Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

ويرد وصف بروتوكول لتحريض في المختبر الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت)، ومفيدة للتحقيق في مسارات الإشارات الخلوية المشتركة في اندمت،. في هذا النموذج التجريبي، هو اندمت الناجمة عن المعاملة مع TGF-β في خلايا بطانية 1 مللي ثانية.

Abstract

اللدونة المظهرية من خلايا بطانية يكمن وراء تطوير نظام القلب والأوعية الدموية، وأمراض القلب والأوعية الدموية، ومختلف الشروط المرتبطة بالتليف الجهاز. في ظل هذه الظروف، يكتسب خلايا بطانية المتباينة تعمل الوسيطة مثل. هذه العملية يسمى الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت) ويتسم ب downregulation علامات بطانية، upregulation من علامات الوسيطة، والتغييرات الشكلية. اندمت هو الناجمة عن مسارات إشارات عدة، بما في ذلك تحويل عامل النمو (TGF)-β، Wnt، والدرجة، وينظمها الجزيئية آليات مماثلة لتلك التي الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) هام ل gastrulation، تليف الأنسجة، و سرطان خبيث. فهم آليات اندمت مهم لوضع نهج التشخيصية والعلاجية التي تستهدف اندمت. تحريض قوي اندمت في المختبر مفيد لتميز التوقيعات تعبير الجينات المشتركة، وتحديد الآليات الجزيئية دروجابل وشاشة المغيرون اندمت. وهنا يصف لنا أسلوب في المختبر لتحريض اندمت. خلايا بطانية microvascular البنكرياس الماوس MS-1 الخضوع اندمت بعد التعرض لفترة طويلة إلى TGF-β وإظهار upregulation من علامات الوسيطة والتغييرات الشكلية وكذلك تحريض السيتوكينات والمستقطبات التهابات متعددة. أساليب لتحليل ميكرورنا (ميرنا) التحوير مدرجة أيضا. هذه الأساليب توفير منبر للتحقيق في الآليات الكامنة وراء اندمت والمساهمة من ميرناس إلى اندمت.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الانتقال غشائي الوسيطة (اندمت) هو العملية التي يخضع خلية غشائي متمايزة مجموعة متنوعة من التغيرات الجزيئية، الناتج في خلية مثل تنتجها الخلايا الليفية الوسيطة1. ووصفت اندمت في البداية تحول خلايا غشائي أثناء التطوير من قلب2،3. في قلب التنمية المبكرة، يتألف أنبوب القلب البطانة داخلية وعضلة القلب خارجي. يتم فصل هذه الطبقتين طبقة من المصفوفة خارج الخلية تسمى هلام القلب. الخلايا الجنينية للوفلر، التي تكتسب علامات خلية بطانية، العبور إلى الخلايا الوسيطة وتغزو هلام القلب الكامنة، وتشجيع تشكيل الوسائد القلب، توفر الأساس للصمامات بي وحاجز والصمامات سيميلونار. وعلاوة على ذلك، قد اقترح اندمت لتكون مصادر بيريسيتيس وخلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية في نظم الأوعية الدموية الجنينية الأخرى بما في ذلك الأوعية التاجية والشريان الاورطي البطني والشريان الرئوي4،،من56. وبالإضافة إلى ذلك، هو تورط اندمت في الأوعية الفسيولوجية التي تنتشر في7.

تتراكم الأدلة قد اقترح أن اندمت تشارك أيضا في العديد من أمراض القلب والأوعية الدموية وغيرها من الأمراض81،. وتشمل الشروط المرتبطة اندمت تكلس الأوعية الدموية، تصلب الشرايين، وارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي، وتشوه الكهفي، تليف الجهاز، يعيد البناء الابتزاز المنوال، الخلل في allograft في زرع الكلي والسرطان8، 9،10،11،،من1213،،من1415،16،17، 18-وصف تقرير صدر مؤخرا أن عدة علامات اندمت الجزيئية يمكن أن تكون أداة للتنبؤ التشخيص والتكهن بالخلل الوظيفي الكلوي الاختلاس في زرع الكلي17. تعديل مسارات الإشارات الخلوية المتصلة اندمت قد ثبت أن تحسين ظروف المرض عدة بما في ذلك تليف القلب ويعيد البناء الابتزاز المنوال في الحيوان النماذج8،15. ولذلك فهم الآليات الكامنة وراء اندمت هامة لتطوير استراتيجيات تشخيصية وعلاجية تستهدف اندمت.

اندمت تتسم بفقدان تقاطعات خلية خلية، والزيادة في إمكانيات الهجرة، downregulation الجينات غشائي محددة مثل هاء-كادهيرين، و upregulation من الجينات الوسيطة بما في ذلك العضلات الملساء α أكتين (α-SMA). وباﻹضافة إلى ذلك، اندمت والانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT)، عملية مماثلة تقوم بتحويل الخلايا الظهارية للخلايا الوسيطة، المرتبطة بالإنتاج المتغيرة لمختلف عناصر المصفوفة خارج الخلية، التي قد تسهم في تطوير أنسجة التليف8،19.

في الآونة الأخيرة، عدة دراسات في المختبر من اندمت قد شرحت تفاصيل الآليات الجزيئية اندمت15،20. اندمت هو الناجمة عن مسارات الإشارات المختلفة بما في ذلك تحويل عامل النمو (TGF)-β، Wnt، وتحقيقها1. فيما بينها، TGF-β يلعب دور محوري في استحثاث EMT واندمت. في اندمت، لفترات طويلة التعرض لنتائج TGF-β في اندمت في خلايا بطانية شتى، في حين يبدو أن التعرض القصير غير كافية21. ونحن هنا وصف بروتوكولا مباشرة لتحريض اندمت، في أي ميل سفين 1 (MS-1) الخضوع للماوس البنكرياس خلايا بطانية microvascular اندمت في المختبر بعد التعرض لفترة طويلة إلى TGF-β20. في هذا النموذج، يمكن إجراء تحليلات متعددة للمتلقين للمعلومات للتحقيق في ملامح مميزة اندمت، بما في ذلك التغييرات الشكلية، downregulation علامات بطانية، upregulation من علامات الوسيطة والجينات التحريضية، سيتوسكيليتال ترتيبات جديدة، وانكماش جل الكولاجين.

ميكرورناس (ميرناس) هي ~ 22 nt الكشف التنظيمية الصغيرة أن المباشرة القمع بوسترانسكريبشونال مختلف مرناً الأهداف22،23. من خلال الاعتراف بالهدف تسلسل بوساطة البذور، ميرناس قمع مئات جينات المستهدفة وتعدل الوظائف الخلوية المتنوعة مثل تمايز الخلايا وانتشارها، وحركية. وهذا هو الحال لتنظيم EMT واندمت أيضا، وأبلغ ميرناس عدة المنظمين من24،EMT واندمت25. يمكن الجمع بين نموذج اندمت قدم في هذا الاستعراض بسهولة مع ميرنا تعديل إجراءات لاختبار أدوار ميرناس في اندمت. هذا الاستعراض يلخص لدينا إجراءات تجريبية للتحقيق اندمت TGF-β-المستحث في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 ويشمل أيضا مقارنة شروط الاستقراء اندمت طريق TGF-β في خلايا بطانية أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-تحريض اندمت

  1. الحفاظ على خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 في ظروف الثقافة الموحدة وتجنب كونفلوينسي. مصدرا لخلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 يرد في الجدول للمواد. لمرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا، استخدام "الحد الأدنى الأساسية" المتوسطة-α (MEM-α) مع 10% مصل العجل الجنين (FCS) والبنسلين U/mL 50 50 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
  2. طبق مع 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الخلايا يغسل MS-1 على 10 سم وإضافة 1.0 مل التربسين اللوحة. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. فصل الخلايا باستخدام 9 مل وسائط الثقافة. جمع تعليق خلية في أنبوب 15 مل.
  4. الطرد المركزي بتعليق خلية في 300-400 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. بعناية إزالة المادة طافية وتعليق بيليه الخلية في حرارة قبل الثقافة الإعلامية.
  6. حساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق استخدام الحل تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير قياسي أو عداد تلقائي خلية.
  7. 1 MS بلايت الخلايا على لوحات الثقافة القياسية غير المصقول في 0.5 × 103 خلايا كل سم2 لفترة طويلة الأجل الثقافة. على سبيل المثال، لوحة 5.0 × 103 خلايا كل بئر في 6 الثقافة أيضا لوحة. استخدام نفس الوسائط الثقافة بما في ذلك تركيز نفس FCS. في الخلايا من مرض التصلب العصبي المتعدد-1، يستحث TGF-β اندمت في المدى الطويل الثقافة (على الأقل ح 48 – 72) مع استخدام FCS.
  8. تنشيط خلايا بطانية مع TGF-β2 (تركيز نهائي من 1 نانوغرام/مليلتر) بعد 24 ساعة.
  9. خلايا الثقافة في حاضنة هوميديفيد (5% CO2، 37 درجة مئوية). رصد الخلايا يوميا عند التركيز على التغييرات الشكلية.
  10. استبدال وسائط الإعلام مع وسائط الثقافة المعالجون مسبقاً الطازجة التي تحتوي على TGF-β2 بعد 48 ساعة معاملة مع TGF-β في ثقافة طويلة الأجل.
  11. الشروع في تحليل المتلقين للمعلومات. عادة، إعادة تنظيم أكتين ويلاحظ بعد 24 ساعة علاج، ولوحظت downregulation علامات بطانية و upregulation من علامات الوسيطة بعد 48 – 72 ساعة معاملة مع TGF-β.

2-إيمونوسيتوتشيميكال التحليل

  1. الحفاظ على خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 في ظروف الثقافة القياسية.
  2. كذلك الخلية خلايا MS بلايت 1 إلى 4 شرائح دائرة الثقافة في 1.0 × 103 خلايا كل بئر (1.7 سم2). الشرائح مغلفة مسبقاً مع الجيلاتين. استخدام 0.5 – 1.0 مل من وسائط الثقافة الواحدة وكذلك.
  3. تنشيط خلايا بطانية مع TGF-β2 (تركيز نهائي من 1 نانوغرام/مليلتر) بعد 24 ساعة. عند تحليل مشاركة روك في اندمت، إضافة أ قبل ح 1 (10 ميكرومترات) مثبط Y-27632 روك للعلاج TGF-β. وعند تقييم تأثير تثبيط الإشارات TGF-β، يمكن استخدام مثبطات كيناز مستقبلات TGF-β.
  4. خلايا الثقافة في حاضنة هوميديفيد (5% CO2، 37 درجة مئوية). ويلاحظ أكتين إعادة التنظيم في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 بعد 24 ساعة علاج مع TGF-β. تغييرات أخرى أصبح واضحا بعد 48 – 72 ساعة علاج. لثقافة ح 72، استبدال الوسائط مع وسائط جديدة تحتوي على TGF-β بعد 48 ساعة معاملة مع TGF-β.
  5. واو-أكتين تلطيخ
    1. بعد 24 ساعة علاج TGF-β، قم بإزالة الوسائط وإصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني 1 x لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    2. احتضان مع 0.2% X-100 تريتون لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    4. احتضان مع إيسوثيوسياناتي ب فالويدين-تيتراميثيلرهوداميني من الامانيت phalloides المخفف 150-fold مع حظر المخزن المؤقت لح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    5. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    6. وصمة عار الأنوية بالأصباغ سينين الحمض النووي ملزم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. شرائح الشطف وجبل كوفيرسليبس الوجه للأسفل على شريحة باستخدام شريحة متزايدة في وسائل الإعلام.
    8. مراقبة مع مجهر [كنفوكل]. استخدام ليزر نانومتر 543 وعامل تصفية انبعاثات من 560 – 615 نانومتر للكشف عن الأسفار فالويدين. استخدام ليزر 633 نانومتر وعامل تصفية انبعاثات أكثر من 650 نانومتر لتلطيخ النووية. بناء على المعاملة مع TGF-β، أن تراعي تشكيل ألياف سميكة من الإجهاد.
  6. هاء-كادهيرين وتلطيخ α-SMA
    1. بعد 72 ساعة علاج TGF-β، قم بإزالة الوسائط، وإصلاح الخلايا مع الباردة 50% والميثانول والاسيتون 50% (0.5 – 1.0 مل في البئر) لمدة 5 دقائق.
    2. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x (0.5 – 1.0 مل في البئر).
    3. احتضان مع الأجسام الأولية في المخزن المؤقت حظر بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في الظلام وفقا للتركيز الموصى بها الشركة المصنعة. هاء-كادهيرين استخدام [مونوكلونل] جسم (BV13، وتمييع 1: 100) ومترافق Cy3 α-SMA [مونوكلونل] جسم (1A4، وتمييع 1: 200)20.
    4. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    5. احتضان الخلايا مع أخضر مترافق صبغ ثانوية جسم إلى جسم VE-كادهيرين في المخزن المؤقت حظر لح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام وفقا للتركيز الموصى بها الشركة المصنعة.
    6. شطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
    7. وصمة عار الأنوية بالأصباغ سينين الحمض النووي ملزم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. شرائح الشطف وجبل كوفيرسليبس الوجه للأسفل على شريحة باستخدام شريحة متزايدة في وسائل الإعلام.
    9. مراقبة مع مجهر [كنفوكل]. استخدام ليزر نانومتر 543 وعامل تصفية انبعاثات من 560 – 615 نانومتر للكشف عن α-SMA (Cy3). استخدام ليزر 488 نانومتر وعامل تصفية انبعاثات 505-550 نيوتن متر للكشف عن كادهيرين VE. عادة، عند العلاج مع العلاج TGF-β، نقصان في إشارات VE-كادهيرين وسوف يلاحظ زيادة في إشارات α-SMA.

3-والرزن انكماش جل الكولاجين ثلاثي الأبعاد

  1. أداء الثقافة من مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا مع أو بدون TGF-β ح 72 قبل الكولاجين هلام انكماش المقايسة.
  2. إعداد النوع أنا جل الكولاجين على الجليد. مزيج الحل الكولاجين الباردة والمتوسطة MEM x 10 مركزة، والكولاجين تمييع مخزن يحتوي على هيدروكسيد الصوديوم N 0.05 و 2.2 في المائة ناكو3و 200 ملم حبيس الأس الهيدروجيني 7.4 8:1: نسبة 1.
  3. ميكس 200 مل من عنصر التحكم أو معلقات TGF-β-يعامل خلية غشائي (1.0 × 106 خلايا/200 ميكروليتر) و 800 ميكروليتر من حل جل الكولاجين. إضافة العينات المعالجة، ل TGF-β TGF-β2 (1 نانوغرام/ملليلتر) على تعليق خلية.
  4. إضافة مل 1.0 من الخليط لكل بئر من لوحات الثقافة 12-جيدا والسماح لترسيخ في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 – 60 دقيقة.
  5. وبعد جيلاتينيزيشن، تراكب 1.0 مل من MEM-α التي تحتوي على 10 ٪ السفح و 50 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 50 ميكروغرام/مل لتعويم الهلام. إضافة العينات المعالجة، ل TGF-β TGF-β2 (1 نانوغرام/مل) لوسائل الإعلام.
    ملاحظة: لعينات TGF-β، تعامل، إضافة TGF-β لجل وثقافة وسائل الإعلام على السواء.
  6. احتضان المواد الهلامية الطافية في 37 درجة مئوية ح 48.
  7. مسح الصور من المواد الهلامية من الجزء السفلي من لوحات باستخدام ماسح ضوئي. وبدلاً من ذلك، تسجيل صور الجل باستخدام كاميرا رقمية على مسافة ثابتة أعلاه المواد الهلامية.
  8. تحديد مقدار المساحة السطحية جل استناداً إلى عدد بكسل باستخدام إيماجيج. حدد الجل باستخدام تحديد يدوي أو أدوات التحديد ذات الصلة، أو حدد استخدام هلام "صورة | ضبط | تلوين عتبة "أداة، ومن ثم تحديد مجال استخدام هلام" تحليل | أمر التدبير ".

4-تثبيط ميرنا الأنشطة بميرنا المستندة إلى "تأمين الحمض النووي" مثبطات

  1. الحفاظ على خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 في ظروف الثقافة القياسية.
  2. ترانسفيكت مثبطات ميرنا مؤمن الحمض النووي (LNA)، ميرنا الاصطناعية الدوبلكس أو سيرناس (20 أو 50 من شمال البحر الأبيض المتوسط) باستخدام الكواشف ليبوفيكشن وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ووصفت مصادر LNA مثبطات ميرنا, ميرنا الاصطناعية الدوبلكس، وسيرناس وتفاصيل في أعمالنا السابقة تقارير26،27. في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا، تعمل الإجراءات القياسية تعداء استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة جيدا للأخذ بمثبطات ميرنا LNA أو الدوبلكس ميرنا الاصطناعية أو سيرناس.
  3. بعد ح 16-48، حفز خلايا بطانية مع TGF-β2 (تركيز نهائي من 1 نانوغرام/مليلتر).
  4. انتقل إلى مختلف التحليلات المتلقين للمعلومات بما في ذلك تحليل التعبير (RT-PCR الكمي وتحاليل الحمض النووي الريبي-تسلسل (الحمض النووي الريبي-seq)) وتحليل immunocytochemical المقايسة مراسل الجيش الملكي النيبالي. وقد وصف تحليلات المصب في أعمالنا السابقة تقارير26،،من2027.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

TGF-β محفز قوي اندمت في مختلف خلايا بطانية. بعد العلاج 24 ساعة مع TGF-β في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1، يظهر تلطيخ أكتين و إعادة تنظيم أكتين إجهاد الألياف (الشكل 1A)20. المعالجة المسبقة مع مثبط روك Y-27632 يحول دون تنظيم دورات تعريفية ل إعادة تنظيم أكتين20. تغيير خلايا بطانية MS-1 من مورفولوجيا حصاة كبيرة مثل كلاسيكية إلى علم التشكل الوسيطة على شكل عمود الدوران عند معاملة TGF-β (الشكل 1B). TGF-β-تعامل الخلايا تفقد الاتصال خلية خلية. بعد العلاج مع TGF-β ح 48 – 72، تثبت التحليلات immunocytochemical التعبير انخفض من هاء-كادهيرين وزيادة التعبير عن α-SMA (الشكل 1). TGF-β جذريا الحث على التعبير عن α-SMA على الصعيدين مرناً والبروتين في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 بعد 48 – 72 ساعة علاج (الأرقام 1 و 1E). وتشمل الثدييات TGF-β TGF-β1، 2، و 3 إيسوفورمس. أظهرت دراسة سابقة استخدام الماوس مثقف وسادة للوفلر explants TGF-β2 ولكن لا TGF-β3 إلزامي للتحول من وسادة للوفلر الخلايا28. من ناحية أخرى، نحن سابقا مقارنة آثار isoforms الثلاثة على التعبير α-SMA وأكدت أن isoforms جميع المثل التي يسببها التعبير α-SMA في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 خلايا20. يظهر الكولاجين هلام انكماش المقايسة انكماش محسنة من نوع الكولاجين أنا جل خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 بعد العلاج TGF-β (الشكل 1F). وتقترح هذا التأثير اكتساب قدرة الخلايا الوسيطة أن يعيد المصفوفة خارج الخلية. هذه السمات سمات مميزة اندمت20. لدينا التقرير السابق20، قمعت المعاملة مع مثبط روك Y-27632 بشدة الاستقراء من علامات الوسيطة α-SMA و SM22α دون قمع ما يصاحب ذلك من تحريض الجينات المستهدفة TGF-β الأخرى مثل فيبرونيكتين 1 و 2 نظام التمثيل التناسبي المختلط.

اندمت عملية ديناميكية للغاية. في الخلايا من مرض التصلب العصبي المتعدد-1، آثار TGF-β α-SMA التعبير ومورفولوجيا عكوس؛ بعد الحرمان TGF-β، α-SMA التعبير النقصان إلى المستويات القاعدية (الشكل 2A)، والخلايا استرداد من حصاة كبيرة تشبه مورفولوجيا (الشكل 2). وبالإضافة إلى ذلك، يرتبط التعريفي اندمت و EMT مع التغيرات الدينامية في القدرة الافرازية من المستقطبات والسيتوكينات متعددة. متعددة المستقطبات التحريضية والسيتوكينات بما في ذلك CCL17، CX3CL1، CXCL16، وايل-6، و Angptl2 هي فعل TGF-β في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا، التي كنا سابقا عينت المرتبطة اندمت النمط الظاهري الافرازية (اندمت-س)26. هذا النموذج التجريبي مفيد للتحقيق المنظمين المفترضين اندمت واندمت-sp. وقد درسنا سابقا أدوار عدة ميرناس في اندمت بتعزيز أو إعاقة ميرنا أنشطة26،27. في الخلايا من مرض التصلب العصبي المتعدد-1، ميرنا أنشطة يمكن أن تكون قوة عن طريق التضمين ميرنا النوكليوتيد تقليد أو مثبطات ميرنا المستندة إلى LNA، وإجراء فحوصات المصب متعددة بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي التحليل الذي يمكن بسهولة (الشكل 3). استناداً إلى التحليل التكاملي الترنسكربيتوم، نحن سابقا ربطت active مؤثرا مير-31 لتنظيم اندمت في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا26. وأظهر تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي ذلك تثبيط مير-31 بنتائج المانع ميرنا LNA في توهين التعريفي علامات الوسيطة (الشكل 3A) والجينات اندمت-SP (الشكل 3)، في حين أنها لا تؤثر على تحريض التقليدية المستهدفة TGF-β الجينات مثل 1 فيبرونيكتين وأي-1 Smad7 (الشكل 3B) ودوونريجوليشن من علامات غشائي (الشكل 3D)26. Downregulate TGF-β ومير-31 Stk40، منظم سلبية لمسار NF-κB، الذي يعمل كمنظم محتملة من اندمت-sp. على الرغم من أن لا TGF-β بزيادة التعبير عن مير-31، TGF-β يستحث البديلة الاستبعاد بوليادينيليشن بوساطة من تسلسل poly(A) الداخلية في Stk40 3 ' UTR، وبالتالي تعزيز استهداف Stk40 مير النشطة التأسيسي-31 وأخيراً قمعها Stk4026. وباﻹضافة إلى ذلك، درسنا سابقا أدوار مير TGF-β-إيندوسيبلي-27 باء في اندمت27. تثبيط مير-27 قمعت upregulation علامات الوسيطة (الشكل 3A) بينما آثار على التقليدية TGF-β الهدف الجينات، الجينات اندمت-SP، وعلامات بطانية كانت هامشية (الأرقام 3، 3 ج، و 3D)27 .

Figure 1
الشكل 1 : تنصيب اندمت في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا قبل TGF-β- (أ) خلايا التنظيم أكتين في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 بعد 24 ساعة علاج TGF-β2 (1 نانوغرام/ملليلتر). مورفولوجيكال (ب) التغييرات في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 بعد 72 ساعة علاج TGF-β2 (1 نانوغرام/ملليلتر). إيمونوسيتوتشيميكال (ج) يحلل VE-كادهيرين و α-SMA في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا بعد 72 ساعة علاج TGF-β2 (1 نانوغرام/ملليلتر). (د، ه) تغييرات التعبير في α-SMA، يحدده تحليل RT-PCR الكمية القياسية (د) والغربية لطخة تحليل (E). جل الكولاجين (و) مقايسة الانكماش. يتم عرض نسبة المساحة السطحية بعد ثقافة ح 72 مع أو بدون علاج TGF-β2 (1 نانوغرام/ملليلتر) على السطح الأصلي. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر (ألف وجيم)، و (ب) 200 ميكرومتر. يتم تعديل الأرقام من ميهيرا et al. 20-أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : آثار عكسية TGF-β في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1- (أ) α-SMA التعبير مرناً ومورفولوجيا الخلايا (ب) بعد انسحاب TGF-β2 في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1. تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تحليل الحمض النووي الريبي seq في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1- بعد الأخذ بمثبطات ميرنا LNA والمعاملة مع TGF-β2 (ح 72)، تم تحليل الحمض النووي الريبي seq المؤداة26،27. NC: المراقبة السلبية. وتظهر التغييرات تعبير الجينات الممثل (A, علامات الوسيطة؛ بTGF-β التقليدية المستهدفة الجينات؛ ج، س اندمت الجينات؛ د، علامات بطانية). تم تطبيع فبكم (الأجزاء في كل كيلوبس محضر كل القراءات المعينة مليون) القيم مع القيم من نموذج التحكم (LNA-نورث كارولاينا دون علاج TGF-β2). أشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية.

نوع الخلية شرط الاستقراء علامة الوسيطة مرجع
الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيك) التعريفي بمتوسطة التمايز الوسيطة (TGF-β 5 نانوغرام/ملليلتر، PDGF-BB 25 نانوغرام/مليلتر)، 5 – 21 يوما. كرينينج et al.
الجلدية ميكروفاسكولار غشائي الخلايا البشرية (هكميك) التعريفي ب TGF-β2 (10 نانوغرام/مل)، دون FBS، 2 يوما. ميديشي et al.
خلايا بطانية التاجي البشري (هسيك) التعريفي ب TGF-β1 (10 نانوغرام/مل)، 6 أيام. تثبيط BMP-7. زيسبيرج et al.
ماوس الرئة خلايا بطانية (القانون النموذجي) التعريفي ب TGF-β1 (10 نانوغرام/مل)، تخفيض بنسبة 2% FBS، دون بطانية mitogen، 2 يوما. زيسبيرج وآخرون.
خلايا غشائي الدماغ الفئران (تيرو) التعريفي ب TGF-β1 (10 نانوغرام/مل)، 2 يوما. كريزباي et al.
خلايا بطانية الابهر البقري (حاملة) التعريفي ب TGF-β1 (1 نانوغرام/ملليلتر)، 5 أيام. ارسينيغاس et al.
مخلدة البقري الشبكية microvascular خلايا بطانية (إيبريك) التعريفي ب TGF-β2 (10 نانوغرام/مل)، 3 – 6 أيام. ديسلير et al.
خلايا بطانية الأغنام الصمام الابهري التعريفي TGF-β1 أو 3 (1 نانوغرام/ملليلتر)، 6 أيام. بارانيا et al.
خلايا بطانية microvascular البنكرياس الماوس MS-1 التعريفي ب TGF-β (10 نانوغرام/مل)، تنشيط رأس التعبير، يوم 1. هاشيموتو et al.
خلايا بطانية microvascular البنكرياس الماوس MS-1 التعريفي ب TGF-β2 (1 نانوغرام/ملليلتر)، 2 – 3 أيام. ميرا et al.

الجدول 1: تحريض اندمت TGF--بيتا في خلايا بطانية مختلف. يتم تلخيص ظروف الثقافة التعريفي اندمت طريق TGF-β. ولوحظت أيضا تغييرات في شروط الثقافة بما في ذلك تركيز المصل وإضافة أو إزالة عوامل النمو الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأفيد أن المنشط علاج TGF-β ورأس ح 24 الناجم عن اندمت في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1، في حين فشل TGF-β وحدها لحمل اندمت في هذه الفترة القصيرة21. دأبت، لاحظنا أن TGF-β إلى حد كبير التي يسببها اندمت بعد العلاج الطويل (ح 48 – 72) في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 خلايا20. اندمت لوحظ مرارا وتكرارا بعد العلاج المطول مع TGF-β (2 – 6 أيام) في خلايا بطانية مختلفة مثل السرة البشرية الوريد خلايا بطانية (هوفيك) الجلدي microvascular غشائي الخلايا البشرية (هكميك)، (البشرية خلايا بطانية الشريان التاجي هسيك)، الماوس الرئة خلايا بطانية (القانون النموذجي) والفئران الدماغ خلايا بطانية (تيرو) والخلايا البطانية الابهر البقري (حاملة)، مخلدة البقري الشبكية microvascular خلايا بطانية (إيبريك) والابهري الأغنام صمام خلايا بطانية8، 18،،من2930،31،32،،من3334. لخصنا في الجدول 1، شروط الاستقراء علامة الوسيطة التي TGF-β في مختلف خلايا بطانية8،،من1820،21،29، 30،،من3132،،من3334. مقارنة بين هذه التقارير تشير إلى أن كل خط الخلية غشائي عتبات مختلفة اندمت. قد تكمن وراء حساسية المتمايزة إلى TGF-β أو غيرها من الآليات المتنوعة الحالات المرضية المتصلة اندمت في أجهزة مختلفة. وينبغي اعتبار هذا جنبا إلى جنب مع نتائج الدراسات في فيفو .

تفاصيل في المختبر اندمت التعريفي البروتوكول بحاجة إلى تكييفها في خطوط الخلايا مختلفة: مثلاً.، تركيز TGF-β، تركيز المصل أو إضافة أو إزالة عوامل النمو، وفترة الثقافة الأخرى. على سبيل المثال، هوفيكس الاستجابة كثيرا ما يفتقرون إلى TGF-β وأن فعل اندمت بالاقتران مع عوامل أخرى مثل بدجف-BB والمحفزات التحريضية و/أو تعديل تركيز المصل ومكونات أخرى متوسطة في ثقافة أطول الإعداد29 , 35-وبالإضافة إلى ذلك، أوفيركونفلوينسي أن التخفيف من ردود على TGF-β.

اندمت عملية دينامية وعملية معاكس يسمى الانتقال الوسيطة غشائي (مندوة) قد تم الإبلاغ عنها مؤخرا36. بينما الاستقراء علامات الوسيطة التي TGF-β وحدها يتم عكسها في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 الخلايا (الشكل 2)، فقد أفيد أن downregulation علامات غشائي في خلايا مرض التصلب العصبي المتعدد-1 مع Ras المنشط واستمرت بعد انسحاب TGF-β21. اندمت لا رجعة فيه أبلغ أيضا في إيبريك والأغنام الصمام الابهري خلايا بطانية33،34. وبالإضافة إلى ذلك، أظهر تقرير سابق استمرار عملية اندمت بعد انسحاب TGF-β بسبب تنشيط مستمر لرأس-أنشئ ومثلايشن من المروج RASAL1 في خلايا بطانية التاجية البشرية37. وهكذا، المقارنة بين هذه النماذج قد تكون أيضا مفيدة فهم آليات تنظيمية غشائي خلية اللدونة.

استجابة خلايا بطانية لتحريض اندمت، على ما يبدو، غير متجانسة إلى حد كبير38. وأفادت زياو وآخرون أن الخاصة بورم خلايا بطانية من طراز الأورام الثديية تظهر أشكال متميزة من اندمت استجابة ل التحفيز TGF-β38. اندمت TGF-β-دافع أيضا عن طريق مسارات الإشارات الأخرى بما في ذلك صندوق الأجيال القادمة-2 و BMP-7، وايل-1β35،،من3738التضمين. كما وجدنا أن تنف-α يعزز اندمت TGF-β-المستحث والخلايا اندمت-SP في مرض التصلب العصبي المتعدد-126. وعلاوة على ذلك، فمن المعروف جيدا أن اندمت هو الناجمة عن مسارات الإشارات الأخرى بما في ذلك Wnt، والدرجة، ونقص1. وهكذا، قد يكون الجمع بين مع المحفزات الأخرى في مختلف خلايا بطانية هامة لفهم التباين في استجابة اندمت.

يمكن بسهولة تعديل البروتوكول اندمت المعروضة هنا التحقيق المنظمين اندمت. وفي الواقع، نحن تميزت مختلف المنظمين من اندمت في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 خلايا20،،من2627. جوانين النوكليوتيدات تبادل عامل Arhgef5 والنسخ ذات الصلة ميوكاردين-(مرتف-أ) هي الناجمة عن إشارات سمد، وكلاهما يسهم upregulation α-SMA في مرض التصلب العصبي المتعدد-1 خلايا20. وهكذا، مما يشير إلى TGF-β ينشط كلا إشارات رو ومرتف-أ لحمل اندمت. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أيضا أن ينظم إيجابيا مؤثرا نشط مير-31 ومير TGF-β-إيندوسيبلي-27 باء اندمت التعريفي26،27. في الخلايا من مرض التصلب العصبي المتعدد-1، مؤثرا نشط مير-31 ضروري أيضا اندمت TGF-β-فعل-س26. عموما، سيكون من المفيد لفهم بيولوجيا اندمت وتحديد الجينات المرتبطة اندمت التوقيعات، ووضع استراتيجيات لتعدل هذه العملية هذه في المختبر اندمت التعريفي الإجراءات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر بوروك زيا ومييازونو كوهية للاقتراحات في إعداد مخطوطة. H.I.S. ومحمد تدعمها "زمالة أبحاث مؤسسة النصب التذكاري أوهارا"، ويدعمه H.I.S. "أوسامو هايايشى التذكاري المنح الدراسية" "الدراسة في الخارج". وأيد هذا العمل بمنحه من مؤسسة العلوم وتاكيدا (أ. س.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42, (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77, (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80, (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12, (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35, (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13, (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125, (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129, (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131, (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498, (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225, (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6, (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67, (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18, (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151, (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43, (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88, (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149, (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9, (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109, (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21, (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161, (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248, (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29, (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437, (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10, (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103, (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18, (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159, (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218, (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514, (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105, (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75, (7), 1244-1254 (2015).
التحليل الجزيئي غشائي الوسيطة الانتقالية الناجمة عن تحويل الإشارات عامل النمو-β
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter