Summary
上阴区域的瞬态受体电位瓦尼洛伊德类型1（TRPV1）已被建议在大脑功能中发挥一些作用。此处描述的是用于小鼠超针TRPV1脱敏的树脂叶铁通毒素的针心通泡注射方案。还介绍了一些疼痛测试的程序。
Abstract
瞬态受体电位瓦尼洛伊德类型 1 （TRPV1），热敏阳离子通道，已知会触发周围神经疼痛。除了其外周功能外，还建议它参与大脑功能。树脂叶毒素（RTX），一种超能TRPV1激动剂，已知会导致TRPV1的长期脱敏，这种脱敏性一直是研究TRPV1表达细胞生理相关性的替代方法。在这里，我们描述了小鼠用RTX治疗的内脑血管（即c.v.）治疗方案。介绍了用于测试外围TRPV1刺激（RTX测试）和机械刺激（尾压测试）的发音的程序。虽然被施用RTX i.c.v.的小鼠的诱导反应与对照组相当，但RTX-i.c.v.管理的小鼠对对乙酰氨基酚的镇痛作用不敏感，这表明i.c.v.RTX治疗可诱发超针选择性TRPV1脱敏。该小鼠模型可作为研究TRPV1在脑/超功能中的作用的便捷实验系统。这些技术也可以应用于其他药物的中心行动的研究。
Introduction
动物通过周围神经上的传感器从环境中获得各种物理和化学刺激。瞬态受体电位瓦尼洛伊德类型1（TRPV1）是热敏、非选择性阳离子通道之一，充当热传感器1、2，TRPV1的激活和/或调制是正常和炎症环境中的发音的关键步骤。1虽然整体表达模式是有争议的，TRPV1的表达也建议在超平区，参与各种大脑活动（包括异常4，热调节5，焦虑6，注意力缺陷多动障碍7，癫痫8）。此外，最近有人建议，对乙酰氨基酚，一种广泛使用的止痛药，调解中央TRPV1的激活，以引出其镇痛作用9,9，10。
管理过量的TRPV1激动剂，包括辣椒素和树脂叶毒素（RTX）动物导致TRPV1阳性神经元的死亡和长期脱敏TRPV1激动剂11，12。11,结合局部应用（本级,13、14、,14内15、16、17和刚内18），这种化学消融方法为研究TRPV1的生理功能提供了另一种方法。16,17我们最近报告说，RTX的内脑血管注射抑制了对乙酰氨基酚在小鼠中的镇痛作用，建议超针选择性TRPV1脱敏19。在这份手稿中，我们提出了注射和随后的疼痛测试的精确方案。
将药物直接注射到大脑心室，可以研究其中心效应，同时将任何外周效应降至最低。这里介绍的注射程序是海利和麦考密克20所报告的方法的修改。这种方法很简单，通过日冕缝合将注射针插入横向心室，不需要任何特殊设备或外科手术。
TRPV1激动剂的外围局部应用引起灼痛感和神经原发性炎症。用RTX和TRPV1-KO小鼠进行系统治疗的小鼠对这种刺激13不敏感。我们已对RTX（RTX测试）进行了植物内注射，以确认在RTX-i.c.v中保留外设TRPV1。小 鼠。此方法是常规形式测试21的修改。
据报道，用RTX和TRPV1-KO小鼠进行系统治疗的小鼠表现出机械刺激11、13、22,13,的正常阈值。在这里，我们提出了一个尾压测试的程序，用于测试对乙酰氨基酚镇痛作用的变化。
所有这些程序都是正统和多才多艺的，可以应用于其他药物的研究。
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Protocol
这里使用的所有实验协议都经过了武藏野大学动物护理和使用委员会的批准。雄性 ddY 小鼠（SLC，日本静冈）在12小时光/暗循环下保存至少7天，然后进行水和食物实验。实验使用了5周或6周大的老鼠。
1. 药物制备
-
Rtx
注：酒精RTX溶液可引起严重皮肤灼伤和眼睛损伤。处理时，请务必使用橡胶手套和眼镜进行保护。此库存解决方案可使用 6 个月。- 将500μL乙醇加入1毫克RTX。
- 在上面的溶液中加入500μL的聚氧乙烯（20）单醇，并很好地涡旋。
- 在混合物中加入4 mL的生理盐水，并做好涡流。
- 将溶液的40μL等值放入1.5mL螺帽管中，并将其储存在-40°C。
-
对 乙酰 氨基 酚
- 在浓度为30mg/mL时，将20%的丙烯二醇溶液加入对乙酰氨基酚中，然后与声波器溶解。由于对乙酰氨基酚可能在溶解后数小时在室温下沉淀，因此在使用前准备或保持溶液温暖，直到使用。
2. RTX 的皮下或内皮纤维注射
- 解冻 1.1 中准备的库存解决方案。在盐水或人工脑脊液 （ACSF） 中稀释至 20 μg/mL，由 （以 mM 为单位）： 119 NaCl， 2.5 KCl， 1 NaH2PO4， 26 NaHCO3， 11 葡萄糖， 1.3 MgSO4， 2.5 CaCl2 平衡与 95% O2 和 5% CO2 （pH 7.2）.
- 用五巴比妥钠盐（60毫克/千克，内含）麻醉小鼠，并检查右反射的丧失。
- 对于 s.c. 治疗，将RTX（20μg/mL）注射到颈部背部，体积为0.1 mL/10 g体重。对于对照组，以相同方式注入车辆（10%乙醇、10%聚氧乙烯（20）单碱和80%盐水）。
- 对于 i.c.v. 治疗，将 5 μL 的 RTX（20 μg/mL）注射到右横向心室。对于对照组，以相同方式注入车辆（10%乙醇、10%聚氧乙烯（20）单醇和80%ACSF）。
- 通过金属管（0.8 mm I.D.）通过一次性 27-G 针，露出针头的 3.0-3.5 mm 尖端（图 1A）。
- 用70%的酒精消毒老鼠的头部，用手指牢牢抓住老鼠的鳞骨（图1B）。
注意：注意鳞突的位置，因为这些突起将作为注射的里程碑。 - 横向移动头皮上的针头，找到缝合线缝合线，因为针尖钩在缝合线上。
- 将尖端向右转约 1 mm，然后以玫瑰色方式移动尖端，然后找到 2.4.3 的日冕缝合线。（图1B）。
- 缓慢和垂直插入针头，在大约 10 秒内注入 RTX 溶液，并按住约 10 秒。
- 慢慢取针，把鼠标还回家笼。出血通常很少或不存在。如果发生大出血，应考虑使用另一只小鼠。
- 将预处理小鼠指定为 RTX 测试或尾压测试的受试者（分别步骤 3 和 4）。
3. RTX 测试
注：测试在 10：00 AM 到 5：00 PM 之间执行。测试室保持在200勒克斯和24-26°C。
- 使用RTX（步骤2）进行预处理一周后，在开始测试前至少60分钟将小鼠转移到测试室。
- 在开始测试前至少 30 分钟将每只鼠标单独放在有机玻璃笼中（29.5 × 17.5 × 13.5 厘米3 高），以便适应环境。
注：测试的顺序应在预处理组之间进行平衡。 - 在测试前20分钟对小鼠进行对乙酰氨基酚（300mg/kg）管理。
- 将鼠标松散地握在一个小布袋中，并将一根 30 量的针头插入右后爪的脚跟。将针头皮下推进到步行垫附近，并注入 20 μL 的RTX溶液（0.05 μg/mL）。
- 测量每个 5 分钟方块中受影响爪子的实验室区域的舔/咬行为周期。
4. 尾压测试
注：兰德尔-塞利托型压力计用于评估急性机械度分阈值。测试在 10：00 AM 到下午 5：00 之间执行。测试室保持在200勒克斯和24-26°C。
- 使用RTX（步骤2）进行预处理一周后，将小鼠转移到测试室，将每只小鼠单独放在有机玻璃笼中。
- 将斑点标记为与尾部底部的 1.5 厘米和 2.5 厘米。
- 将鼠标松散地握在一个小布袋中，用钝探针对斑点施加压力。
注：为避免组织损伤，施加250克的截止压力。 - 确定引起逃逸行为所需的压力（尾部搅拌、扭曲和吱吱作响），并计算通过平均两个点确定的压力来计算感知阈值。
- 重复步骤 4.3。到 4.4。每15分钟
- 获得基线后，对小鼠进行乙酰氨基酚（300毫克/千克）内向小鼠施用。管理后，重复步骤 4.3。每15分钟4.4次
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Representative Results
i.c.v.治疗小鼠在外观、自发活动、体重19 和核心体温方面无明显异常（车辆治疗组，38.4~0.3 °C，n = 6;RTX 处理组，38.7 × 0.2 °C，n = 6）。
图2A-B-B显示了s.c.-或.c.v.治疗小鼠对RTX的植物内注射的响应能力。在10分19秒，经过车辆处理的老鼠的舔/咬行为非常显著。虽然s.c.-预处理小鼠并无出现舔/咬行为，但 i.c.v.预处理小鼠通常对RTX的植物注射有反应。此外，如图2B所示，对乙酰氨基酚（300毫克/千克）的内向作用降低了车辆i.c.v.治疗小鼠的舔/咬行为，但减少了RX-i.c.v.治疗小鼠的舔/咬行为。
图2C 显示了尾压测试中对乙酰氨基酚（300mg/kg）的镇痛作用。乙酰氨基酚在两次测试中降低了车辆预处理小鼠的异常反应，但在使用RTX预处理的小鼠中，对乙酰氨基酚的镇痛作用受到抑制。
图1：i.c.v. 注射的摄影和示意图视图。（A） 用于注射的针头。 （B） 小鼠头骨的架构和针尖的运动。鳞骨显示为蓝色。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：对被预处理的小鼠或使用RTX进行预处理的小鼠的不感知反应。（A） s.c.预处理小鼠的舔/咬行为（右面板）的时间过程（左面板）和总时间。RTX 在零时（箭头指示）被注入植物区域。（B）时间路线（左面板）和舔/咬行为的总时间（右面板）的 i.c.v.预处理小鼠。对乙酰氨基酚（300毫克/千克）或其车辆（20%丙烯二醇）在RTX植物内注射前20分钟（用箭头指示）在腹内施用。（C） i.c.v.预处理小鼠尾部的机械疼痛阈值和对乙酰氨基酚的镇痛作用。所有数据均表示为平均 = SEM。每个组中的鼠标数显示在括号中。双尾曼-惠特尼 U 测试用于比较两组的数据。P P<0.05 的差异被认为很大。阿AP，对乙酰氨基酚;PG，丙二醇;n.s.， 不重要;i.pl，植物内注射。这些数字已经修改了福岛等人19。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这些实验中，最关键的一步是注射成功。这里使用的 i.c.v. 注射技术非常简单，但需要一些练习。在实验之前，建议使用染料（例如盐碱中 0.5% 的蓝印）。如果注射执行正确，在日冕缝合上应明显有针斑，注射染料应存在于反边心室和第三心室。此外，在注射过程中应避免强行插入。如果针尖正确放置在牙冠缝合线上，针应顺利穿透头骨。
这种即认为技术也可以应用于清醒的，非麻醉小鼠，我们已经报告了使用这种技术检查的药物的急性中心作用23，24。,24虽然本程序是有利的，因为不需要用于凝固的特殊设备，但 i.c.v. 注射只能执行一次。如果需要反复服用药物，则需要进行注射。
此处介绍的RTX测试是一种易于使用的方法，用于评估外设TRPV13 19,的功能。在剂量为1-10纳克RTX时，最显著地可以观察到异常行为，并且通过共同注射D应氮，TRPV1拮抗剂19，25来抑制。在正式测试中，一些小组对实验进行视频录像，但后期观察往往很困难，因为老鼠往往用头部和身体覆盖受影响的爪子。因此，我们实验室的实验者直接观察和测量舔/咬行为。在这种情况下，应注意不要打扰小鼠。此外，在疼痛测试中，让小鼠充分平静下来非常重要。过度强烈的夹持和嘈杂的环境会产生应激引起的镇痛，并延迟诱发反应。
使用RTX预处理的小鼠在RTX测试和尾压测试中表现出正常的异常反应。然而，这些小鼠对对乙酰氨基酚的镇痛作用不敏感，有人建议调解中央TRPV19，10。9,这些结果表明，在RTX-i.c.v中可以诱导超针选择性TRPV1脱敏。小 鼠。虽然TRPV1已经进行了局部应用激动剂13，14，15，16，17，18，超针选择性脱敏尚未实现。13,14,15,16,17,18The RTX-i.c.v.此处介绍的注入方案将为研究TRPV1在超平函数中的作用提供一个方便的实验模型。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可声明
Acknowledgments
没有。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
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