Summary
De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1) in de supraspinale regio is voorgesteld om een aantal rollen te spelen in de hersenfunctie. Hier beschreven is een protocol voor intracerebroventriculaire injectie van harsatoxine voor supraspinale TRPV1 desensibilisatie bij muizen. Procedures voor sommige pijntests worden ook gepresenteerd.
Abstract
De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1), een thermogevoelig kation kanaal, is bekend dat pijn in de perifere zenuwen trigger. Naast de perifere functie, zijn betrokkenheid bij hersenfuncties is ook gesuggereerd. Resiniferatoxine (RTX), een ultrapotente TRPV1 agonist, is bekend dat langdurige desensibilisatie van TRPV1 induceren, en deze desensibilisatie is een alternatieve aanpak geweest voor het onderzoeken van de fysiologische relevantie van TRPV1-uitdrukkende cellen. Hier beschrijven we een protocol voor intracerebroventriculaire (i.c.v.) behandeling met RTX in muizen. Procedures worden beschreven voor het testen van nociception aan perifere TRPV1 stimulatie (RTX test) en mechanische stimulatie (staart druk test) dan volgen. Hoewel de nociceptieve reacties van muizen die RTX i.c.v. toegediend waren vergelijkbaar waren met die van de controlegroepen, waren RTX-i.c.v.-toegediende muizen ongevoelig voor het pijnstillende effect van paracetamol, wat suggereert dat i.c.v. RTX-behandeling supraspinale selectieve TRPV1-desensibilisatie kan veroorzaken. Dit muismodel kan worden gebruikt als een handig experimenteel systeem voor het bestuderen van de rol van TRPV1 in de hersenen / supraspinale functie. Deze technieken kunnen ook worden toegepast op studies van de centrale acties van andere geneesmiddelen.
Introduction
Dieren krijgen verschillende fysieke en chemische stimuli uit hun omgeving via sensoren op de perifere zenuwen. De voorbijgaande receptor potentieel vanilloid type 1 (TRPV1) is een van de thermogevoelige, niet-reflecterende kanalen die fungeren als warmtesensoren1,2, en activering en / of modulatie van TRPV1 staat bekend als een belangrijke stap voor nociception in zowel normale als inflammatoire contexten3. Hoewel het algemene expressiepatroon controversieel is, is ook de expressie van TRPV1 voorgesteld in suprachirurgische regio's, waarbij het betrokken is bij verschillende hersenactiviteiten (waaronder nociception4, thermoregulatie5, angst6, attention deficit hyperactivity disorder7en epilepsie8). Bovendien is onlangs gesuggereerd dat paracetamol, een veelgebruikte pijnstiller, bemiddelt de activering van centrale TRPV1 om zijn pijnstillende werking9,10uit te lokken .
Toediening van overtollige TRPV1 agonist met inbegrip van capsaïcine en harsiferatoxine (RTX) aan dieren leidt tot de dood van TRPV1-positieve neuronen en langdurige desensibilisatie van TRPV1 agonisten11,12. In combinatie met de lokale toepassing (intrathecal13,14, intracisternal15,16,17, en intraganglional18)heeft deze chemische ablatiebenadering een alternatieve manier geboden om de fysiologische functies van TRPV1 te onderzoeken. We hebben onlangs gemeld dat intracerebroventriculaire (i.c.v.) injectie van RTX het pijnstillende effect van paracetamol bij muizen remt, wat suggereert supraspinal-selectieve TRPV1 desensibilisatie19. In dit manuscript presenteren we het precieze protocol voor i.c.v. injectie en daaropvolgende pijntests.
Directe injectie van drugs in de ventrikels van de hersenen maakt het mogelijk om hun centrale effecten te bestuderen terwijl het minimaliseren van eventuele perifere effecten. De i.c.v. injectieprocedure die hier wordt gepresenteerd is een wijziging van de methode die door Haley en McCormick20wordt gerapporteerd. Deze methode is eenvoudig met het inbrengen van een injectienaald in de laterale ventrikels door de coronale hechting en vereist geen speciale apparatuur of chirurgische ingrepen voor cannulation.
Perifere lokale toepassing van TRPV1 agonisten roept een brandend pijngevoel en neurogene ontsteking op. Muizen die systemisch worden behandeld met RTX en TRPV1-KO muizen, zijn ongevoelig voor deze stimulatie13. We hebben intraplantar injectie van RTX (RTX test) uitgevoerd om het behoud van de perifere TRPV1 in RTX-i.c.v. te bevestigen. Muizen. Deze methode is een wijziging van de conventionele formaline test21.
Er is gemeld dat muizen systemisch behandeld met RTX en TRPV1-KO muizen een normale drempel tonen voor mechanische stimuli11,13,22. Hier presenteren we een procedure voor de staartdruktest voor het testen van veranderingen in het pijnstillende effect van paracetamol.
Al deze procedures zijn orthodox en veelzijdig, en kan worden toegepast op studies van andere drugs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele protocollen die hier werden gebruikt werden goedgekeurd door het Comité voor dierverzorging en gebruik van de Musashino Universiteit. Mannelijke ddY muizen (SLC, Shizuoka, Japan) werden bewaard voor ten minste 7 dagen onder een 12-h licht / donker cyclus voor experimenten met water en voedsel ad libitum. Voor de experimenten werden 5- of 6 weken oude muizen gebruikt.
1. Bereiding van drugs
-
RTX
OPMERKING: De alcoholische RTX-oplossing kan ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Zorg ervoor dat u rubberen handschoenen en glazen te gebruiken voor bescherming bij het hanteren. Deze voorraadoplossing kan 6 maanden gebruikt worden.- Voeg 500 μL ethanol toe aan 1 mg RTX.
- Voeg 500 μL polyoxyethyleen (20) sorbitan monooleaat toe aan de oplossing boven en vortex goed.
- Voeg 4 mL fysiologische zoutoplossing toe aan het mengsel en de vortex.
- Aliquot 40 μL van de oplossing in 1,5 mL schroefdopbuizen en bewaar ze op -40 °C.
-
Acetaminophen
- Voeg 20% w/v propyleneglycoloplossing toe aan paracetamol bij een concentratie van 30 mg/mL en los op met een sonicator. Aangezien paracetamol kan neerslaan bij kamertemperatuur enkele uren na de ontbinding, bereid je vlak voor gebruik of houd de oplossing warm tot gebruik.
2. Onderhuidse of Intracerebroventriculaire injectie van RTX
- Ontdooi de gevulde oplossing bereid in 1.1. boven en verdun het tot 20 μg/mL in zout- of kunstmatige hersenvocht (ACSF) bestaande uit (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glucose, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2 in evenwicht met 95% O2 en 5% CO2 (pH 7.2).
- Verdoven muizen met pentobarbitaal natriumzout (60 mg/kg, intraperitoneally), en controleer op verlies van de rechterreflex.
- Voor s.c. behandeling injecteer u DE RTX (20 μg/mL) in de achterkant van de nek bij een volume van 0,1 mL/10 g lichaamsgewicht. Voor de controlegroep injecteer u het voertuig (10% ethanol, 10% polyoxyethyleen (20) sorbitan monooleaat en 80% zoutoplossing) op dezelfde manier.
- Voor i.c.v. behandeling injecteer u 5 μL RTX (20 μg/mL) in de rechter zijkamer. Voor de controlegroep injecteer u het voertuig (10% ethanol, 10% polyoxyethyleen (20) sorbitan monooleaat en 80% ACSF) op dezelfde manier.
- Geef een wegwerpnaald van 27 G door een metalen buis (0,8 mm I.D.) om de 3,0-3,5 mm punt van de naald bloot te leggen(figuur 1A).
- Desinfecteer het hoofd van de muis met 70% alcohol en houd de squamosale botten van de muis stevig vast met de vingers(figuur 1B).
OPMERKING: Let op de posities van de squamosale uitsteeksels, omdat deze uitsteeksels zullen dienen als oriëntatiepunten voor injectie. - Beweeg de naald lateraal op de hoofdhuid, en vind de sagittale hechting als de naald tip is verslaafd aan de hechting.
- Beweeg de tip ongeveer 1 mm naar rechts, beweeg de tip rostrally, en vind de coronale hechting als met 2.4.3. (Figuur 1B).
- Steek de naald langzaam en verticaal, injecteer de RTX-oplossing in ongeveer 10 seconden en houd deze ongeveer 10 seconden vast.
- Trek de naald langzaam, en de muis terug te keren naar zijn huis kooi. Bloeden is meestal minimaal of afwezig. Als er ernstige bloedingen optreden, moet het gebruik van een andere muis worden overwogen.
- Wijs de voorbehandelde muizen toe als proefpersoon voor de RTX-test of de staartdruktest (respectievelijk stap 3 en 4).
3. RTX-test
LET OP: De tests worden uitgevoerd tussen 10:00 en 17:00 uur. De testruimte wordt onderhouden op 200 lux en 24-26 °C.
- Een week na voorbehandelingen met RTX (Stap 2.) breng je muizen minstens 60 minuten voor aanvang van de test naar de testruimte.
- Weeg en plaats elke muis afzonderlijk in een plexiglas kooi (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 hoogte) ten minste 30 minuten voorafgaand aan het starten van de test om het mogelijk te maken om te acclimatiseren aan het milieu.
OPMERKING: De volgorde van de tests moet worden gecompenseerd tussen voorbehandelingsgroepen. - 20 minuten voor de test paracetamol (300 mg/kg) toe te dienen aan de muis.
- Houd de muis losjes in een kleine doek zak, en steek een 30-gauge naald in de hiel van de rechter achterpoot. Breng de naald onderhuids naar de buurt van de looppads en injecteer 20 μL RTX-oplossing (0,05 μg/mL).
- Meet de periode van likken / bijten gedrag in theglabrous regio van de getroffen poot in elk 5-min blok.
4. Staartdruktest
OPMERKING: Een Randall-Selitto-type drukmeter wordt gebruikt om de drempel voor acute mechanische nociception te beoordelen. De tests worden uitgevoerd tussen 10:00 en 17:00 uur. De testruimte wordt onderhouden op 200 lux en 24-26 °C.
- Een week na voorbehandelingen met RTX (Stap 2.), breng je muizen naar de testruimte en weeg en plaats je elke muis individueel in een plexiglas kooi.
- Markeer de vlekken op 1,5 en 2,5 cm van de voet van de staart.
- Houd de muis losjes in een kleine doek zak, en druk uitoefenen op de vlekken met een stompe sonde.
OPMERKING: Er wordt een cutoff-druk van 250 g opgelegd om weefselschade te voorkomen. - Bepaal de druk die nodig is om ontsnappen gedrag uit te lokken (staart kloppen, draaien, en piepen), en bereken de nociceptive drempel door het gemiddelde van de druk bepaald op de twee plekken.
- Herhaal stap 4.3. tot 4.4. elke 15 minuten.
- Na het verkrijgen van de basislijn, toedien paracetamol (300 mg/kg) aan de muis intraperitoneally. Herhaal na toediening stap 4.3. en 4,4 per 15 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De i.c.v.-behandelde muizen vertonen geen zichtbare afwijkingen in hun uiterlijk, spontane activiteiten, lichaamsgewicht19 en kernlichaamstemperatuur (met voertuigen behandelde groep, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; MET RTX behandelde groep, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).
Figuur 2A-B toont de responsiviteit van s.c.- of i.c.v.-behandelde muizen op de intraplantar-injectie van RTX. Het likken/ bijten gedrag van voertuig-behandelde muizen was opmerkelijk in de eerste 10 min19. Hoewel de voorbehandelde muizen helemaal geen likgedrag vertoonden, reageerden de i.c.v.-voorbehandelde muizen normaal gesproken op de plantaire injectie van RTX. Bovendien, zoals blijkt uit figuur 2B,verminderde de intraperitoneale toediening van paracetamol (300 mg/kg) het likgedrag van met voertuigen i.c.v.behandelde muizen, maar niet dat van met RTX-i.c.v.v.-behandelde muizen.
Figuur 2C toont de pijnstillende effecten van paracetamol (300 mg/kg) in de staartdruktest. Paracetamol verminderde de nociceptieve respons van voorbehandelde muizen in beide tests, maar de pijnstillende effecten van paracetamol werden geremd bij muizen die voorbehandeld waren i.c.v. met RTX.
Figuur 1: Fotografische en schematische weergaven van i.c.v. injectie. (A) Naald gebruikt voor i.c.v. injectie. (B) Schema van de muizenschedel en de beweging van de naaldpunt. Squamosale botten worden blauw weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Nociceptive reacties van muizen die voorbehandeld waren met RTX of I.c.v. (A) Tijdcursus (linkerpaneel) en totale tijd van likken/bijten gedrag (rechterpaneel) van s.c.-gepederde muizen. RTX werd geïnjecteerd in de plantaire gebied op tijd nul (aangegeven door pijlkop). (B) Tijdcursus (linkerpaneel) en totale tijd van likken/bijten gedrag (rechterpaneel) van i.c.v.-voorbehandelde muizen. Paracetamol (300 mg/kg) of het voertuig (20% propyleenglycol) werd intraperimonaal toegediend 20 min voor intraplantar injectie van RTX (aangegeven door pijlkop). (C) Mechanische pijndrempel in de staart van i.c.v.-voorbehandelde muizen en het pijnstillende effect van paracetamol. Alle gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. Het aantal muizen in elke groep wordt tussen haakjes weergegeven. De twee-tailed Mann-Whitney U-test werd gebruikt om de gegevens voor twee groepen te vergelijken. De verschillen bij P<0,05 werden als significant beschouwd. AcAP, paracetamol; PG, propyleneglycol; n.s., niet significant; i.pl., intraplantar injectie. Deze cijfers zijn gewijzigd van Fukushima etal. 19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stap in deze experimenten is het succes van de i.c.v. injectie. De i.c.v. injectietechniek die hier wordt gebruikt is vrij eenvoudig maar vereist wat oefening. Voorafgaand aan experimenten wordt de praktijk met kleurstoffen (bijvoorbeeld 0,5% trypanblauw in zoutoplossing) aanbevolen. Als de injectie correct wordt uitgevoerd, moet een naaldteken zichtbaar zijn op de coronale hechting en moet de geïnjecteerde kleurstof aanwezig zijn in de contralaterale ventrikel en de derde ventrikel. Bovendien moet het inbrengen van dwang tijdens de injectie worden vermeden. Als de naaldpunt correct op de coronale hechting wordt geplaatst, moet de naald soepel de schedel binnendringen.
Deze i.c.v. techniek kan ook worden toegepast op wakkere, niet-verdoofde muizen, en we hebben de acute centrale effecten van onderzochte geneesmiddelen gemeld met behulp van deze techniek23,24. Hoewel de huidige procedure voordelig is omdat er geen speciale apparatuur voor cannulation nodig is, kan de i.c.v. injectie slechts eenmaal worden uitgevoerd. Als herhaalde toediening van drugs nodig is, is cannulation noodzakelijk.
De RTX-test die hier wordt gepresenteerd is een gebruiksvriendelijke benadering voor het beoordelen van de functie van de perifere TRPV13,19. Nociceptive gedrag kan het meest prominent worden waargenomen bij een dosis van 1-10 ng RTX en geremd door co-injectie van capsazepine, een TRPV1 antagonist19,25. In de formaline test sommige groepen video-tape van de experimenten, maar de post-hoc observatie is vaak moeilijk omdat muizen de neiging om de getroffen poot te dekken met het hoofd en lichaam. Daarom observeren en meten onderzoekers in ons laboratorium het likken/bijten gedrag rechtstreeks. In dit scenario moet ervoor worden gezorgd dat de muizen niet worden verstoord. Bovendien is het bij pijntests erg belangrijk om de muis voldoende te kalmeren. Te sterke aangrijpende en een lawaaierige omgeving kunnen veroorzaakt door stress veroorzaakte pijnstillen en vertragen de nociceptieve respons.
Muizen die i.c.v.-voorbestemd zijn met RTX vertonen een normale nociceptieve respons in de RTX-test en de staartdruktest. Deze muizen zijn echter ongevoelig voor de pijnstillende effecten van paracetamol, die is voorgesteld om centrale TRPV19,10tebemiddelen . Deze resultaten suggereren dat supraspinal-selectieve TRPV1 desensibilisatie kan worden geïnduceerd in RTX-i.c.v. Muizen. Hoewel TRPV1 desensibilisatie is uitgevoerd met lokale toepassing van agonisten13,14,15,16,17,18, supraspinal-selectieve desensibilisatie is nog niet bereikt. De RTX-i.c.v. injectieprotocollen die hier worden gepresenteerd, bieden een handig experimenteel model voor het bestuderen van de rol van TRPV1 in supraspinale functie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
- Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
- Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
- Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
- Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
- Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
- Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
- Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
- Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
- Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690 (2013).
- Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
- Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
- Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
- Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021 (2009).
- Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
- Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43 (2008).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452 (2017).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
- Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
- Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
- Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
- Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).
