Summary
Den forbigående receptor potentielle vanilloid type 1 (TRPV1) i supraspinal regionen er blevet foreslået at spille nogle roller i hjernefunktionen. Beskrevet her er en protokol for intracerebroventricular injektion af harpiksiiferatoxin for supraspinal TRPV1 desensibilisering i mus. Procedurer for nogle smerte test er også præsenteret.
Abstract
Den forbigående receptor potentielle vanilloid type 1 (TRPV1), en termofølsom kation kanal, er kendt for at udløse smerter i de perifere nerver. Ud over sin perifere funktion, dens engagement i hjernens funktioner er også blevet foreslået. Harpiksiniferatoxin (RTX), en ultrapotent TRPV1 agonist, har været kendt for at fremkalde langsigtet desensibilisering af TRPV1, og denne desensibilisering har været en alternativ metode til at undersøge den fysiologiske relevans af TRPV1-udtrykkende celler. Her beskriver vi en protokol for intracerebroventricular (i.c.v.) behandling med RTX hos mus. Procedurer er beskrevet for test nociception til perifer TRPV1 stimulation (RTX test) og mekanisk stimulation (hale tryktest) derefter følge. Selv om de nociceptive reaktioner fra mus, der var blevet administreret RTX i.c.v. var sammenlignelige med de kontrolgrupper, RTX-i.c.v.-administreret mus var ufølsomme over for den smertestillende virkning af acetaminophen, hvilket tyder på, at i.c.v. RTX behandling kan fremkalde supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering. Denne musemodel kan bruges som et praktisk eksperimentelt system til at studere TRPV1's rolle i hjernen/supraspinal funktion. Disse teknikker kan også anvendes på undersøgelser af andre stoffers centrale handlinger.
Introduction
Dyr modtager forskellige fysiske og kemiske stimuli fra deres miljø gennem sensorer på de perifere nerver. Den forbigående receptor potentielle vanilloid type 1 (TRPV1) er en af de termofølsomme, ikke-selektive kationkanaler, der fungerer somvarmesensorer 1,2, og aktivering og / eller graduering af TRPV1 er kendt for at være et vigtigt skridt for nociception i både normale og inflammatoriske sammenhænge3. Selv om det overordnede udtryk mønster er kontroversielt, udtryk for TRPV1 er også blevet foreslået i supraspinal regioner, der er involveret i forskellige hjerneaktiviteter (herunder nociception4, termoregulering5, angst6, opmærksomhed underskud hyperaktivitet lidelse7, og epilepsi8). Desuden er det for nylig blevet foreslået, at acetaminophen, en udbredt smertestillende, formidler aktivering af centrale TRPV1 at fremkalde sin smertestillende virkning9,10.
Administration af overskydende TRPV1 agonist herunder capsaicin og harpiksiniferatoxin (RTX) til dyr fører til død TRPV1-positive neuroner og langvarig desensibilisering til TRPV1 agonister11,12. Kombineret med den lokale anvendelse (intrathecal13,14, intracisternal15,16,,17, og intraganglional18),denne kemiske ablation tilgang har givet en alternativ måde at undersøge de fysiologiske funktioner TRPV1. Vi har for nylig rapporteret, at intracerebroventricular (i.c.v.) injektion af RTX hæmmer den smertestillende virkning af acetaminophen i mus, hvilket tyder på supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering19. I dette manuskript præsenterer vi den præcise protokol for i.c.v. injektion og efterfølgende smertetest.
Direkte injektion af lægemidler i hjertekamrene i hjernen gør det muligt at studere deres centrale virkninger, mens minimalisering eventuelle perifere virkninger. Den i.c.v. injektion procedure præsenteret her er en ændring af den metode, der indberettes af Haley og McCormick20. Denne metode er enkel involverer indsættelse af en injektion nål i laterale ventrikler gennem koronale sutur og kræver ikke noget særligt udstyr eller kirurgiske procedurer for cannulation.
Perifer lokal anvendelse af TRPV1 agonister fremkalder en brændende smerte fornemmelse og neurogen inflammation. Mus, der er systemisk behandlet med RTX, og TRPV1-KO mus, er ufølsomme over for denne stimulation13. Vi har udført intraplantar injektion af RTX (RTX test) for at bekræfte bevarelsen af perifere TRPV1 i RTX-i.c.v. Mus. Denne metode er en ændring af den konventionelle formalin test21.
Det er blevet rapporteret, at mus systemisk behandlet med RTX og TRPV1-KO mus viser en normal tærskel til mekaniske stimuli11,13,22. Her præsenterer vi en procedure for haletryktest til test af ændringer i acetaminophens smertestillende virkning.
Alle disse procedurer er ortodokse og alsidige, og kan anvendes til undersøgelser af andre lægemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de eksperimentelle protokoller, der anvendes her blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Musashino University. Mandlige ddY mus (SLC, Shizuoka, Japan) blev holdt i mindst 7 dage under en 12-h lys / mørk cyklus før eksperimenter med vand og mad ad libitum. 5- eller 6 uger gamle mus blev brugt til forsøgene.
1. Fremstilling af narkotika
-
Rtx
BEMÆRK: Alkoholisk RTX-opløsning kan forårsage alvorlige forbrændinger af huden og øjenskader. Sørg for at bruge gummihandsker og briller til beskyttelse under håndtering. Denne lagerløsning kan bruges i 6 måneder.- Der tilsættes 500 μL ethanol til 1 mg RTX.
- Der tilsættes 500 μL polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat til ovenstående opløsning og vortex godt.
- Tilsæt 4 ml fysiologisk saltvand til blandingen og vortex godt.
- Aliquot 40 μL af opløsningen i 1,5-ml skruelrør, og opbevar dem ved -40 °C.
-
Acetaminophen
- Der tilsættes 20% w/v propylenglycolopløsning til acetaminophen i en koncentration på 30 mg/ml, og opløses med en sonikator. Da acetaminophen kan udløse ved stuetemperatur flere timer efter opløsningen, forberedes lige før brug, eller opløsningen opbevares varm, indtil den tages i brug.
2. Subkutan eller intracerebroventricular injektion af RTX
- Tø den lageroperede opløsning, der er fremstillet i 1.1. over og fortyndes den til 20 μg/ml i saltvand eller kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) bestående af (i mM): 119 NaCl 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glukose, 1,3 MgSO4, 2,5 CaCl2 ligeudbyttet med 95% O2 og 5% CO2 (pH 7,2).
- Bedøve mus med pentobarbital natriumsalt (60 mg/kg, intraperitoneally), og kontrollere for tab af den rettende refleks.
- Ved behandling med s.c. injiceres RTX (20 μg/ml) i nakkens bagside i et volumen på 0,1 ml/10 g kropsvægt. For kontrolgruppen injiceres køretøjet (10% ethanol, 10% polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat og 80 % saltvand) på samme måde.
- Ved behandling med i.c.v. skal der injiceres 5 μL RTX (20 μg/ml) i højre laterale hjertekammer. For kontrolgruppen injiceres køretøjet (10% ethanol, 10% polyoxyethylen (20) sorbitanmonooleat og 80% ACSF) på samme måde.
- En engangsnål på 27 G gennem et metalrør (0,8 mm ID) skal udsættes for 3,0-3,5 mm spidsen af nålen (figur 1A).
- Desinficere hovedet af musen med 70% alkohol, og hold de squamosal knogler af musen fast med fingrene(Figur 1B).
BEMÆRK: Vær opmærksom på placeringen af de squamosal fremspring, da disse fremspring vil tjene som vartegn for injektion. - Flyt nålen sidelæns på hovedbunden, og finde den sagittal sutur som nålen spidsen er hooked på suturen.
- Flyt spidsen ca. 1 mm til højre, flyt derefter spidsen rostrally, og find koronalsuturen som med 2.4.3. (Figur 1B).
- Sæt nålen langsomt og lodret ind, injicer RTX-opløsningen om ca. 10 sekunder, og hold den i ca. 10 sekunder.
- Træk nålen langsomt, og returnere musen til sit hjem bur. Blødning er normalt minimal eller fraværende. Hvis der opstår større blødninger, bør det overvejes at bruge en anden mus.
- Tildel de forbehandlede mus som forsøgspersoner til RTX-testen eller haletryktesten (henholdsvis trin 3 og 4).
3. RTX-test
BEMÆRK: Testen udføres mellem kl. Testlokalet vedligeholdes ved 200 lux og 24-26 °C.
- En uge efter forbehandling med RTX (trin 2) overføres mus til testlokalet mindst 60 min, før testen påbegyndes.
- Hver mus vejes og vejes individuelt i et plexiglasbur (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 højde) mindst 30 min, inden prøven påbegyndes, for at den kan akklimatisere sig til miljøet.
BEMÆRK: Rækkefølgen af test bør opvejes på tværs af forbehandlingsgrupper. - Der skal inperitonealt indgives acetaminophen (300 mg/kg) til musen 20 minutter før testen.
- Hold musen løst i en lille klud pose, og indsætte en 30-gauge nål i hælen på højre bagpote. Før nålen subkutende frem til nær gangpuderne, og indsprøjt 20 μL RTX-opløsning (0,05 μg/ml).
- Mål perioden med slikke / bidende adfærd i theglabrous region af de berørte pote i hver 5-min blok.
4. Haletryktest
BEMÆRK: En Randall-Selitto-type trykmåler bruges til at vurdere tærsklen for akut mekanisk nociception. Testen udføres mellem kl. Testlokalet vedligeholdes ved 200 lux og 24-26 °C.
- En uge efter forbehandling med RTX (trin 2.), overføre mus til testrummet, og veje og placere hver mus individuelt i en plexiglas bur.
- Marker pletterne på 1,5 og 2,5 cm fra bunden af halen.
- Hold musen løst i en lille klud pose, og lægge pres på pletterne med en stump sonde.
BEMÆRK: Der indføres et afskæringstryk på 250 g for at undgå vævsskader. - Bestem det tryk, der kræves for at fremkalde flugt adfærd (hale piskning, vridning, og knirkende), og beregne nociceptive tærskel ved gennemsnit trykket bestemmes på de to steder.
- Gentag trin 4.3. til 4.4. hver 15 min.
- Efter at have fået baseline, administreres acetaminophen (300 mg/kg) til musen intraperitoneally. Efter administration gentages trin 4.3. og 4,4 hver 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De i.c.v.-behandlede mus udviser ingen synlige abnormiteter i deres udseende, spontane aktiviteter,kropsvægt 19 og kernekroptemperatur (køretøjsbehandlet gruppe, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; RTX-behandlet gruppe, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).
Figur 2A-B viser, at s.c.- eller i.c.v.-behandlede mus reagerer på intraplantar-injektionen af RTX. Den slikke / bidende adfærd køretøj-behandlede mus var bemærkelsesværdig i de første 10 min19. Selv om s.c.-forbehandlede mus ikke viste slikke / bidende adfærd på alle, i.c.v.-forbehandlede mus normalt reageret på plantar injektion af RTX. Som vist i figur 2Breducerede intraperitoneal administration af acetaminophen (300 mg/kg) desuden bil-i.c.v.-behandlede muss slikke-/bidende adfærd, men ikke for MUS, der blev behandlet i RTX-i.c.v..
Figur 2C viser de smertestillende virkninger af acetaminophen (300 mg/kg) i haletrykstesten. Acetaminophen reducerede den nociceptive respons af køretøjsforbehandlede mus i begge tests, men de smertestillende virkninger af acetaminophen blev hæmmet hos mus, der blev forbehandlet i.c.v. med RTX.
Figur 1: Fotografiske og skematiske syn på i.c.v. injektion. (A) Nål, der anvendes til i.c.v. injektion. (B) Schema af musen kraniet og bevægelsen af nålen spidsen. Squamosal knogler er vist med blåt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Nociceptive reaktioner fra mus, der blev forbehandlet s.c. eller i.c.v. med RTX. (A) Tidsforløb (venstre panel) og den samlede tid for at slikke/bidende adfærd (højre panel) af s.c.-forbehandlede mus. RTX blev injiceret i plantar området på tid nul (angivet med pilehoved). (B) Tidsforløb (venstre panel) og den samlede tid for at slikke/bide adfærd (højre panel) af i.c.v.-forbehandlede mus. Enten acetaminophen (300 mg/kg) eller dets køretøj (20% propylenglycol) blev administreret intraperitoneally 20 min før intraplantar injektion af RTX (angivet med pilehoved). C) Mekanisk smertetærskel i halen af i.c.v.-forbehandlede mus og acetaminophens smertestillende virkning. Alle data blev udtrykt som gennemsnitlig ± SEM. Antallet af mus i hver gruppe vises i parenteser. Den tosidede Mann-Whitney U-test blev brugt til at sammenligne dataene for to grupper. Forskellene ved P<0,05 blev anset for at være betydelige. AcAP, acetaminophen; PG, propylenglycol; n.s., ikke signifikant; i.pl., intraplantar injektion. Disse tal er blevet ændret fra Fukushima et al19. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske skridt i disse eksperimenter er succesen af i.c.v. injektion. Den i.c.v. injektion teknik, der anvendes her er ganske enkel, men kræver nogle praksis. Før forsøg anbefales praksis med farvestoffer (f.eks. 0,5 % trypanblå i saltvand). Hvis injektionen udføres korrekt, skal der være et nålemærke på koronalsuturen, og det injicerede farvestof skal være til stede i den kontralaterale ventrikel og den tredje ventrikel. Desuden bør tvungen indsættelse undgås under injektionen. Hvis nålespidsen er korrekt placeret på koronalsuturen, skal nålen trænge glat ind i kraniet.
Denne i.c.v. teknik kan også anvendes på vågne, ikke-bedøvet mus, og vi har rapporteret de akutte centrale virkninger af lægemidler undersøgt ved hjælp af denne teknik23,,24. Selv om denne procedure er fordelagtig, fordi det ikke er nødvendigt med særligt udstyr til kanylering, kan injektionen kun udføres én gang. Hvis gentagen administration af narkotika er nødvendig, kanylering er nødvendig.
Den RTX-test , der præsenteres her , er en brugervenlig metode til vurdering af funktionen af perifer TRPV13,19. Nociceptive adfærd kan observeres mest fremtrædende ved en dosis på 1-10 ng RTX og hæmmet ved co-injektion af capsazepine, en TRPV1 antagonist19,25. I formalin test nogle grupper video-tape eksperimenterne, men post-hoc observation er ofte vanskeligt, fordi mus har tendens til at dække de berørte pote med hoved og krop. Derfor observerer og måler eksperimentatorer i vores laboratorium slikke-/bidende adfærd direkte. I dette scenario skal man passe på ikke at forstyrre musene. Desuden er det i smertetest meget vigtigt at berolige musen tilstrækkeligt. Overdrevent stærk gribende og et støjende miljø kan producere stress-induceret analgesi og forsinke nociceptive svar.
Mus, der er i.c.v.-forbehandlet med RTX, viser et normalt nociceptivt respons i RTX-testen og haletryktesten. Men, disse mus er ufølsomme over for de smertestillende virkninger af acetaminophen, som er blevet foreslået at mægle centrale TRPV19,10. Disse resultater tyder på, at supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering kan induceres i RTX-i.c.v. Mus. Selv om TRPV1 desensibilisering er blevet udført med lokal anvendelse af agonister13,14,15,16,17,18, supraspinal-selektiv desensibilisering er endnu ikke opnået. The RTX-i.c.v. injektion protokoller præsenteret her vil give en bekvem eksperimentel model for at studere den rolle, TRPV1 i supraspinal funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter til at erklære
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
- Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
- Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
- Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
- Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
- Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
- Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
- Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
- Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
- Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690 (2013).
- Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
- Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
- Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
- Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021 (2009).
- Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
- Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43 (2008).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452 (2017).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
- Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
- Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
- Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
- Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).
