Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.
Plasticidade fenotípica de células endoteliais está subjacente o desenvolvimento do sistema cardiovascular, doenças cardiovasculares e várias condições associadas com fibrose do órgão. Nestas condições, as células endoteliais diferenciadas adquirem fenótipos mesenquimais semelhante. Este processo é chamado de transição endotelial-mesenquimais (EndMT) e é caracterizado por downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de marcadores mesenquimais e alterações morfológicas. EndMT é induzida por várias vias de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe e regulado por mecanismos moleculares semelhantes de transição epitelial-mesenquimal (EMT) importante para gastrulação, fibrose do tecido, e metástase do cancro. Compreender os mecanismos da EndMT é importante para desenvolver abordagens diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT. Indução robusta do EndMT em vitro é útil para caracterizar assinaturas de expressão de gene comum, identificar mecanismos moleculares druggable e tela para moduladores de EndMT. Aqui, descrevemos um método em vitro para indução de EndMT. Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 submetido a EndMT após a exposição prolongada ao TGF-β e mostram upregulation de marcadores mesenquimais e mudanças morfológicas, bem como a indução de múltiplos inflamatórias quimiocinas e citocinas. Métodos de análise de microRNA (miRNA) modulação também estão incluídos. Esses métodos fornecem uma plataforma para investigar os mecanismos subjacentes a EndMT e a contribuição dos miRNAs para EndMT.
Endotelial-mesenquimais transição (EndMT) é o processo pelo qual uma célula endotelial diferenciada passa por uma variedade de alterações moleculares, resultando em uma célula mesenquimais do fibroblasto como1. EndMT foi inicialmente descrita como uma transformação de células endoteliais durante o desenvolvimento do coração2,3. No desenvolvimento inicial do coração, o tubo de coração consiste em um interior endocárdio e miocárdio um exterior. Estas duas camadas são separadas por uma camada de matriz extracelular, chamada geleia cardíaca. As células embrionárias endocárdico, que adquirem marcadores de células endoteliais, trânsito em células mesenquimais, invadem a geleia cardíaca subjacente e promovem a formação dos coxins cardíacas, fornecendo a base para as válvulas atrioventricular e septo e as válvulas semilunar. Além disso, foi sugerido para ser fontes de pericitos e células de músculo liso vascular em outros sistemas vasculares embrionários, incluindo vasos coronários, aorta abdominal e artéria pulmonar4,5,6EndMT. Além disso, o EndMT está implicada na fisiológico angiogênico brotando7.
Acumular evidência tem sugerido que o EndMT também está envolvida em várias doenças cardiovasculares e outras doenças1,8. EndMT-associado a condições incluem calcificação vascular, aterosclerose, hipertensão arterial pulmonar, malformação cavernosa, fibrose do órgão, remodelação de enxerto de veia, disfunção do enxerto em transplante renal e câncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. um recente relatório descrito que vários marcadores moleculares de EndMT podem ser uma ferramenta para a previsão do diagnóstico e prognóstico da disfunção do enxerto renal em rim transplante17. Modulação de vias de sinalização celulares EndMT-relacionados foram mostrados para melhorar várias condições de doença, incluindo Fibrose cardíaca e enxerto de veia remodelação no animal modelos8,15. Portanto, compreender os mecanismos subjacente EndMT é importante desenvolver estratégias diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT.
EndMT é caracterizada por perda de junções célula-célula, aumento da capacidade migratória, downregulation de genes específicos endoteliais como VE caderina e upregulation de genes mesenquimais incluindo actina de músculo liso-α (α-SMA). Além disso, EndMT e transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo similar que converte células epiteliais de células mesenquimais, estão associados a produção alterada de vários componentes da matriz extracelular, que pode contribuir para o desenvolvimento de tecido fibrose8,19.
Recentemente, vários estudos em vitro de EndMT tem elucidado detalhes dos mecanismos moleculares de EndMT15,20. EndMT é induzido por vários caminhos de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe1. Entre eles, o TGF-β tem um papel crucial na indução de EMT e EndMT. Em EndMT, uma exposição prolongada aos resultados de TGF-β em EndMT em várias células endoteliais, enquanto exposição curta parece ser insuficiente21. Descrevemos aqui um protocolo simples para indução de EndMT, no qual 1 de SVEN milha (MS-1) células endoteliais microvascular do pâncreas de rato sofrem EndMT em vitro após exposição prolongada ao TGF-β20. Neste modelo, várias análises a jusante podem ser realizadas para investigar características de marca do EndMT, incluindo as alterações morfológicas, downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de genes inflamatórios, do citoesqueleto e mesenquimais marcadores rearranjos e contração do gel de colágeno.
MicroRNAs (miRNAs) são 22 ~ nt pequenos RNAs regulamentares que dirigem a repressão posttranscriptional de mRNA vários alvos22,23. Através do reconhecimento de semente mediada por sequência alvo, miRNAs suprimir centenas de genes-alvo e modulam diversas funções celulares, tais como motilidade, proliferação e diferenciação celular. Este também é o caso de regulamento de EMT e EndMT, e vários miRNAs têm sido relatados como reguladores de EMT e EndMT24,25. O modelo de EndMT apresentado nesta revisão pode ser facilmente combinado com procedimentos de modulação de miRNA para testar as funções de miRNAs em EndMT. A presente revisão resume nossos procedimentos experimentais para investigar EndMT TGF-β-induzida em células de MS-1 e inclui também a comparação das condições de indução de EndMT por TGF-β em outras células endoteliais.
Tem sido relatado que ativado tratamento Ras e TGF-β para 24h induzida EndMT nas células do MS-1, enquanto o TGF-β sozinho falhou induzir a EndMT deste curto período,21. Consistentemente, observamos que TGF-β substancialmente induzida EndMT após o tratamento mais tempo (48-72 h) em MS-1 células20. EndMT tem sido repetidamente observado após tratamento prolongado com TGF-β (2-6 dias) em várias células endoteliais como umbilical humano veia células endoteliais (HU…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Zea Borok e Kohei Miyazono sugestões na preparação do manuscrito. H.I.S. e M.H. são compatíveis com o Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, e H.I.S. é suportado pelo Osamu Hayaishi Memorial bolsa de estudo no exterior. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de ciência Takeda (A.S.).
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |