Summary
本文介绍了一种体外诱导内皮-间质转移 (EndMT) 的方法, 该协议对于研究 EndMT 中涉及的细胞信号通路是有用的。在该实验模型中, EndMT 是由 TGF β在 MS-1 内皮细胞中的治疗引起的。
Abstract
内皮细胞表型可塑性是心血管系统发展、心血管疾病以及与器官纤维化相关的各种条件的基础。在这些条件下, 分化的内皮细胞获得间充质样表型。这一过程称为内皮-间质转移 (EndMT), 其特点是下调的内皮标记, 上调的间充质标记, 和形态学的变化。EndMT 是由几种信号通路引起的, 包括转化生长因子 (TGF) β、Wnt 和凹槽, 并由类似于上皮-间质转移 (急诊) 的分子机制所调控, 对肠、组织纤维化和肿瘤转移。了解 EndMT 的机制对于发展针对 EndMT 的诊断和治疗方法非常重要。EndMT在体外的鲁棒诱导是一种常见的基因表达特征, 识别 druggable 分子机制和 EndMT 调节剂的筛查。在这里, 我们描述了一种诱导 EndMT 的体外方法。MS-1 小鼠胰腺微血管内皮细胞在长时间暴露于 TGF β后 EndMT, 显示上调的间充质标志物和形态学变化以及诱导多种炎症趋化因子和细胞因子。microRNA (miRNA) 调制的分析方法也包括在内。这些方法为调查 EndMT 的机制和 miRNAs 对 EndMT 的贡献提供了一个平台。
Introduction
内皮-间质转移 (EndMT) 是一种分化的内皮细胞经历多种分子变化的过程, 导致成纤维细胞样间质细胞1。EndMT 最初被描述作为内皮细胞变革在心脏的发展期间2,3。在早期心脏发育中, 心脏管由内心内膜和外心肌组成。这两层被一层细胞外基质所分离, 称为心脏果冻。胚胎心内膜细胞, 获得内皮细胞标志物, 转运到间充质细胞, 侵入底层的心脏果冻, 促进心脏垫的形成, 为房室瓣膜和隔膜提供基础和半月形阀门。此外, EndMT 已被认为是毛细血管和血管平滑肌细胞在其他胚胎血管系统的来源, 包括冠状动脉血管, 腹主动脉, 肺动脉4,5,6。此外, EndMT 与生理血管生成7有牵连。
积累的证据表明, EndMT 也参与多种心血管疾病和其他疾病1,8。EndMT 相关的条件包括血管钙化, 动脉粥样硬化, 肺动脉高压, 海绵状畸形, 器官纤维化, 静脉移植重塑, 移植肾功能障碍和癌症8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. 最近的一份报告指出, 几种分子 EndMT 标记物可以作为诊断和预测肾脏移植肾功能障碍的一种工具,17。EndMT 相关的细胞信号通路的调制已被证明可以改善多种疾病的条件, 包括心脏纤维化和静脉移植重塑的动物模型8,15。因此, 了解 EndMT 所依据的机制对于制定针对 EndMT 的诊断和治疗策略是很重要的。
EndMT 的特点是细胞连接的丧失, 迁徙潜能的增加, 内皮特异基因的下调, 如 VE 钙粘蛋白, 上调间充质基因, 包括α平滑肌肌动蛋白 (α SMA)。此外, EndMT 和上皮间质转移 (急诊室), 一个类似的过程, 将上皮细胞转化为间充质细胞, 与各种细胞外基质成分的改变产生相关, 这可能有助于发展组织纤维化8,19。
最近, EndMT 的几项体外研究已经阐明了 EndMT15、20的分子机制的细节。EndMT 是由各种信号通路, 包括转化生长因子 (TGF) β, Wnt, 和缺口1诱导。其中, TGF β在急救和 EndMT 诱导中起着举足轻重的作用。在 EndMT, 长期暴露于 TGF β的结果 EndMT 在各种内皮细胞, 而短期暴露似乎不足21。我们这里描述了一个简单的 EndMT 诱导协议, 其中英里斯文 1 (MS-1) 小鼠胰腺微血管内皮细胞在长时间接触 TGF β20后,体外EndMT。在该模型中, 可以进行多种下游分析, 以研究 EndMT 的标志性特征, 包括形态学变化、内皮标记下调、间充质标志物上调和炎症基因骨架重排, 胶原凝胶收缩。
MicroRNAs (miRNAs) 是 22 nt 小规 rna, 直接转录后水平压制各种 mRNA 目标22,23。通过种子序列介导的目标识别, miRNAs 抑制数以百计的靶基因, 调节细胞分化、增殖和运动等多种细胞功能。这也是对急诊医师和 EndMT 的监管, 并且有几个 miRNAs 被报告为急诊医师和 EndMT24,25的监管者。本文提出的 EndMT 模型可以很容易地结合 miRNA 调制程序来测试 miRNAs 在 EndMT 中的作用。本文综述了 TGF β诱导 EndMT 在 MS-1 细胞中的实验方法, 并对其他内皮细胞中 TGF β的 EndMT 诱导条件进行了比较。
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Protocol
1. EndMT 的诱导
- 在标准培养条件下保持 MS-1 细胞, 避免融合。在材料表中描述了 MS-1 细胞的来源。对于 MS-1 细胞, 使用最低的基本中α (内存α) 与10% 胎小牛血清 (FCS), 50 毫升/ml 青霉素, 50 微克/毫升链霉素。
- 用1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 在10厘米的盘子上洗 MS-1 细胞, 并在盘子中加入1.0 毫升的胰蛋白酶。孵育5分钟, 在37摄氏度。
- 使用9毫升培养基分离细胞。收集细胞悬浮在15毫升管。
- 在室温下离心 300–400 x g的细胞悬浮液5分钟。
- 小心取出上清液, 在预热培养基中悬浮细胞颗粒。
- 使用台盼蓝溶液和标准 hemocytometer 或自动单元计数器计数可行细胞。
- 板 MS-1 细胞到未涂布的标准培养板上, 每 cm2 0.5 x 103细胞, 用于长期培养。例如, 板 5.0 x 103细胞每井在6个井文化板材。使用相同的文化媒体, 包括同一浓度的 FCS。在 MS-1 细胞中, TGF β诱导 EndMT 在长期培养 (至少 48–72 h) 与使用 FCS。
- 刺激内皮细胞与 TGF-β2 (最终浓度为 1 ng/毫升) 后24小时。
- 在一个湿润的孵化器中培养细胞 (5% CO2, 37 °c)。在关注形态学变化时, 每天监视细胞。
- 在长期培养的 TGF 中, 用含有 TGF-β2的新鲜的预热培养基取代培养基, 并在48小时后进行治疗。
- 进行下游分析。典型地, 在24小时治疗后观察肌动蛋白重组, 并观察 TGF β48–72治疗后下调内皮标记物和上调间充质标志物。
2. 免疫细胞化学分析
- 在标准培养条件下保持 MS-1 细胞。
- 板 MS-1 细胞到4井细胞培养室幻灯片在 1.0 x 103细胞每井 (1.7 厘米2)。幻灯片预先涂上明胶。每井都使用0.5–1.0 培养基。
- 刺激内皮细胞与 TGF-β2 (最终浓度为 1 ng/毫升) 后24小时。当分析岩石在 EndMT 中的参与时, 添加一个岩石抑制剂 Y-27632 (10 微米) 1 小时之前, TGF β治疗。当评估 TGF β信号抑制的效果时, TGF β受体激酶抑制剂可以被使用。
- 在一个湿润的孵化器中培养细胞 (5% CO2, 37 °c)。肌动蛋白重组是观察 MS-1 细胞后24小时的治疗与 TGF β。其他变化在48–72治疗后变得明显。对于 72 h 培养, 用 TGF β治疗后用含有 TGF β的新鲜培养基取代培养基。
-
f-肌动蛋白染色
- 经过24小时的 TGF 治疗, 去除培养基, 固定细胞与4% 多聚甲醛 1x PBS 在室温下20分钟, 并冲洗细胞与 1x PBS。
- 在室温下孵育0.2% 海卫 X-100 5 分钟。
- 用 1x PBS 冲洗细胞三次。
- 罗丹明-四甲基罗丹明 B 异硫氰酸酯与鹅蕈稀释150倍, 室温下阻塞缓冲1小时。
- 用 1x PBS 冲洗细胞三次。
- 室温下用菁核酸结合染料将细胞核染色5分钟。
- 使用幻灯片安装介质冲洗幻灯片并在幻灯片上安装盖玻片面。
- 用共焦显微镜观察。使用 543 nm 激光和560–615纳米发射过滤器检测罗丹明的荧光。使用 633 nm 激光和发射过滤器长于 650 nm 的核染色。经 TGF β治疗后, 可观察到厚应力纤维的形成。
-
VE 钙粘蛋白与α SMA 染色
- 经过72小时的 TGF 治疗, 去除培养基, 固定细胞与冷50% 甲醇和50% 丙酮 (0.5–1.0 毫升每井) 为5分钟。
- 冲洗细胞三倍 1x PBS (0.5–1.0 毫升每井)。
- 根据制造商推荐的浓度, 在4摄氏度的黑暗中, 以主要抗体孵化, 在夜间阻塞缓冲区。使用 VE 钙黏蛋白单克隆抗体 (BV13, 1:100 稀释) 和 Cy3-conjugated α SMA 单克隆抗体 (1A4, 1:200 稀释)20。
- 用 1x PBS 冲洗细胞三次。
- 用绿色染料共轭二级抗体孵育细胞, 在1小时的室温下, 根据制造商推荐的浓度对 VE 粘附蛋白抗体进行阻塞缓冲。
- 用 1x PBS 冲洗细胞三次。
- 室温下用菁核酸结合染料将细胞核染色5分钟。
- 使用幻灯片安装介质冲洗幻灯片并在幻灯片上安装盖玻片面。
- 用共焦显微镜观察。使用 543 nm 激光和 560–615 nm 的发射过滤器检测α SMA (Cy3)。使用 488 nm 激光和505–550纳米的发射过滤器检测 VE 钙黏蛋白。通常情况下, TGF 治疗后, VE 钙黏蛋白信号的减少和α SMA 信号的增加将被观察到。
3. 三维胶原凝胶收缩试验
- 在胶原凝胶收缩试验前, 用/不 TGF β MS-1 细胞培养72小时。
- 在冰上准备 i 型胶原凝胶。混合冷胶原溶液, 10x 浓缩的记忆培养基, 胶原稀释缓冲液, 含 0.05 N 氢氧化钠, 2.2% NaHCO3, 200 毫米 HEPES pH 7.4 在 8:1: 1 比例。
- 混合200毫升控制或 TGF β处理内皮细胞悬浮 (1.0 x 106 cells/200 ul) 和 800 ul 的胶原凝胶溶液。对于 TGF β处理的样品, 添加 TGF-β2 (1 ng/毫升) 的细胞悬浮。
- 加入1.0 毫升的混合物, 每井12井培养板, 并允许固化在孵化器37°c 为30–60分钟。
- 糊化后, 覆盖1.0 毫升的记忆α含有 10% FCS, 50 U/毫升青霉素, 50 微克/毫升链霉素, 以漂浮凝胶。对于 TGF β处理的样品, 添加 TGF-β2 (1 ng/毫升) 的媒体。
注: 对于 TGF β治疗样品, 添加 TGF β的凝胶和培养基。 - 在37摄氏度的48小时内孵化漂浮凝胶。
- 使用扫描仪扫描印版底部的凝胶图像。或者, 用数码相机在凝胶上方的固定距离上记录凝胶的图像。
- 使用 ImageJ 对基于像素数的凝胶表面积进行量化。选择使用手绘选择或相关选择工具的凝胶, 或选择凝胶使用 "图像 |调整 |颜色阈值 "工具, 然后确定使用的凝胶面积" 分析 |度量 "命令。
4. 锁定核酸基 miRNA 抑制剂对 miRNA 活性的抑制作用
- 在标准培养条件下保持 MS-1 细胞。
- 染锁定核酸 (低噪声放大器) miRNA 抑制剂, 合成 miRNA 复式或 siRNAs (20 或 50 nM) 根据制造商的指示使用 lipofection 试剂。我们在以前的报告26、27中描述了低噪声 miRNA 抑制剂、合成 miRNA 复式和 siRNAs 的详细资料和来源。在 MS-1 细胞中, 标准的转染程序的基础上制造商的指导工作很好, 引入低噪声 miRNA 抑制剂, 合成 miRNA 复式或 siRNAs。
- 后 16–48 h, 刺激内皮细胞与 TGF-β2 (最终浓度 1 ng/毫升)。
- 进行各种下游分析, 包括 rna 的表达分析 (定量 rt-pcr 和 rna 序列分析), 免疫细胞化学分析, 和记者化验。我们在过去的报告20、26、27中描述了下游分析。
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Representative Results
TGF β是 EndMT 在各种内皮细胞中的有力诱导剂。在对 MS-1 细胞进行24小时的 TGF 治疗后, 对 F 肌动蛋白的染色显示重组肌动蛋白应激纤维 (图 1A)20。用岩石抑制剂 Y-27632 预处理抑制肌动蛋白重组20的诱导。MS-1 内皮细胞从经典的鹅卵石状形态学转变为 TGF β治疗时的间充质纺锤形形态 (图 1B)。TGF β细胞失去细胞接触。48–72 TGF 治疗后, 免疫细胞化学分析显示 VE 钙黏蛋白的表达减少, α SMA 的表达增加 (图 1C)。TGF β在 48–72 h 治疗后 MS-1 细胞的 mRNA 和蛋白质水平均显著地诱导α SMA 的表达 (图 1D和1E)。哺乳动物 TGF β包括 TGF-β1, 2 和3亚型。前一项研究使用小鼠培养的心内膜垫细胞外植体已经表明, TGF-β2, 但不是 TGF-β3是强制性的转变的心内膜垫单元28。另一方面, 我们以前比较了三种亚型对α sma 表达的影响, 并证实所有亚型在 MS-1 细胞中同样诱导α sma 表达20。胶原凝胶收缩试验显示, TGF β治疗后 MS-1 细胞胶原 i 型凝胶增强收缩 (图 1F)。这一结果表明, 获得间充质细胞的能力重塑细胞外基质。这些特征是 EndMT20的标志性特征。在我们以前的报告20, 治疗与岩石抑制剂 Y-27632 强烈抑制诱导的间质标记α SMA 和 SM22α没有伴随抑制诱导其他 TGF β靶基因, 如纤连蛋白1和 MMP-2。
EndMT 是一个高度动态的过程。在 MS-1 细胞中, TGF β对α-SMA 的表达和形态学的影响是可逆的;TGF 后, α SMA 的表达减少到基底水平 (图 2A), 细胞恢复一个鹅卵石样的形态学 (图 2B)。此外, EndMT 和急诊的诱导与多种趋化因子和细胞因子分泌能力的动态变化有关。CCL17、CX3CL1、CXCL16、IL-6 和 Angptl2 等多种炎症趋化因子和细胞因子由 TGF 细胞诱导, 我们先前指定 MS-1 相关分泌表型 (EndMT SP)26。该实验模型对 EndMT 和 EndMT 的假定调节器具有重要的参考价值。我们以前通过加强或抑制 miRNA 活动26,27, 研究了几个 miRNAs 在 EndMT 中的作用。在 MS-1 细胞中, miRNA 活动可以通过 miRNA 模仿寡核苷酸或低噪声的 miRNA 抑制剂进行鲁棒调制, 并且可以很容易地进行多种下游化验, 包括 RNA 序列分析 (图 3)。在综合转录分析的基础上, 我们以前将组成性活性 miR-31 与 MS-1 细胞的 EndMT 调节联系起来26。RNA 序列分析表明, 低噪声 miRNA 抑制剂对 miR-31 的抑制作用导致间质标记 (图 3A) 和 EndMT SP 基因 (图 3C) 的诱导衰减, 而不影响常规 TGF β靶的诱导。基因, 如纤连蛋白 1, PAI-1 和 Smad7 (图 3B) 和下调的内皮标记 (图 3D)26。TGF β和 miR-31 downregulate Stk40 是 NF nf-κb 通路的负调节器, 作为 EndMT SP 的潜在调节器。虽然 TGF β不增加 miR-31 的表达, TGF β在 Stk40 3 ' UTR 诱导选择性 polyadenylation 介导的内聚 (A) 序列排除, 从而提高 Stk40 的目标, 本构主动 miR-31, 最后抑制Stk4026。此外, 我们以前研究了 TGF β诱导 miR-27b 在 EndMT27中的作用。抑制 miR-27 抑制上调的间质标记 (图 3A), 而对常规的 TGF β靶基因, EndMT SP 基因和内皮标记的影响是边际 (图 3B, 3C, 3D)27.
图 1: TGF β诱导 MS-1 细胞中的 EndMT.(A) 肌动蛋白重组在 MS-1 细胞后24小时 TGF-β2治疗 (1 ng/毫升)。(B) TGF-β2治疗72小时后 MS-1 细胞形态学改变 (1)。(C) 72 小时 TGF-β2治疗后 MS-1 细胞中 VE 钙黏蛋白和α SMA 的免疫化学分析 (1)。(D、 E)用标准定量 rt-pcr 分析 (D) 和西方印迹分析 (E) 确定α SMA 的表达变化。(F) 胶原凝胶收缩试验。显示 72 h 培养后的表面积与/无 TGF-β2处理 (1 ng/毫升) 到原表面的比值。刻度条 = 20 微米 (A 和 C) 和200微米 (B)。数字是由 Mihira等人修改的。20. 误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: TGF β在 MS-1 细胞中的可逆作用.(A) α SMA mRNA 表达和 (B) TGF-β2在 MS-1 细胞中提取后的细胞形态学。刻度条 = 200 微米。误差线表示标准偏差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: MS-1 细胞中的 RNA 序列分析.在介绍低噪声 miRNA 抑制剂和 TGF-β2 (72 h) 治疗后, 进行了26、27的 RNA 序列分析。NC: 负控制。显示了代表性基因的表达变化 (A, 间充质标记;常规 TGF β靶基因;C、EndMT 基因;和D、内皮标记物)。FPKM (每百万映射读的 kilobase 的片段) 值被规范化以控制样品的价值 (无 TGF-β2处理的低噪声放大率 NC)。误差线表示标准偏差。
| 单元格类型 | 间充质标记诱导的条件 | 参考 |
| 人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) | 诱导的间质分化培养基 (TGF β 5 ng/毫升, 血小板生长因子 BB 25 ng/毫升), 5–21天。 | Krenning等。 |
| 人皮肤微血管内皮细胞 (HCMEC) | 诱导由 TGF-β2 (10 ng/毫升), 没有血清, 2 天。 | 美第奇等。 |
| 人冠状动脉内皮细胞 (HCEC) | 诱导由 TGF-β1 (10 ng/毫升), 6 天。BMP-7 的抑制。 | Zeisberg等。 |
| 小鼠肺内皮细胞 (《电子商务) | 诱导由 TGF-β1 (10 ng/毫升), 减少到2% 血清, 没有内皮细胞分裂, 2 天。 | Zeisberg 等。 |
| 大鼠脑血管内皮细胞 (BEC) | 诱导由 TGF-β1 (10 ng/毫升), 2 天。 | Krizbai等。 |
| 牛主动脉内皮细胞 (BAEC) | 诱导由 TGF-β1 (1 ng/毫升), 5 天。 | Arciniegas等。 |
| 永生化牛视网膜微血管内皮细胞 (iBREC) | 诱导由 TGF-β2 (10 ng/毫升), 3–6天。 | Deissler等。 |
| 绵羊主动脉瓣内皮细胞 | 诱导由 TGF-β1或 3 (1 ng/毫升), 6 天。 | Paranya等。 |
| MS-1 小鼠胰腺微血管内皮细胞 | 诱导由 TGF β (10 ng/毫升), 活化 Ras 表达, 1 天。 | 桥本等。 |
| MS-1 小鼠胰腺微血管内皮细胞 | 诱导由 TGF-β2 (1 ng/毫升), 2–3天。 | Mihira等。 |
表 1: TGFβ在各种内皮细胞中诱导 EndMT。综述了 TGF β EndMT 诱导培养条件。此外, 还指出了包括血清浓度和其他生长因子的添加或去除在内的培养条件的变化。
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Discussion
据报道, 活化 Ras 和 TGF β治疗24小时诱导 EndMT 在 MS-1 细胞, 而 TGF β单独未能诱导 EndMT 在这短短的时间21。我们一贯地观察到, TGF β在 MS-1 细胞中的长时间治疗 (48–72 h) 后, 极大地诱发了 EndMT20。EndMT 在 TGF β (2–6天) 在各种内皮细胞如人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)、人皮肤微血管内皮细胞 (HCMEC)、人冠状动脉内皮细胞等的长期治疗后反复观察 (HCEC), 小鼠肺内皮细胞 (《电子商务), 大鼠脑内皮细胞 (BEC), 牛主动脉内皮细胞 (BAEC), 永生化牛视网膜微血管内皮细胞 (iBREC), 绵羊主动脉瓣内皮细胞8, 18,29,30,31,32,33,34。在表 1中, 我们总结了 TGF β在不同内皮细胞8、18、20、21、29中诱导间充质标记的条件, 30,31,32,33,34。这些报告的比较表明, 每个内皮细胞线有不同的阈值 EndMT。对 TGF β或其他机制的差异敏感性可能是不同器官 EndMT 相关病理条件的基础。这应该与体内研究的结果一并考虑。
体外EndMT 诱导协议的细节需要在不同的细胞系中进行定制: g、TGF 的浓度、血清的浓度、其他生长因子的添加或去除以及培养周期。例如, 血管内皮细胞经常对 TGF β和 EndMT 的反应不良, 将与其他因素相结合, 如血小板生长因子-BB 和炎症刺激和/或调制的血清浓度和其他培养基成分在更长的文化设置29,35. 此外, overconfluency 将减轻对 TGF 的反应。
EndMT 是一个动态过程, 一个相反的过程称为间充质-内皮转移 (MEndoT) 最近报告了36。在 MS-1 细胞 (图 2) 中, 虽然单独通过 TGF β诱导间充质标记是可逆的, 但据报道, 在 TGF β21退出后, 活化 Ras MS-1 细胞中的内皮标记下调持续存在。iBREC 和绵羊主动脉瓣内皮细胞33,34也报告了不可逆转的 EndMT。此外, 前一份报告显示, EndMT 过程在 TGF β退出后持续存在, 因为 GTP 和甲基化的 RASAL1 启动子在人冠状动脉内皮细胞中持续活化37。因此, 比较这些模型可能也有助于了解内皮细胞可塑性的调控机制。
内皮细胞对 EndMT 诱导的反应性似乎实质上是异构的38。小et 等人报告说, 乳腺肿瘤模型中肿瘤特异的内皮细胞表现出不同形式的 EndMT 反应 TGF β刺激38。TGF-β驱动 EndMT 也被其他信号通路, 包括 FGF-2, BMP-7, IL-1β35,37,38调制。我们还发现, TNF α增强 TGF β诱导的 EndMT 和 EndMT SP 在 MS-1 细胞26。此外, 众所周知, EndMT 是由其他信号通路, 包括 Wnt, 凹槽和缺氧1诱导。因此, 在不同的内皮细胞中结合其他刺激可能对了解 EndMT 反应的异质性很重要。
这里提出的 EndMT 协议可以很容易地修改, 以调查 EndMT 的监管者。事实上, 我们在 MS-1 细胞20,26,27的 EndMT 的各种调节器的特点。Smad 信号诱导了鸟嘌呤核苷酸交换因子 Arhgef5 和 myocardin 相关转录因子 a (MRTF), 并对上调细胞20的α SMA MS-1 有贡献。因此, TGF-β信号激活两个 MRTF 的信号和诱导 EndMT。此外, 我们还发现, 组成性活性 miR-31 和 TGF β诱导 miR-27b 积极调节 EndMT 诱导26,27。在 MS-1 细胞中, TGF β诱导的 EndMT SP26也需要组成性活性 miR-31。总的来说, 这些体外EndMT 诱导程序将有助于了解 EndMT 生物学, 确定 EndMT 相关基因签名, 并制定策略, 以调节这个过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢玉米 Borok 和晃平 Miyazono 为编写手稿提出建议。H.I.S. 和 M.H. 得到了上原纪念基金会研究金的支持, H.I.S. 得到了留学 Hayaishi 纪念奖学金的支持。这项工作得到了武田科学基金会 (犍为县) 的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
| MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
| TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
| 4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
| Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
| phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
| VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
| alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
| Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
| LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
| synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
References
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