i.c.v.를 전처리한 마우스의 흉부 반응. (A) 시간 과정 (왼쪽 패널) 및 s.c.-전처리 된 마우스의 핥기 / 물기 동작 (오른쪽 패널)의 총 시간. RTX는 시간 제로 (화살표 머리에 의해 표시)에 발바닥 영역에 주입되었다. (B) 시간 과정 (왼쪽 패널) 및 핥기 / 물기 동작의 총 시간 (오른쪽 패널) i.c.v.-전처리 된 마우스. 아세트아미노펜(300 mg/kg) 또는 차량(20% propyleneglycol)은 RTX의 인트라플라터 주입 전에 20분 간 관리되었다(화살표 헤드로 표시). (C) i.c.v.-전처리된 마우스의 꼬리에 기계적 통증 임계값과 아세트아미노펜의 진통 효과. 모든 데이터는 평균 ±SEM으로 표현되었다. 각 군에서 마우스의 수는 괄호안에 나타난다. 두 꼬리만-휘트니 U-테스트는 두 그룹의 데이터를 비교하는 데 사용되었습니다. P&0.05의 차이는 중요한 것으로 간주되었습니다. P AcAP, 아세트아미노펜; PG, 프로피들리콜; n.s., 중요하지 않습니다. i.pl., 인트라 플라네타르 주입. 이 수치는 후쿠시마 외19에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이러한 실험에서 가장 중요한 단계는 i.c.v. 주입의 성공입니다. 여기에 사용되는 i.c.v. 주입 기술은 매우 간단하지만 몇 가지 연습이 필요합니다. 실험 전에염료(예: 식염수의 0.5% 트라이팬 블루)를 사용해 보세요. 주사가 올바르게 수행되는 경우, 바늘 마크는 관상 봉합사에 분명해야하며 주입 된 염료는 금방 심실및 세 번째 심실에 존재해야합니다. 또한 주입 중에 강제 삽입을 피해야합니다. 바늘 끝이 관상 봉합사에 올바르게 놓이면 바늘이 두개골을 부드럽게 관통해야합니다.
이러한 i.c.v. 기술은 또한 깨어 있는 비 마취 마우스에 적용될 수 있으며, 우리는 이 기술을 사용하여 검사된 약물의 급성 중앙 효과를보고하였다(23,,24). 본 절차는 캐닝을 위한 특별한 장비가 필요하지 않다는 점에서 유리하지만, i.c.v. 사출은 한 번만 수행될 수 있다. 약물의 반복 투여가 필요한 경우, 캐니언이 필요합니다.
여기에 제시된 RTX 테스트는 주변 TRPV13,,19의기능을 평가하기 위한 사용하기 쉬운 접근 방식입니다. Nociceptive 거동은 1-10 ng RTX의 투여량에서 가장 두드러게 관찰될 수 있으며, TRPV1 길항제19,,25의캡사제핀의 공동 주입에 의해 억제될 수 있다. 포르말린 시험에서 일부 그룹 비디오 테이프 실험, 하지만 마우스가 머리와 몸으로 영향을 받는 발을 커버 하는 경향이 있기 때문에 포스트 혹 관찰은 종종 어렵다. 따라서 실험실의 실험자는 핥기 / 물기 동작을 직접 관찰하고 측정합니다. 이 시나리오에서는 마우스를 방해하지 않도록주의를 기울여야합니다. 또한 통증 테스트에서 마우스를 충분히 진정시키는 것이 매우 중요합니다. 지나치게 강한 그립과 시끄러운 환경은 스트레스 유발 진통을 생성하고 향각 반응을 지연시킬 수 있습니다.
RTX로 전처리된 마우스는 RTX 테스트 및 꼬리 압력 테스트에서 정상적인 향응을 나타낸다. 그러나, 이들 마우스는 중앙 TRPV19,,10을중재하기 위해 제안된 아세트아미노펜의 진통 효과에 민감하지 않습니다. 이러한 결과는 Supraspinal 선택적 TRPV1 둔감화가 RTX-i.c.v에서 유도될 수 있음을 시사한다. 마우스. TRPV1 둔감은 작용제13,,,14,15,,16,,17,18,수프라스피날 선택적 둔감증의 국부 적용으로 수행되었지만 아직 달성되지 않았다., The RTX-i.c.v. 여기에 제시된 주입 프로토콜은 척추 기능에서 TRPV1의 역할을 연구하기위한 편리한 실험 모델을 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
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