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Análise molecular de transição endotelial-mesenquimais induzida por transformar o fator de crescimento-β sinalização

Published: August 03, 2018
doi:
10.3791/57577
, , ,
1David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research,Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Respiratory Medicine, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo, 3Hastings Center for Pulmonary Research, Division of Pulmonary, Critical Care and Sleep Medicine, Department of Medicine, Keck School of Medicine,University of Southern California, 4Department of Molecular Pathology, Graduate School of Medicine,The University of Tokyo

Summary

Um protocolo para indução em vitro de transição endotelial-mesenquimais (EndMT), que é útil para investigar as vias de sinalização celulares envolvido em EndMT, é descrito. Neste modelo experimental, EndMT é induzida pelo tratamento com TGF-β em células endoteliais de MS-1.

Abstract

Plasticidade fenotípica de células endoteliais está subjacente o desenvolvimento do sistema cardiovascular, doenças cardiovasculares e várias condições associadas com fibrose do órgão. Nestas condições, as células endoteliais diferenciadas adquirem fenótipos mesenquimais semelhante. Este processo é chamado de transição endotelial-mesenquimais (EndMT) e é caracterizado por downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de marcadores mesenquimais e alterações morfológicas. EndMT é induzida por várias vias de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe e regulado por mecanismos moleculares semelhantes de transição epitelial-mesenquimal (EMT) importante para gastrulação, fibrose do tecido, e metástase do cancro. Compreender os mecanismos da EndMT é importante para desenvolver abordagens diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT. Indução robusta do EndMT em vitro é útil para caracterizar assinaturas de expressão de gene comum, identificar mecanismos moleculares druggable e tela para moduladores de EndMT. Aqui, descrevemos um método em vitro para indução de EndMT. Células endoteliais microvascular do pâncreas de rato MS-1 submetido a EndMT após a exposição prolongada ao TGF-β e mostram upregulation de marcadores mesenquimais e mudanças morfológicas, bem como a indução de múltiplos inflamatórias quimiocinas e citocinas. Métodos de análise de microRNA (miRNA) modulação também estão incluídos. Esses métodos fornecem uma plataforma para investigar os mecanismos subjacentes a EndMT e a contribuição dos miRNAs para EndMT.

Introduction

Endotelial-mesenquimais transição (EndMT) é o processo pelo qual uma célula endotelial diferenciada passa por uma variedade de alterações moleculares, resultando em uma célula mesenquimais do fibroblasto como1. EndMT foi inicialmente descrita como uma transformação de células endoteliais durante o desenvolvimento do coração2,3. No desenvolvimento inicial do coração, o tubo de coração consiste em um interior endocárdio e miocárdio um exterior. Estas duas camadas são separadas por uma camada de matriz extracelular, chamada geleia cardíaca. As células embrionárias endocárdico, que adquirem marcadores de células endoteliais, trânsito em células mesenquimais, invadem a geleia cardíaca subjacente e promovem a formação dos coxins cardíacas, fornecendo a base para as válvulas atrioventricular e septo e as válvulas semilunar. Além disso, foi sugerido para ser fontes de pericitos e células de músculo liso vascular em outros sistemas vasculares embrionários, incluindo vasos coronários, aorta abdominal e artéria pulmonar4,5,6EndMT. Além disso, o EndMT está implicada na fisiológico angiogênico brotando7.

Acumular evidência tem sugerido que o EndMT também está envolvida em várias doenças cardiovasculares e outras doenças1,8. EndMT-associado a condições incluem calcificação vascular, aterosclerose, hipertensão arterial pulmonar, malformação cavernosa, fibrose do órgão, remodelação de enxerto de veia, disfunção do enxerto em transplante renal e câncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. um recente relatório descrito que vários marcadores moleculares de EndMT podem ser uma ferramenta para a previsão do diagnóstico e prognóstico da disfunção do enxerto renal em rim transplante17. Modulação de vias de sinalização celulares EndMT-relacionados foram mostrados para melhorar várias condições de doença, incluindo Fibrose cardíaca e enxerto de veia remodelação no animal modelos8,15. Portanto, compreender os mecanismos subjacente EndMT é importante desenvolver estratégias diagnósticas e terapêuticas, visando EndMT.

EndMT é caracterizada por perda de junções célula-célula, aumento da capacidade migratória, downregulation de genes específicos endoteliais como VE caderina e upregulation de genes mesenquimais incluindo actina de músculo liso-α (α-SMA). Além disso, EndMT e transição epitelial-mesenquimal (EMT), um processo similar que converte células epiteliais de células mesenquimais, estão associados a produção alterada de vários componentes da matriz extracelular, que pode contribuir para o desenvolvimento de tecido fibrose8,19.

Recentemente, vários estudos em vitro de EndMT tem elucidado detalhes dos mecanismos moleculares de EndMT15,20. EndMT é induzido por vários caminhos de sinalização, incluindo (TGF) do fator de crescimento transformante-β, Wnt e entalhe1. Entre eles, o TGF-β tem um papel crucial na indução de EMT e EndMT. Em EndMT, uma exposição prolongada aos resultados de TGF-β em EndMT em várias células endoteliais, enquanto exposição curta parece ser insuficiente21. Descrevemos aqui um protocolo simples para indução de EndMT, no qual 1 de SVEN milha (MS-1) células endoteliais microvascular do pâncreas de rato sofrem EndMT em vitro após exposição prolongada ao TGF-β20. Neste modelo, várias análises a jusante podem ser realizadas para investigar características de marca do EndMT, incluindo as alterações morfológicas, downregulation de marcadores endoteliais, upregulation de genes inflamatórios, do citoesqueleto e mesenquimais marcadores rearranjos e contração do gel de colágeno.

MicroRNAs (miRNAs) são 22 ~ nt pequenos RNAs regulamentares que dirigem a repressão posttranscriptional de mRNA vários alvos22,23. Através do reconhecimento de semente mediada por sequência alvo, miRNAs suprimir centenas de genes-alvo e modulam diversas funções celulares, tais como motilidade, proliferação e diferenciação celular. Este também é o caso de regulamento de EMT e EndMT, e vários miRNAs têm sido relatados como reguladores de EMT e EndMT24,25. O modelo de EndMT apresentado nesta revisão pode ser facilmente combinado com procedimentos de modulação de miRNA para testar as funções de miRNAs em EndMT. A presente revisão resume nossos procedimentos experimentais para investigar EndMT TGF-β-induzida em células de MS-1 e inclui também a comparação das condições de indução de EndMT por TGF-β em outras células endoteliais.

Protocol

1. indução de EndMT Manter as células de MS-1 em condições de cultura padrão e evitar a confluência. Uma fonte de células de MS-1 é descrita na Tabela de materiais. Para células de MS-1, uso médio mínimo essencial-α (α-MEM) com 10% de soro fetal bezerro (FCS), 50 U/mL penicilina e estreptomicina 50 de μg/mL. Células de lavar MS-1 em 10 cm do prato com 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e adicionam 1,0 mL de tripsina na placa. Incubar durante 5 min a 37 ° C. …

Representative Results

TGF-β é um potente indutor de EndMT em várias células endoteliais. Após o tratamento de 24 h com TGF-β nas células do MS-1, coloração para F-Actina mostra reorganização de actina stress fibras (figura 1A)20. Pré-tratamento com um inibidor ROCK Y-27632 inibe a indução de actina reorganização20. MS-1 células endoteliais alterar de uma morfologia de paralelepípedos, como a clássica para uma morfo…

Discussion

Tem sido relatado que ativado tratamento Ras e TGF-β para 24h induzida EndMT nas células do MS-1, enquanto o TGF-β sozinho falhou induzir a EndMT deste curto período,21. Consistentemente, observamos que TGF-β substancialmente induzida EndMT após o tratamento mais tempo (48-72 h) em MS-1 células20. EndMT tem sido repetidamente observado após tratamento prolongado com TGF-β (2-6 dias) em várias células endoteliais como umbilical humano veia células endoteliais (HU…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos Zea Borok e Kohei Miyazono sugestões na preparação do manuscrito. H.I.S. e M.H. são compatíveis com o Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, e H.I.S. é suportado pelo Osamu Hayaishi Memorial bolsa de estudo no exterior. Este trabalho foi financiado por um subsídio da Fundação de ciência Takeda (A.S.).

Materials

MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027
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References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).

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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).
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