ويرد وصف بروتوكول لتحريض في المختبر الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت)، ومفيدة للتحقيق في مسارات الإشارات الخلوية المشتركة في اندمت،. في هذا النموذج التجريبي، هو اندمت الناجمة عن المعاملة مع TGF-β في خلايا بطانية 1 مللي ثانية.
اللدونة المظهرية من خلايا بطانية يكمن وراء تطوير نظام القلب والأوعية الدموية، وأمراض القلب والأوعية الدموية، ومختلف الشروط المرتبطة بالتليف الجهاز. في ظل هذه الظروف، يكتسب خلايا بطانية المتباينة تعمل الوسيطة مثل. هذه العملية يسمى الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت) ويتسم ب downregulation علامات بطانية، upregulation من علامات الوسيطة، والتغييرات الشكلية. اندمت هو الناجمة عن مسارات إشارات عدة، بما في ذلك تحويل عامل النمو (TGF)-β، Wnt، والدرجة، وينظمها الجزيئية آليات مماثلة لتلك التي الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) هام ل gastrulation، تليف الأنسجة، و سرطان خبيث. فهم آليات اندمت مهم لوضع نهج التشخيصية والعلاجية التي تستهدف اندمت. تحريض قوي اندمت في المختبر مفيد لتميز التوقيعات تعبير الجينات المشتركة، وتحديد الآليات الجزيئية دروجابل وشاشة المغيرون اندمت. وهنا يصف لنا أسلوب في المختبر لتحريض اندمت. خلايا بطانية microvascular البنكرياس الماوس MS-1 الخضوع اندمت بعد التعرض لفترة طويلة إلى TGF-β وإظهار upregulation من علامات الوسيطة والتغييرات الشكلية وكذلك تحريض السيتوكينات والمستقطبات التهابات متعددة. أساليب لتحليل ميكرورنا (ميرنا) التحوير مدرجة أيضا. هذه الأساليب توفير منبر للتحقيق في الآليات الكامنة وراء اندمت والمساهمة من ميرناس إلى اندمت.
الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت) هو العملية التي يخضع خلية غشائي متمايزة مجموعة متنوعة من التغيرات الجزيئية، الناتج في خلية مثل تنتجها الخلايا الليفية الوسيطة1. ووصفت اندمت في البداية تحول خلايا غشائي أثناء التطوير من قلب2،3. في قلب التنمية المبكرة، يتألف أنبوب القلب البطانة داخلية وعضلة القلب خارجي. يتم فصل هذه الطبقتين طبقة من المصفوفة خارج الخلية تسمى هلام القلب. الخلايا الجنينية للوفلر، التي تكتسب علامات خلية بطانية، العبور إلى الخلايا الوسيطة وتغزو هلام القلب الكامنة، وتشجيع تشكيل الوسائد القلب، توفر الأساس للصمامات بي وحاجز والصمامات سيميلونار. وعلاوة على ذلك، قد اقترح اندمت لتكون مصادر بيريسيتيس وخلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية في نظم الأوعية الدموية الجنينية الأخرى بما في ذلك الأوعية التاجية والشريان الاورطي البطني والشريان الرئوي4،،من56. وبالإضافة إلى ذلك، هو تورط اندمت في الأوعية الفسيولوجية التي تنتشر في7.
تتراكم الأدلة قد اقترح أن اندمت تشارك أيضا في العديد من أمراض القلب والأوعية الدموية وغيرها من الأمراض81،. وتشمل الشروط المرتبطة اندمت تكلس الأوعية الدموية، تصلب الشرايين، وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، وتشوه الكهفي، تليف الجهاز، يعيد البناء الابتزاز المنوال، الخلل في allograft في زرع الكلي والسرطان8، 9،10،11،،من1213،،من1415،16،17، 18-وصف تقرير صدر مؤخرا أن عدة علامات اندمت الجزيئية يمكن أن تكون أداة للتنبؤ التشخيص والتكهن بالخلل الوظيفي الكلوي الاختلاس في زرع الكلي17. تعديل مسارات الإشارات الخلوية المتصلة اندمت قد ثبت أن تحسين ظروف المرض عدة بما في ذلك تليف القلب ويعيد البناء الابتزاز المنوال في الحيوان النماذج8،15. ولذلك فهم الآليات الكامنة وراء اندمت هامة لتطوير استراتيجيات تشخيصية وعلاجية تستهدف اندمت.
اندمت تتسم بفقدان تقاطعات خلية خلية، والزيادة في إمكانيات الهجرة، downregulation الجينات غشائي محددة مثل هاء-كادهيرين، و upregulation من الجينات الوسيطة بما في ذلك العضلات الملساء α أكتين (α-SMA). وباﻹضافة إلى ذلك، اندمت والانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT)، عملية مماثلة تقوم بتحويل الخلايا الظهارية للخلايا الوسيطة، المرتبطة بالإنتاج المتغيرة لمختلف عناصر المصفوفة خارج الخلية، التي قد تسهم في تطوير أنسجة التليف8،19.
في الآونة الأخيرة، عدة دراسات في المختبر من اندمت قد شرحت تفاصيل الآليات الجزيئية اندمت15،20. اندمت هو الناجمة عن مسارات الإشارات المختلفة بما في ذلك تحويل عامل النمو (TGF)-β، Wnt، وتحقيقها1. فيما بينها، TGF-β يلعب دور محوري في استحثاث EMT واندمت. في اندمت، لفترات طويلة التعرض لنتائج TGF-β في اندمت في خلايا بطانية شتى، في حين يبدو أن التعرض القصير غير كافية21. ونحن هنا وصف بروتوكولا مباشرة لتحريض اندمت، في أي ميل سفين 1 (MS-1) الخضوع للماوس البنكرياس خلايا بطانية microvascular اندمت في المختبر بعد التعرض لفترة طويلة إلى TGF-β20. في هذا النموذج، يمكن إجراء تحليلات متعددة للمتلقين للمعلومات للتحقيق في ملامح مميزة اندمت، بما في ذلك التغييرات الشكلية، downregulation علامات بطانية، upregulation من علامات الوسيطة والجينات التحريضية، سيتوسكيليتال ترتيبات جديدة، وانكماش جل الكولاجين.
ميكرورناس (ميرناس) هي ~ 22 nt الكشف التنظيمية الصغيرة أن المباشرة القمع بوسترانسكريبشونال مختلف مرناً الأهداف22،23. من خلال الاعتراف بالهدف تسلسل بوساطة البذور، ميرناس قمع مئات جينات المستهدفة وتعدل الوظائف الخلوية المتنوعة مثل تمايز الخلايا وانتشارها، وحركية. وهذا هو الحال لتنظيم EMT واندمت أيضا، وأبلغ ميرناس عدة المنظمين من24،EMT واندمت25. يمكن الجمع بين نموذج اندمت قدم في هذا الاستعراض بسهولة مع ميرنا تعديل إجراءات لاختبار أدوار ميرناس في اندمت. هذا الاستعراض يلخص لدينا إجراءات تجريبية للتحقيق اندمت TGF-β-المستحث في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 ويشمل أيضا مقارنة شروط الاستقراء اندمت طريق TGF-β في خلايا بطانية أخرى.
وأفيد أن المنشط علاج TGF-β ورأس ح 24 الناجم عن اندمت في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1، في حين فشل TGF-β وحدها لحمل اندمت في هذه الفترة القصيرة21. دأبت، لاحظنا أن TGF-β إلى حد كبير التي يسببها اندمت بعد العلاج الطويل (ح 48 – 72) في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 خلايا20. اندمت ل?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر بوروك زيا ومييازونو كوهية للاقتراحات في إعداد مخطوطة. H.I.S. ومحمد تدعمها “زمالة أبحاث مؤسسة النصب التذكاري أوهارا”، ويدعمه H.I.S. “أوسامو هايايشى التذكاري المنح الدراسية” “الدراسة في الخارج”. وأيد هذا العمل بمنحه من مؤسسة العلوم وتاكيدا (أ. س.).
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |