Molekylær analyse av Endothelial-mesenchymal overgang av omforming vekst faktor-β signalisering
Summary
En protokoll for i vitro induksjon av endothelial-mesenchymal overgang (EndMT), som er nyttig for å undersøke mobilnettet signalveier involvert i EndMT, er beskrevet. I denne eksperimentelle modellen er EndMT indusert av behandling med TGF-β i MS-1 endotelceller.
Abstract
Fenotypiske plastisitet av endotelceller ligger under kardiovaskulære systemutvikling, kardiovaskulære sykdommer og ulike forhold knyttet til orgel fibrose. I disse forholdene erverve differensiert endotelceller mesenchymal-lignende fenotyper. Denne prosessen kalles endothelial-mesenchymal overgang (EndMT) og er preget av downregulation av endothelial markører, oppregulering av mesenchymal markører og morfologiske endringer. EndMT er indusert av flere signalveier, inkludert omforming vekst faktor (TGF)-β, Wnt og hakk, og regulert av molekylære mekanismer ligner på de av epitelial-mesenchymal overgang (EMT) viktig for gastrulation, vev fibrosis, og kreft metastasering. Forstå mekanismene av EndMT er viktig å utvikle diagnostiske og terapeutiske metoder rettet mot EndMT. Robust induksjon av EndMT i vitro er nyttig å karakterisere felles genuttrykk signaturer, identifisere druggable molekylære mekanismer og skjerm for modulatorer av EndMT. Her beskriver vi en i vitro metode for induksjon av EndMT. MS-1 musen bukspyttkjertelen mikrovaskulær endotelceller gjennomgå EndMT etter langvarig eksponering for TGF-β og Vis oppregulering av mesenchymal markører og morfologiske endringer og induksjon av flere inflammatorisk chemokines og cytokiner. Metoder for analyse av microRNA (miRNA) modulering er også inkludert. Disse metodene gir en plattform for å undersøke mekanismene bak EndMT og bidrag av miRNAs til EndMT.
Introduction
Endothelial-mesenchymal overgang (EndMT) er prosessen der en differensiert endothelial celle gjennomgår ulike molekylær endringer, som resulterer i en fibroblast-lignende mesenchymal celle1. EndMT ble først beskrevet som en endothelial celle transformasjon under utviklingen av hjertet2,3. I tidlig heart utvikling består hjertet røret av en indre endocardium og en ytre myokard. Disse to lagene er atskilt av et ekstracellulær matrix kalles cardiac gelé. Embryonale endocardial celler som skaffer endothelial celle markører, transitt i mesenchymal celler, invadere underliggende cardiac gelé og fremme dannelsen av cardiac puter, som er grunnlaget for atrioventrikulær ventiler og septum og semilunar ventiler. Videre har EndMT blitt foreslått for å være kilder til pericytes og vaskulær glatte muskelcellene i andre embryonale vaskulære systemer inkludert koronar fartøy, abdominal aorta og lungearterien4,5,6. I tillegg er EndMT innblandet i fysiologiske angiogenic spirende7.
Samler bevis har foreslått at EndMT er også involvert i flere karsykdommer og andre sykdommer1,8. EndMT-assosiert tilstandene omfatter vaskulær forkalkninger, atherosclerosis, pulmonal arteriell hypertensjon, kavernøse misdannelse, orgel fibrose, vene pode remodeling, allograft dysfunksjon i nyre transplantasjon, og kreft8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. en fersk rapport beskrevet at flere molekylære EndMT markører kan være et verktøy for diagnose og prognose prediksjon av nyre pode dysfunksjon i nyre transplantasjon17. Modulering av EndMT-relaterte mobilnettet signalveier har vist seg å forbedre flere sykdom betingelser inkludert cardiac fibrose og vene pode remodeling i dyr modeller8,15. Forstå mekanismene er underliggende EndMT derfor viktig å utvikle diagnostiske og terapeutiske strategier målretting EndMT.
EndMT er preget av tap av celle-celle veikryss, økning i vandrende potensial, downregulation av endothelial-spesifikke gener som VE-cadherin og oppregulering av mesenchymal gener inkludert α-glatt muskel utgangen (α-SMA). I tillegg er EndMT og epithelial-mesenchymal overgang (EMT), en tilsvarende prosess som konverterer epitelceller mesenchymal celler, forbundet med meditativ produksjon av ulike ekstracellulær matrix komponenter som kan bidra til utvikling vev fibrose8,19.
Flere i vitro studier av EndMT har nylig belyst detaljer om molekylære mekanismer EndMT15,20. EndMT er indusert av ulike signalveier inkludert omforming vekst faktor (TGF)-β, Wnt, og hakk1. Blant dem spiller TGF-β viktige roller i induksjon av både EMT og EndMT. I EndMT, langvarig eksponering for TGF-β resultater i EndMT i forskjellige endotelceller, mens kort eksponering synes å være utilstrekkelige21. Vi her har beskrevet en enkel protokoll for EndMT induksjon, i hvilken MILE SVEN 1 (MS-1) musen bukspyttkjertelen mikrovaskulær endotelceller gjennomgå EndMT i vitro etter langvarig eksponering for TGF-β20. I denne modellen, kan flere nedstrøms analyser utføres for å undersøke hallmark funksjoner i EndMT, inkludert morfologiske endringer, downregulation av endothelial markører, oppregulering av mesenchymal markører og provoserende gener, cellen cytoskjelett rearrangements og kollagen gel sammentrekning.
MicroRNAs (miRNAs) er ~ 22 nt liten regulatoriske RNAs som direkte posttranscriptional undertrykkelse av ulike mRNA mål22,23. Gjennom frø sekvens-mediert målet anerkjennelse, miRNAs undertrykke hundrevis av målet gener og modulere mangfoldig cellular funksjonene som celledifferensiering, spredning og motilitet. Dette er også tilfelle for regulering av EMT og EndMT, og flere miRNAs har blitt rapportert som regulatorer av EMT og EndMT24,25. EndMT modellen presentert i denne gjennomgangen kan lett kombineres med miRNA modulering prosedyrer å teste rollene som miRNAs i EndMT. Stede gjennomgangen oppsummerer våre eksperimentelle prosedyrer for å undersøke TGF-β-indusert EndMT i MS-1 celler og inneholder sammenligning av betingelser for EndMT induksjon av TGF-β i andre endotelceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det har blitt rapportert at aktivert Ras og TGF-β behandling for 24 h indusert EndMT i MS-1 celler, mens TGF-β alene mislyktes å indusere EndMT i denne korte perioden21. Konsekvent, observerte vi at TGF-β vesentlig indusert EndMT etter lengre behandling (48-72 h) i MS-1 celler20. EndMT er observert flere ganger etter langvarig behandling med TGF-β (2 – 6 dager) i forskjellige endotelceller som menneskelige umbilical vene endotelceller (HUVEC), menneskelige kutan mikr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Zea Borok og Kohei Miyazono for forslag i utarbeidelsen av manuskriptet. H.I.S. og M.H. støttes av forskningsstipend for Uehara Memorial Foundation, og H.I.S. er støttet av Osamu Hayaishi Memorial stipend for studier i utlandet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Takeda Science Foundation (AS).
Materials
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
References
- Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. , (2017).
- Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).
- Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).
- Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
- DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).
- Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).
- Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).
- Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
- Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).
- Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. , 124-127 (2016).
- Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).
- Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
- Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).
- Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234 (2014).
- Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
- Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).
- Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).
- Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).
- Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).
- Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).
- Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs–the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).
- Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).
- Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).
- Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).
- Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).
- Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).
- Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).
- Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10 (3), e0119655 (2015).
- Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).
- Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).
- Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).
- Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).
- Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).
- Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).
- Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).
