Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Intracerebroventricular behandling med resiniferatoxin och smärtprov hos möss

Published: September 2, 2020 doi: 10.3791/57570
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Laboratory of Clinical Pharmacy and Pharmacology, Musashino University, 2Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Musashino University

Summary

Den transienta receptorn potentiella vanilloid typ 1 (TRPV1) i regionen supraspinal har föreslagits att spela några roller i hjärnans funktion. Beskrivs här är ett protokoll för intracerebroventricular injektion av resiniferatoxin för supraspinal TRPV1 desensibilisering hos möss. Förfaranden för vissa smärttester presenteras också.

Abstract

Den transienta receptorn potentiella vanilloid typ 1 (TRPV1), en termokänslig katjonkanal, är känd för att utlösa smärta i de perifera nerverna. Förutom dess perifera funktion, dess engagemang i hjärnans funktioner har också föreslagits. Resiniferatoxin (RTX), en ultrapotent TRPV1-agonist, har varit känt för att inducera långvarig desensibilisering av TRPV1, och denna desensibilisering har varit en alternativ metod för att undersöka den fysiologiska relevansen av TRPV1-uttrycker celler. Här beskriver vi ett protokoll för intracerebroventricular (i.c.v.) behandling med RTX i möss. Procedurer beskrivs för testning nociception till perifera TRPV1 stimulering (RTX test) och mekanisk stimulering (svans tryck test) sedan följa. Även om de nociceptiva svaren från möss som hade administrerats RTX i.c.v. var jämförbara med de som kontrollgrupperna, RTX-i.c.v.-administrerade möss var okänsliga för den smärtstillande effekten av paracetamol, vilket tyder på att i.c.v. RTX behandling kan framkalla supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering. Denna musmodell kan användas som ett bekvämt experimentellt system för att studera TRPV1s roll i hjärnans/supraspinalfunktionens funktion. Dessa tekniker kan också tillämpas på studier av andra drogers centrala åtgärder.

Introduction

Djur får olika fysiska och kemiska stimuli från sin omgivning genom sensorer på de perifera nerverna. Den transienta receptorn potentiella vanilloid typ 1 (TRPV1) är en av de termosensiösa, icke-selectiv katjonkanaler som fungerar somvärmesensorer 1,2 , ochaktiveringoch/eller modulering av TRPV1 är känt för att vara ett viktigt steg för nociception i både normala och inflammatoriska sammanhang3. Även om det övergripande uttrycket mönstret är kontroversiellt, har uttryck för TRPV1 också föreslagits i supraspinal regioner, att vara involverad i olika hjärnaktiviteter (inklusive nociception4, termoreglering5, ångest6, attention deficit hyperactivity disorder7, och epilepsi8). Dessutom har det nyligen föreslagits att paracetamol, en allmänt använd smärtstillande medel, förmedlar aktivering av centrala TRPV1 att framkalla dess smärtstillande åtgärder9,10.

Administrering av överskott TRPV1 agonist inklusive capsaicin och resiniferatoxin (RTX) till djur leder till döden av TRPV1-positiva nervceller och långvarig desensibilisering till TRPV1-agonister11,12. Kombinerat med den lokala applikationen (intratekal13,14, intracisternal15,16,17, och intraganglional18), har denna kemiska ablationsmetod gett ett alternativt sätt att undersöka de fysiologiska funktionerna hos TRPV1. Vi har nyligen rapporterat att intracerebroventricular (i.c.v.) injektion av RTX hämmar den smärtstillande effekten av paracetamol hos möss, vilket tyder på supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering19. I detta manuskript presenterar vi det exakta protokollet för i.c.v. injektion och efterföljande smärttester.

Direkt injektion av läkemedel i hjärnans ventriklar gör det möjligt att studera deras centrala effekter samtidigt som de minimaliserar eventuella perifera effekter. Den i.c.v. injektion förfarande som presenteras här är en modifiering av den metod som rapporterats av Haley och McCormick20. Denna metod är enkel som innebär införande av en injektionsnål i de laterala ventriklarna genom koronasuturen och kräver inte någon speciell utrustning eller kirurgiska ingrepp för kanylering.

Perifera lokala tillämpningen av TRPV1 agonister framkallar en brännande smärta sensation och neurogena inflammation. Möss som är systembehandlade med RTX, och TRPV1-KO-möss, är okänsliga för denna stimulering13. Vi har utfört intraplantar injektion av RTX (RTX test) för att bekräfta bevarandet av perifera TRPV1 i RTX-i.c.v. Möss. Denna metod är en modifiering av det konventionella formalintestet21.

Det har rapporterats att möss som behandlas systemiskt med RTX och TRPV1-KO-möss uppvisar en normal tröskel till mekaniska stimuli11,13,22. Här presenterar vi ett förfarande för svansen trycktest för provning av förändringar i den smärtstillande effekten av paracetamol.

Alla dessa förfaranden är ortodoxa och mångsidiga, och kan tillämpas på studier av andra läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla de experimentella protokoll som används här godkändes av Animal Care and Use Committee of Musashino University. Manliga ddY-möss (SLC, Shizuoka, Japan) hölls i minst 7 dagar under en 12-h ljus/mörk cykel före experiment med vatten och mat ad libitum. 5- eller 6 veckor gamla möss användes för experimenten.

1. Beredning av droger

  1. Rtx
    OBS: Alkoholhaltiga RTX lösning kan orsaka svåra brännskador på huden och ögonskador. Se till att använda gummihandskar och glasögon för skydd vid hantering. Denna stamlösning kan användas i 6 månader.
    1. Tillsätt 500 μL etanol till 1 mg RTX.
    2. Tillsätt 500 μL polyoxyetylen (20) sorbitan monooleate till lösningen ovan och virvel väl.
    3. Tillsätt 4 mL fysiologisk koksaltlösning till blandningen och virvel väl.
    4. Alikvot 40 μL av lösningen i 1,5-mL skruvlockrör, och förvara dem vid -40 °C.
  2. Paracetamol
    1. Tillsätt 20% w/v propylenglykollösning till paracetamol vid en koncentration av 30 mg/mL, och lös upp med en soniker. Eftersom paracetamol kan fälla ut vid rumstemperatur flera timmar efter upplösning, bered strax före användning eller hålla lösningen varm tills användning.

2. Subkutan eller intracerebroventricular Injektion av RTX

  1. Tina den lagerberedda lösningen som bereds i 1.1. ovan och späd ut den till 20 μg/mL i saltlösning eller konstgjord cerebrospinalvätska (ACSF) bestående av (i mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glukos, 1.3 MgSO4, 2.5 CaCl2 ekvilovilka med 95% O2 och 5% CO2 (pH 7.2).
  2. Bedöva möss med pentobarbital natriumsalt (60 mg/kg, intraperitoneally), och kontrollera om det finns förlust av den rättande reflexen.
  3. För s.c. behandling, injicera RTX (20 μg/mL) i nacken på en volym av 0,1 mL/10 g kroppsvikt. För kontrollgruppen injicerar du fordonet (10% etanol, 10% polyoxyetylen (20) sorbitan monooleat och 80% saltlösning) på samma sätt.
  4. För i.c.v. behandling, injicera 5 μL AV RTX (20 μg/mL) i den högra laterala ventrikeln. För kontrollgruppen injicerar du fordonet (10% etanol, 10% polyoxyetylen (20) sorbitan monooleate och 80% ACSF) på samma sätt.
    1. För en engångsnål på 27-G genom ett metallrör (0,8 mm I.D.) för att exponera nålens 3,0-3,5 mm-spets (Figur 1A).
    2. Desinficera mushuvudet med 70% alkohol, och håll musens squamosalben ordentligt med fingrarna (Figur 1B).
      OBS: Var uppmärksam på positionerna för de squamosal utsprång, eftersom dessa utsprång kommer att fungera som landmärken för injektion.
    3. Flytta nålen i laterled på hårbotten, och hitta sagittal sutur som nålen spetsen är fast på suturen.
    4. Flytta spetsen ca 1 mm till höger, flytta sedan spetsen rostrally, och hitta korona suturen som med 2.4.3. (Figur 1B).
    5. Stick in nålen långsamt och vertikalt, injicera RTX-lösningen på ca 10 sekunder och håll den i ca 10 sekunder.
    6. Dra tillbaka nålen långsamt, och returnera musen till sin hembur. Blödning är vanligtvis minimal eller frånvarande. Om större blödningar uppstår bör användning av en annan mus övervägas.
  5. Tilldela de förbehandlade mössen som försökspersoner för RTX-testet eller testet av svanstryck (Steg 3 respektive 4).

3. RTX-test

OBS: Testning utförs mellan 10:00 och 17:00. Provningsrummet underhålls vid 200 lux och 24-26 °C.

  1. En vecka efter förbehandlingar med RTX (Steg 2.), överför möss till testrummet minst 60 min innan testet startas.
  2. Väg och placera varje mus individuellt i en plexiglasbur (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 höjd) minst 30 min innan testet startas för att den ska kunna acklimatisera sig till omgivningen.
    OBS: Ordningen på tester bör vara motvikt över förbehandling grupper.
  3. Administrera paracetamol (300 mg/kg) till musen intraperitonealt 20 min före testet.
  4. Håll musen löst i en liten tygpåse, och sätt in en 30-gauge nål i hälen på den högra baktassen. För fram nålen subkutant till nära gångkuddarna, och injicera 20 μL RTX-lösning (0,05 μg/mL).
  5. Mät perioden av slicka / bita beteende i regionenglabrous av den drabbade tass i varje 5-min block.

4. Test av baktryck

OBS: En Tryckmätare av Randall-Selitto-typ används för att bedöma tröskeln för akut mekanisk nociception. Testningen utförs mellan 10:00 och 17:00. Provningsrummet underhålls vid 200 lux och 24-26 °C.

  1. En vecka efter förbehandlingar med RTX (Steg 2.), överföra möss till testrummet, och väga och placera varje mus individuellt i en plexiglas bur.
  2. Markera fläckarna på 1,5 och 2,5 cm från svansens bas.
  3. Håll musen löst i en liten tygpåse, och utöva tryck på fläckarna med en trubbig sond.
    OBS: Ett cutofftryck på 250 g läggs på för att undvika vävnadsskador.
  4. Bestäm det tryck som krävs för att framkalla flyktbeteende (svansvispning, vridning och gnisslande), och beräkna den nociceptiva tröskeln genom att medelvärdet av trycket som bestämts vid de två platserna.
  5. Upprepa steg 4.3. till 4,4. var 15:e minut.
  6. Efter erhållande av baslinjen, administrera paracetamol (300 mg/kg) till musen intraperitonealt. Efter administrering, upprepa steg 4.3. och 4,4 var 15:e min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De i.c.v.-behandlade mössen uppvisar inga synbara avvikelser i sitt utseende, spontana aktiviteter, kroppsvikt19 och kroppstemperatur (Fordonsbehandlad grupp, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; RTX-behandlad grupp, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).

Bild 2A-B visar s.c.- eller i.c.v.-behandlade mösss reaktionsförmåga till den intraplantarinjektionen av RTX. Den slicka / bita beteende fordonsbehandlade möss var anmärkningsvärt under de första 10 min19. Även om de s.c.-prebehandlade mössen inte visade slicka/bita beteende alls, svarade i.c.v.-prebehandlade möss normalt på plantar injektion av RTX. Dessutom, som visas i figur 2B, intraperitoneal administrering av paracetamol (300 mg/kg) minskade slicka / bita beteende av fordon-i.c.v.-behandlade möss men inte som RTX-i.c.v.-behandlade möss.

I figur 2C visas de smärtstillande effekterna av paracetamol (300 mg/kg) i testet med svanstryck. Paracetamol minskade det nociceptiva svaret hos fordonsprebehandlade möss i båda testerna, men de smärtstillande effekterna av paracetamol hämmades hos möss som var förbehandlade i.c.v. med RTX.

Figure 1
Bild 1: Fotografiska och schematiska vyer av i.c.v. injektion. (A) Nål som används för i.c.v. injektion. (B) Schema för musskalle och nålspetsens rörelse. Squamosal ben visas i blått. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Nociceptiva svar från möss som var förbehandlade s.c. eller i.c.v. med RTX. (A) Tidskurs (vänster panel) och total tid för slickande/bitande beteende (höger panel) av s.c.-prebehandlade möss. RTX injicerades i plantar området vid tiden noll (anges med pil huvud). (B) Tidskurs (vänster panel) och total tid för slickande/bitande beteende (höger panel) av i.c.v.-förbehandlade möss. Antingen acetaminophen (300 mg/kg) eller dess fordon (20% propylleneglycol) administrerades intraperitoneally 20 min före intraplantar injektion av RTX (anges med pil huvudet). (C) Mekanisk smärttröskel i svansen på i.c.v.-förbehandlade möss och den analgetiska effekten av paracetamol. Alla data uttrycktes som medelvärde ± SEM. Antalet möss i varje grupp visas inom parentes. Det tvåsidiga Mann-Whitney U-testet användes för att jämföra data för två grupper. Skillnader vid P<0,05 ansågs vara betydande. AcAP, paracetamol; PG, propylenglykol; n.s., inte betydande; i.pl., intraplantar injektion. Dessa siffror har modifierats från Fukushima et al19. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest kritiska steget i dessa experiment är framgången för i.c.v. injektionen. Den i.c.v. injektionsteknik som används här är ganska enkel men kräver lite övning. Före experiment rekommenderas övning med färgämnen (t.ex. 0,5 % trypanblå i saltlösning). Om injektionen utförs korrekt ska ett nålmärke vara uppenbart på koronasuturen och det injicerade färgämnet ska finnas i kontralateralkammaren och den tredje ventrikeln. Dessutom bör tvångsinföring undvikas under injektionen. Om nålspetsen är korrekt placerad på koronasuturen ska nålen penetrera skallen smidigt.

Denna i.c.v. teknik kan också tillämpas på vaken, icke-sövda möss, och vi har rapporterat de akuta centrala effekterna av läkemedel som undersökts med hjälp avdenna teknik 23,24. Även om det föreliggande förfarandet är fördelaktigt i att ingen speciell utrustning för cannulation är nödvändig, kan i.c.v. injektionen utföras endast en gång. Om upprepad administrering av läkemedel krävs, är kanylering nödvändig.

RTX-testet som presenteras här är en lättanvänd metod för att bedöma funktionen hos perifer trpv13,19. Nociceptivt beteende kan observeras mest framträdande vid en dos av 1-10 ng RTX och hämmas genom co-injektion av capsazepine, en TRPV1 antagonist19,25. I formalin testet några grupper video-band experimenten, men post-hoc observation är ofta svårt eftersom möss tenderar att täcka den drabbade tassen med huvudet och kroppen. Därför, experimentörer i vårt laboratorium observera och mäta slicka / bita beteende direkt. I det här scenariot bör man vara försiktig så att mössen inte störs. Dessutom, i smärttester, är det mycket viktigt att tillräckligt lugna musen. Överdrivet stark gripande och en bullrig miljö kan producera stress-inducerad analgesi och fördröja nociceptive svaret.

Möss som är i.c.v.-förbehandlade med RTX uppvisar ett normalt nociceptivt svar i RTX-testet och testet med svanstryck. Dessa möss är dock okänsliga för de smärtstillande effekterna av paracetamol, som har föreslagits att medla centrala TRPV19,10. Dessa resultat tyder på att supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering kan induceras i RTX-i.c.v. Möss. Även TRPV1 desensibilisering har utförts med lokal tillämpning av agonister13,14,15,16,17,18, supraspinal-selektiv desensibilisering har ännu inte uppnåtts. The RTX-i.c.v. injektion protokoll som presenteras här kommer att ge en bekväm experimentell modell för att studera roll TRPV1 i supraspinal funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att deklarera

Acknowledgments

Ingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Resiniferatoxin LKT Laboratories R1774 used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test
Acetaminophen IWAKI SEIYAKU gifted from IWAKI SEIYAKU
Pentobarbital sodium salt Tokyo Chemical Industry P0776 used for anesthesia
Ethanol (99.5) Wako Pure Chemical Industries 057-00456 used for dissolving RTX
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate Wako Pure Chemical Industries 161-21621 used for dissolving RTX
25 μL microsyringe Hamilton 1702LT used for i.c.v. injection
100 μL microsyringe Hamilton 1710LT used for intraplantar injection
26-gauge disposable needle TERUMO NN-2613S used for i.c.v. injection
30-gauge disposable needle NIPRO 01134 used for intraplantar injection
Pressure meter Ugo Basile Analgesy-Meter Type 7200 used for tail pressure test

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
  2. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  3. Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
  4. Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
  5. Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
  6. Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
  7. Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
  8. Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
  9. Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
  10. Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690 (2013).
  11. Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
  12. Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
  13. Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
  14. Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021 (2009).
  15. Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
  16. Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
  17. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43 (2008).
  18. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  19. Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452 (2017).
  20. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  21. Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
  22. Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
  23. Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
  24. Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
  25. Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).

Tags

Neurovetenskap transient receptor potential vanilloid typ 1 (TRPV1) resiniferatoxin intracerebroventricular injektion nociception RTX test svanstryckstest paracetamol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fukushima, A., Fujii, M., Ono, H.… More

Fukushima, A., Fujii, M., Ono, H. Intracerebroventricular Treatment with Resiniferatoxin and Pain Tests in Mice. J. Vis. Exp. (163), e57570, doi:10.3791/57570 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter