Summary
Den forbigående reseptoren potensielle vanilloid type 1 (TRPV1) i supraspinal regionen har blitt foreslått å spille noen roller i hjernefunksjonen. Beskrevet her er en protokoll for intracerebroventrikulær injeksjon av harpiksiferatoxin for supraspinal TRPV1 desensibilisering hos mus. Prosedyrer for noen smertetester presenteres også.
Abstract
Den forbigående reseptoren potensielle vanilloid type 1 (TRPV1), en termosensitiv kation kanal, er kjent for å utløse smerter i perifere nerver. I tillegg til sin perifere funksjon har dets engasjement i hjernefunksjoner også blitt foreslått. Harpiksiferatoxin (RTX), en ultrapotent TRPV1 agonist, har vært kjent for å indusere langsiktig desensibilisering av TRPV1, og denne desensibiliseringen har vært en alternativ tilnærming for å undersøke den fysiologiske relevansen av TRPV1-uttrykkende celler. Her beskriver vi en protokoll for intracerebroventrikulær (i.c.v.) behandling med RTX hos mus. Prosedyrer er beskrevet for testing av nociception til perifer TRPV1 stimulering (RTX test) og mekanisk stimulering (haletrykktest) deretter følge. Selv om de nociceptive responsene til mus som hadde blitt administrert RTX i.c.v. var sammenlignbare med de av kontrollgruppene, var RTX-i.c.v.-administrerte mus ufølsomme for den smertestillende effekten av paracetamol, noe som tyder på at RTX-behandling kan indusere suppinrasal-selektiv TRPV1 desensibilisering. Denne musemodellen kan brukes som et praktisk eksperimentelt system for å studere rollen som TRPV1 i hjernen / supraspinalfunksjonen. Disse teknikkene kan også brukes på studier av andre legemidlers sentrale handlinger.
Introduction
Dyr får ulike fysiske og kjemiske stimuli fra sitt miljø gjennom sensorer på perifere nerver. Den forbigående reseptoren potensielle vanilloid type 1 (TRPV1) er en av de termosensitive, ikke-selektive kationkanaler som fungerer somvarmesensorer 1,,2,og aktivering og / eller modulering av TRPV1 er kjent for å være et viktig skritt for nociception i både normale og inflammatoriske sammenhenger3. Selv om det generelle uttrykksmønsteret er kontroversielt, har uttrykk for TRPV1 også blitt foreslått i supraspinalregioner, som er involvert i ulike hjerneaktiviteter (inkludert nociception4,termoregulering5,angst6,oppmerksomhetssvikt hyperaktivitetsforstyrrelse7og epilepsi8). Videre har det nylig blitt foreslått at paracetamol, et mye brukt smertestillende middel, formidler aktiveringen av sentrale TRPV1 for å fremkalle sin smertestillende virkning9,10.
Administrasjon av overflødig TRPV1 agonist inkludert capsaicin og harpiksiferatoxin (RTX) til dyr fører til død av TRPV1-positive nevroner og langvarig desensibilisering til TRPV1 agonister11,12. Kombinert med lokal applikasjon (intratekal13,14, intraisternal15,,16,,17og intraganglional18),har denne kjemiske ablasjontilnærmingen gitt en alternativ måte å undersøke de fysiologiske funksjonene til TRPV1. Vi har nylig rapportert at intracerebroventrikulær (i.c.v.) injeksjon av RTX hemmer den smertestillende effekten av paracetamol hos mus, noe som tyder på supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering19. I dette manuskriptet presenterer vi den nøyaktige protokollen for i.c.v. injeksjon og påfølgende smertetester.
Direkte injeksjon av legemidler i hjernens ventrikkler gjør det mulig å studere sine sentrale effekter samtidig som de minimaliserer perifere effekter. I.c.v. injeksjon prosedyren presentert her er en endring av metoden rapportert av Haley og McCormick20. Denne metoden er enkel å involvere innsetting av en injeksjonsnål i laterale ventriklene gjennom koronal sutur og krever ikke noe spesielt utstyr eller kirurgiske prosedyrer for hermetikk.
Perifer lokal bruk av TRPV1 agonister fremkaller en brennende smertefølelse og nevrogen betennelse. Mus som behandles systemisk med RTX, og TRPV1-KO-mus, er ufølsomme for dennestimuleringen 13. Vi har utført intraplantarinjeksjon av RTX (RTX-test) for å bekrefte bevaring av perifer TRPV1 i RTX-i.c.v. mus. Denne metoden er en modifikasjon av den konvensjonelle formalin test21.
Det har blitt rapportert at mus systemisk behandlet med RTX og TRPV1-KO mus viser en normal terskel for mekaniske stimuli11,,13,,22. Her presenterer vi en prosedyre for haletrykktesten for testing av endringer i den smertestillende effekten av paracetamol.
Alle disse prosedyrene er ortodokse og allsidige, og kan brukes på studier av andre stoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller som brukes her ble godkjent av Animal Care and Use Committee of Musashino University. HanndY mus (SLC, Shizuoka, Japan) ble holdt i minst 7 dager under en 12-h lys / mørk syklus før eksperimenter med vann og mat ad libitum. 5- eller 6 uker gamle mus ble brukt til forsøkene.
1. Utarbeidelse av narkotika
-
RTX (andre
MERK: Alkoholholdig RTX-oppløsning kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Pass på at du bruker gummihansker og briller for beskyttelse ved håndtering. Denne lagerløsningen kan brukes i 6 måneder.- Tilsett 500 μL etanol til 1 mg RTX.
- Tilsett 500 μL polyoksyetylen (20) sorbitanmonoleat til oppløsningen ovenfor og virvel godt.
- Tilsett 4 ml fysiologisk saltvann til blandingen og virvelen godt.
- Aliquot 40 μL av oppløsningen i 1,5 ml skruehette rør, og oppbevar dem ved -40 °C.
-
Acetaminophen
- Tilsett 20% w / v propylenglycol løsning til paracetamol i en konsentrasjon på 30 mg / ml, og oppløses med en sonicator. Siden paracetamol kan utløse ved romtemperatur flere timer etter oppløsning, klargjør like før bruk eller hold oppløsningen varm til bruk.
2. Subkutan eller intrakransbroventrik injeksjon av RTX
- Tin den lagerfylte løsningen utarbeidet i 1.1. over og fortynne den til 20 μg/ml i saltvann eller kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) bestående av (i mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4,26 NaHCO3,11 glukose, 1,3 MgSO4,2,5 CaCl2 likevekt med 95 % O2 og 5 % CO2 (pH 7,2).
- Bedøve mus med pentobarbital natriumsalt (60 mg/kg, intraperitonealt), og se etter tap av riktigrefleksen.
- For s.c. behandling, injiser RTX (20 μg/ml) på baksiden av nakken med et volum på 0,1 ml/10 g kroppsvekt. For kontrollgruppen, injiser kjøretøyet (10% etanol, 10% polyoksyetylen (20) sorbitanmonoleat og 80% saltvann) på samme måte.
- For behandling med i.c.v. injiser du 5 μL RTX (20 μg/ml) i høyre sideåpning. For kontrollgruppen, injiser kjøretøyet (10% etanol, 10% polyoksyetylen (20) sorbitanmonoleat og 80% ACSF) på samme måte.
- Før en engangskanyle på 27 G gjennom et metallrør (0,8 mm ID) for å eksponere kanylens 3,0-3,5 mm (figur 1A).
- Desinfiser musens hode med 70% alkohol, og hold squamosal bein av musen fast med fingrene (Figur 1B).
MERK: Vær oppmerksom på posisjonene til de squamosale fremspringene, siden disse fremspringene vil tjene som landemerker for injeksjon. - Flytt nålen sideveis på hodebunnen, og finn sagittalsugturen som nålespissen er hekta på suturen.
- Flytt spissen ca 1 mm til høyre, flytt deretter spissen rostrally, og finn koronal suturen som med 2.4.3. (Figur 1B).
- Sett nålen langsomt og vertikalt inn, injiser RTX-oppløsningen på ca. 10 sekunder, og hold den i ca. 10 sekunder.
- Trekk nålen sakte, og returner musen til sitt hjem bur. Blødning er vanligvis minimal eller fraværende. Hvis det oppstår store blødninger, bør bruk av en annen mus vurderes.
- Tilordne de forbehandlede musene som forsøkspersoner for RTX-testen eller haletrykkstesten (henholdsvis trinn 3 og 4).
3. RTX-test
MERK: Testing utføres mellom 10:00 og 17:00. Testrommet vedlikeholdes ved 200 lux og 24-26 °C.
- En uke etter forbehandling med RTX (trinn 2.), overfør mus til testrommet minst 60 min før testen startes.
- Vei og plasser hver mus individuelt i et plexiglassbur (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 høyde) minst 30 min før du starter testen for å tillate at den kan akklimatisere seg til miljøet.
MERK: Rekkefølgen på testene skal motbalansers på tvers av forbehandlingsgrupper. - Administrer paracetamol (300 mg/kg) til musen intraperitonealt 20 min før testen.
- Hold musen løst i en liten klut pose, og sett en 30-gauge nål inn i hælen på høyre bakpote. Før nålen subkutant til nær gangputene, og injiser 20 μL RTX-oppløsning (0,05 μg/ml).
- Mål perioden med slikking / biting atferd iglabrøst regionen av den berørte poten i hver 5-min blokk.
4. Test av haletrykk
MERK: En Randall-Selitto-type trykkmåler brukes til å vurdere terskelen for akutt mekanisk nociception. Testing utføres mellom 22:00 og 17:00. Testrommet vedlikeholdes ved 200 lux og 24-26 °C.
- En uke etter forbehandling med RTX (trinn 2.), overføre mus til testrommet, og veie og plassere hver mus individuelt i et plexiglass bur.
- Merk flekkene på 1,5 og 2,5 cm fra bunnen av halen.
- Hold musen løst i en liten klut pose, og legg press på flekkene med en stump sonde.
MERK: Det pålegges et avskjæringstrykk på 250 g for å unngå vevsskade. - Bestem trykket som kreves for å fremkalle rømningsatferd (halevisp, vridning og squeaking), og beregn den nociceptive terskelen ved å snitte trykket som bestemmes på de to stedene.
- Gjenta trinn 4.3. til 4,4. hver 15 min.
- Etter å ha oppnådd baseline, administrer paracetamol (300 mg/kg) til musen intraperitonealt. Gjenta trinn 4.3 etter administrasjon. og 4,4 hver 15 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De i.c.v.-behandlede musene viser ingen tilsynelatende abnormiteter i utseende, spontane aktiviteter,kroppsvekt 19 og kjernekroppstemperatur (Kjøretøybehandlet gruppe, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; rtx-behandlet gruppe, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).
Figur 2A-B viser responsen til s.c.- eller i.c.v.-behandlede mus til intraplantarinjeksjonen av RTX. Slikking / biting oppførsel av kjøretøy-behandlet mus var bemerkelsesverdig i de første 10 min19. Selv om de forbehandlede musene ikke viste slikking/bitingsatferd i det hele tatt, reagerte de forbehandlede musene normalt på plantarinjeksjonen av RTX. Videre, som vist i figur 2B,reduserte intraperitoneal administrering av paracetamol (300 mg/kg) slikking/biting av atferd av kjøretøy-i.c.v.-behandlede mus, men ikke for RTX-i.c.v.-behandlede mus.
Figur 2C viser de smertestillende effektene av paracetamol (300 mg/kg) i haletrykktesten. Paracetamol reduserte den nociceptive responsen til kjøretøyforbehandlede mus i begge testene, men de smertestillende effektene av paracetamol ble hemmet hos mus som var forbehandlet i.c.v. med RTX.
Figur 1: Fotografiske og skjematiske visninger av i.c.v. injeksjon. (A) Kanyle som brukes til i.c.v. injeksjon. (B) Skjema av museskallen og bevegelsen av nålespissen. Squamosal bein er vist i blått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Nociceptive responser av mus som var forbehandlet s.c. eller i.c.v. med RTX. (A) Tidskurs (venstre panel) og total tid for slikking/bitingsatferd (høyre panel) av s.c.-forbehandlede mus. RTX ble injisert i plantarområdet på null tid (indikert med pilhodet). (B) Tidskurs (venstre panel) og total tid for slikking/bitingsatferd (høyre panel) av i.c.v.-forbehandlede mus. Enten paracetamol (300 mg/kg) eller dets kjøretøy (20 % propylenglykol) ble administrert intraperitonealt 20 min før intraplantarinjeksjon av RTX (indikert med pilhode). (C) Mekanisk smerteterskel i halen av i.c.v.-forbehandlede mus og den smertestillende effekten av paracetamol. Alle data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Antall mus i hver gruppe er vist i parentes. Den to-tailed Mann-Whitney U-testen ble brukt til å sammenligne dataene for to grupper. Forskjeller ved P<0,05 ble ansett å være signifikante. AkAP, paracetamol; PG, propyleneglycol; n.s., ikke signifikant; i.pl., intraplantar injeksjon. Disse tallene er endret fra Fukushima et al19. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det mest kritiske trinnet i disse eksperimentene er suksessen til i.c.v. injeksjon. I.c.v. injeksjon teknikk som brukes her er ganske enkel, men krever litt praksis. Før eksperimenter anbefales trening med fargestoffer (f.eks. 0,5 % trypan blå i saltvann). Hvis injeksjonen utføres riktig, bør et nålemerke være tydelig på koronarsuturen og det injiserte fargestoffet skal være tilstede i den kontralaterale ventrikkelen og den tredje ventrikkelen. Videre bør tvangsinnsetting unngås under injeksjon. Hvis nålespissen er riktig plassert på koronarsuturen, bør nålen trenge inn i skallen jevnt.
Denne i.c.v. teknikken kan også brukes på våkne, ikke-bedøvede mus, og vi har rapportert de akutte sentrale effektene av legemidler undersøkt ved hjelp av denneteknikken 23,24. Selv om den nåværende prosedyren er en fordel ved at det ikke er nødvendig med spesialutstyr for hermetonering, kan injeksjonen bare utføres én gang. Hvis gjentatt administrering av narkotika er nødvendig, er hermetulering nødvendig.
RTX-testen som presenteres her er en brukervennlig tilnærming for å vurdere funksjonen til perifer TRPV13,,19. Nociceptive atferd kan observeres mest fremtredende i en dose på 1-10 ng RTX og hemmes ved samtidig injeksjon av capsazepin, en TRPV1-antagonist19,,25. I formalin testen noen grupper video-tape eksperimenter, men post-hoc observasjon er ofte vanskelig fordi mus har en tendens til å dekke den berørte poten med hodet og kroppen. Derfor observerer eksperimenterere i laboratoriet vårt og måler slikking / bitende oppførsel direkte. I dette scenariet bør det tas hensyn til ikke å forstyrre musene. I tillegg, i smertetester, er det svært viktig å tilstrekkelig roe musen. Overdreven sterk gripende og et støyende miljø kan produsere stress-indusert analgesi og forsinke den støyende responsen.
Mus som er i.c.v.-forbehandlet med RTX viser en normal nociceptive respons i RTX-testen og haletrykktesten. Disse musene er imidlertid ufølsomme for de smertestillende effektene av paracetamol, som har blitt foreslått å megle sentrale TRPV19,10. Disse resultatene tyder på at supraspinal-selektiv TRPV1 desensibilisering kan induseres i RTX-i.c.v. mus. Selv om TRPV1 desensibilisering har blitt utført med lokal anvendelse av agonister13,14,15,16,17,18, supraspinal-selektiv desensibilisering er ennå ikke oppnådd. The RTX-i.c.v. injeksjonsprotokoller presentert her vil gi en praktisk eksperimentell modell for å studere rollen som TRPV1 i supraspinalfunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | used for s.c./i.c.v. pretreatments and the RTX test |
| Acetaminophen | IWAKI SEIYAKU | gifted from IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital sodium salt | Tokyo Chemical Industry | P0776 | used for anesthesia |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | used for dissolving RTX |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monooleate | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | used for dissolving RTX |
| 25 μL microsyringe | Hamilton | 1702LT | used for i.c.v. injection |
| 100 μL microsyringe | Hamilton | 1710LT | used for intraplantar injection |
| 26-gauge disposable needle | TERUMO | NN-2613S | used for i.c.v. injection |
| 30-gauge disposable needle | NIPRO | 01134 | used for intraplantar injection |
| Pressure meter | Ugo Basile | Analgesy-Meter Type 7200 | used for tail pressure test |
References
- Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
- Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
- Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
- Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
- Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
- Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
- Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
- Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
- Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
- Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690 (2013).
- Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
- Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
- Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
- Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021 (2009).
- Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
- Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
- Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43 (2008).
- Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
- Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452 (2017).
- Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
- Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
- Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
- Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
- Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
- Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).
