Summary

Molekylær analyse af endotel-mesenchymale overgang induceret af Transforming Growth Factor-β signalering

Published: August 03, 2018
doi:

Summary

En protokol til in vitro- induktion i endothelial-mesenchymale overgang (EndMT), som er nyttige for efterforskningen cellulær signalering veje involveret i EndMT, er beskrevet. I denne eksperimentelle model, er EndMT foranlediget af behandling med TGF-β i endothelial celler, MS-1.

Abstract

Fænotypisk plasticitet i endothelial celler ligger til grund for systemudvikling af hjerte-kar-, hjerte-kar-sygdomme og forskellige betingelser forbundet med orgel fibrose. I disse betingelser erhverve differentieret endotelceller mesenchymale-lignende fænotyper. Denne proces kaldes endotel-mesenchymale overgang (EndMT) og er kendetegnet ved downregulation i endothelial markører, opregulering af mesenchymale markører og morfologiske ændringer. EndMT er foranlediget af flere signaling veje, herunder omdanne vækst faktor (TGF)-β, Wnt og hak, og reguleret af molekylære mekanismer ligner dem af epitel-mesenchymale overgang (EMT) vigtig for gastrulation, væv fibrose, og kræft metastaser. Forstå mekanismerne i EndMT er vigtigt at udvikle diagnostiske og terapeutiske strategier rettet mod EndMT. Robust induktion af EndMT i vitro er nyttige til at karakterisere fælles gene expression signaturer, identificere druggable molekylære mekanismer og skærmen for modulatorer af EndMT. Her, beskriver vi en in vitro- metode til induktion af EndMT. MS-1 mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller underkastes EndMT efter langvarig udsættelse for TGF-β og vise opregulering af mesenchymale markører og morfologiske ændringer samt induktion af flere inflammatoriske kemokiner og cytokiner. Metoder til analyse af mikroRNA (miRNA) graduering er også inkluderet. Disse metoder giver en platform til at undersøge mekanismerne bag EndMT og bidrag af miRNAs til EndMT.

Introduction

Endotel-mesenchymale overgang (EndMT) er den proces, hvorved en differentieret endotel celle gennemgår en række forskellige molekylære ændringer, hvilket resulterer i en fibroblast-lignende mesenchymale celler1. EndMT blev oprindeligt beskrevet som en endotel celle transformation under udviklingen af hjertet2,3. I tidlig udvikling af hjertet består hjerte rør af en indre endokardiet og en ydre myokardiet. Disse to lag er adskilt af et lag af ekstracellulære matrix kaldes den kardiale jelly. De embryonale endokardial celler, som erhverver endotel celle markører, transit til mesenchymale celler, invadere de underliggende hjerte gelé og fremme dannelsen af den kardiale puder, giver grundlaget for atrieventrikelklapperne og septum og semilunar ventiler. Desuden er EndMT blevet foreslået for at være kilder til pericytes og vaskulære glatte muskelceller i andre embryonale vaskulære systemer, herunder koronar fartøjer, abdominal aorta og lungepulsåren4,5,6. Derudover er EndMT impliceret i fysiologiske angiogene spiring7.

Akkumulere beviser har foreslået, at EndMT også er involveret i flere hjerte-kar-sygdomme og andre sygdomme1,8. EndMT-associerede betingelser omfatter vaskulære forkalkning, åreforkalkning, pulmonal arteriel hypertension, bundløs misdannelser, orgel fibrose, vene graft remodeling, allograft dysfunktion i nyre transplantation og kræft8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en nylig rapport beskrev, at flere molekylære EndMT markører kan være et redskab til diagnose og prognose forudsigelse af renal graft dysfunktion i nyre transplantation17. Graduering af EndMT-relaterede cellulær signalering veje har vist sig at forbedre adskillige sygdomstilstande, herunder hjerte fibrose og vene graft remodeling i dyre modeller8,15. Derfor er forstå mekanismerne underliggende EndMT vigtigt at udvikle diagnostiske og terapeutiske strategier rettet mod EndMT.

EndMT er karakteriseret ved tab af celle-celle vejkryds, forøgelse af vandrende potentiale, downregulation i endothelial-specifikke gener som VE-cadherin, og opregulering af mesenchymale gener herunder α-glat muskel aktin (α-SMA). Desuden er EndMT og epitel-mesenchymale overgang (EMT), en lignende proces, der konverterer epitelceller mesenchymale celler, forbundet med ændret produktion af forskellige ekstracellulære matrix komponenter, som kan bidrage til udviklingen af væv fibrose8,19.

For nylig, flere in vitro- undersøgelser af EndMT har belyst detaljer molekylære mekanismer i EndMT15,20. EndMT er foranlediget af forskellige signaling veje herunder omdanne vækst faktor (TGF)-β, Wnt, og hak1. Blandt dem spiller TGF-β afgørende roller i induktion af både EMT og EndMT. Lang tids udsættelse for TGF-β resultater i EndMT i forskellige endotelceller, i EndMT, mens korte eksponering ser ud til at være utilstrækkelig21. Vi har her beskrevet en enkel protokol for EndMT induktion, i hvilke MILE SVEN 1 (MS-1) mus i bugspytkirtlen mikrovaskulære endotelceller gennemgå EndMT i vitro efter langvarig udsættelse for TGF-β20. I denne model, kan flere downstream analyser udføres for at undersøge hallmark egenskaber i EndMT, herunder morfologiske ændringer, downregulation i endothelial markører, opregulering af mesenchymale markører og inflammatoriske gener, cytoskeletal rearrangementer, og kollagen gel sammentrækning.

MicroRNA (miRNAs) er ~ 22 nt små lovgivningsmæssige RNA’er, der direkte posttranskriptionelle undertrykkelse af forskellige mRNA mål22,23. Gennem seed sekvens-medieret mål anerkendelse, miRNAs undertrykke hundredvis af target gener og modulere forskellige cellulære funktioner såsom Celledifferentiering, spredning og motilitet. Dette er også tilfældet for regulering af EMT og EndMT, og flere miRNAs er blevet rapporteret som regulatorer af EMT og EndMT24,25. Den EndMT model præsenteret i denne gennemgang kan let kombineres med miRNA graduering procedurer til test af miRNAs rolle i EndMT. Denne undersøgelse opsummerer vores eksperimentelle procedurer for at undersøge TGF-β-induceret EndMT i MS-1 celler og omfatter også sammenligning af EndMT induktion af TGF-β forhold i andre endotelceller.

Protocol

1. induktion af EndMT Vedligeholde MS-1 celler i standard dyrkningsbetingelserne og undgå confluency. En kilde til MS-1 celler er beskrevet i Tabel af materialer. For MS-1 celler, skal du bruge Minimum afgørende Medium-α (MEM-α) med 10% føtalt kalveserum (FCS), 50 U/mL penicillin og 50 μg/mL streptomycin. Vaske MS-1 celler på 10 cm parabol med 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og tilsættes 1,0 mL trypsin til pladen. Inkuber i 5 min. ved 37 ° C. Frigør celler …

Representative Results

TGF-β er en potent inducer af EndMT i forskellige endotelceller. Efter 24 timer behandling med TGF-β i MS-1 celler viser farvning for F-actin reorganisering af actin stress fibre (figur 1A)20. Forbehandling med en ROCK hæmmer Y-27632 hæmmer induktion af actin reorganisering20. MS-1 endotelceller Skift fra en klassisk brostensbelagte-lignende morfologi til en mesenchymale spindel-formet morfologi på TGF-β b…

Discussion

Det er blevet rapporteret, at aktiveret Ras og TGF-β behandling for 24 h induceret EndMT i MS-1 celler, mens TGF-β alene undladt at fremkalde EndMT i denne korte periode21. Konsekvent, konstaterede vi, at TGF-β væsentligt induceret EndMT efter længere behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT er gentagne gange blevet observeret efter langvarig behandling med TGF-β (2-6 dage) i forskellige endotelceller såsom menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC), mennes…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Zea Borok og Kohei Miyazono for forslag under forberedelse af manuskript. H.I.S. og M.H. understøttes af Uehara Memorial Foundation Research Fellowship, og H.I.S. er understøttet af Osamu Hayaishi Mindelegat for Study Abroad. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Takeda Science Foundation (A.S.).

Materials

MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).

Play Video

Cite This Article
Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

View Video