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Biology

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β によって誘導されます。

Abstract

内皮細胞の表現型可塑性は、心血管系システム開発、心血管疾患や臓器線維症に関連付けられている様々 な条件に基づいています。これらの条件では、差別化された血管内皮細胞は、間葉系のような表現型を取得します。この内皮間葉転換 (EndMT) と呼ばれており血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、および形態学的変化のアップレギュレーションが特徴です。形質転換成長因子 (TGF) を含むいくつかのシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、およびノッチ、原腸陥入、組織の線維化の分子メカニズム上皮間葉転換 (EMT) 重要のそれらに類似による規制とがんの転移。EndMT のメカニズムの理解は、ターゲット EndMT 診断および治療上のアプローチを開発することが重要です。EndMTの in vitroの堅牢な誘導は、一般的な遺伝子発現シグネチャを特徴付ける、druggable の分子メカニズムを特定する、EndMT の画面に便利です。ここでは、EndMT の誘導のための in vitro法について述べる。MS 1 マウス膵微小血管内皮細胞 TGF-β への長期暴露の後 EndMT を受けるし、複数の炎症性ケモカイン、サイトカインの誘導だけでなく、間葉系のマーカーと形態変化のアップレギュレーションを表示します。マイクロ Rna (miRNA) 変調の解析のためのメソッドが含まれています。これらのメソッドは、EndMT と EndMT する Mirna の貢献を根底にあるメカニズムを調査するためのプラットフォームを提供します。

Introduction

内皮間葉転換 (EndMT) は、差別化された血管内皮細胞は様々 な線維芽細胞のような間葉系細胞1分子変化を受けるプロセスです。EndMT は、当初ハート2,3の開発中に内皮細胞変換として記述されていた。心開発の初期段階、心臓の管は内部の心内膜と外側の心筋で構成されます。これらの 2 つの層は、心臓のゼリーと呼ばれる細胞外のマトリックスの層で区切られます。血管内皮細胞のマーカーを取得するには、胚の心内膜細胞間葉系細胞にトランジット、基になる心臓ゼリーに侵入して房室弁の中隔の基盤を提供する心臓のクッションの形成を促進半月弁。さらに、EndMT は、冠血管、腹部大動脈および肺動脈4,5,6を含む他の胚の血管システムのペリサイトおよび血管平滑筋細胞の源に示唆されています。さらに、EndMT、発芽7生理的血管新生に関与しています。

証拠の蓄積は、EndMT が複数の心血管疾患と他の疾患1,8にも関与していることを示唆しています。EndMT 関連付けられている条件は、血管石灰化、動脈硬化症、肺動脈高血圧症、海綿静脈奇形、臓器線維症、静脈グラフトを改造、同種移植片機能不全腎移植、癌8、します。 9,1011,12,13,14,15,16,17, 18. 最近の報告書は、いくつかの分子 EndMT マーカーが腎臓移植17で移植腎機能障害の診断と予後予測のためのツールをすることができます説明します。EndMT 関連細胞シグナル伝達経路の変調は心筋線維化を含むいくつかの病気の条件を改善するために示されているし、8,15をモデル動物に静脈グラフトの改造します。したがって、メカニズムを理解すること基になる EndMT は、EndMT をターゲット診断と治療戦略を開発することが重要です。

EndMT は、細胞間の接合、渡り鳥の可能性の増加、VE カドヘリンなど血管内皮特異遺伝子のダウンレギュレーションと α-平滑筋アクチン (α SMA) を含む間葉系遺伝子の発現の損失によって特徴付けられます。さらに、EndMT と上皮間葉移行 (EMT)、間葉系細胞、上皮細胞に変換する同様のプロセス開発に貢献するかもしれない様々 なの細胞外マトリックス成分の変更された生産に関連付けられています。組織の線維化の8,19

最近では、EndMT のいくつかの生体外の研究は、EndMT15,20の分子機構の詳細を解明しました。形質転換成長因子 (TGF) を含む様々 なシグナル伝達経路による EndMT-β、wnt シグナル、ワンランク上の1と。中でも、TGF-β は EMT と EndMT の両方の誘導に重要な役割を果たしています。EndMT、短い露光では、不十分な21と思われる中様々 な血管内皮細胞の EndMT で TGF β の結果への露出を延長しました。ここで EndMT の誘導、どのマイル スヴェン 1 (MS-1) マウス膵微小血管内皮細胞を体外でEndMT TGF-β20への長期暴露の後受ける簡単なプロトコルについて述べる。EndMT、形態学的変化、血管内皮マーカーのダウンレギュレーション、間葉系のマーカー、炎症性遺伝子、細胞骨格のアップレギュレーションの認刻極印の特徴を検討するこのモデルでは、複数のダウン ストリーム解析を実行できます。再編成とコラーゲンゲル収縮。

マイクロ Rna (Mirna) は ~ 22 nt 様々 な mRNA ターゲット22,23の転写後遺伝子抑制の直接規制 Rna。シード シーケンスを介したターゲット認識による Mirna は標的遺伝子の数百人を抑制し、細胞の分化・増殖・運動など多様な細胞機能を調節します。これはまた、EMT と EndMT の規制の場合といくつかの miRNAs は EMT と EndMT24,25の調節因子として報告されています。このレビューで提示した EndMT モデルは、簡単に EndMT の Mirna の役割をテストする miRNA 調節プロシージャと組み合わせることができます。現在レビューは MS 1 細胞における TGF β 誘導 EndMT を調査するための実験プロシージャを要約しも他の血管内皮細胞における TGF-β の EndMT 誘導条件の比較が含まれています。

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Protocol

1. EndMT の誘導

  1. MS 1 細胞標準培養条件を維持し、密度を避けます。MS 1 セルのソースは、材料表の説明です。MS 1 細胞 10% 牛胎児血清 (FCS)、50 U/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシンと最小必須培地-α (MEM-α) を使用します。
  2. 10 cm 上を洗う MS 1 セル リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 皿し、プレートに 1.0 mL のトリプシンを追加します。37 ° C で 5 分間インキュベートします。
  3. 9 mL の培地を使用してセルをデタッチします。15 mL チューブに細胞懸濁液を収集します。
  4. 室温で 5 分間 300-400 x gで細胞懸濁液を遠心します。
  5. 慎重に上澄みを除去し、予め温めておいた培地で細胞ペレットを中断します。
  6. トリパン ブルー溶液と標準検定またはセルの自動カウンターを使用して実行可能なセルを数える。
  7. 長い言葉の文化の cm2あたり 10 の3セル × 0.5 でコーティングされていない標準培養皿上にプレート MS 1 セルです。たとえば、プレート 5.0 x 103セル/6 ウェルのプレートも文化.FCS の同じ濃度を含む同じ培地を使用します。MS 1 セル、TGF-β は FCS の使用と長期的文化 (少なくとも 48-72 時間) で EndMT を誘発します。
  8. 24 h 後 TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。
  9. (5% CO2、37 ° C) の加湿インキュベーターで培養細胞。形態学的変化に着目したときセルを毎日監視します。
  10. 長期的文化の TGF-β 治療の 48 時間後 TGF β 2 を含む新鮮な予め温めておいた文化メディアとメディアを交換してください。
  11. 下流の分析に進みます。通常、アクチン再編成を観察、治療の 24 時間後、TGF-β による治療の 48-72 時間後血管内皮マーカーのダウンレギュレーションと間葉系のマーカーの発現が観察されます。

2. 免疫細胞化学的解析

  1. MS 1 細胞標準培養条件を維持します。
  2. プレート MS 1 セル 4 にもよく (1.7 cm2) ごとの 10 の3セル × 1.0 で文化室スライドをセルします。スライドは、ゼラチンで塗装。ウェルあたり文化メディアの使用 0.5-1.0 mL。
  3. 24 h 後 TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。EndMT の岩の関与を解析するときは、TGF-β 治療に岩阻害剤の Y-27632 (10 μ M) 1 h 前を追加します。TGF-β シグナル伝達阻害の効果を評価する際は、TGF-β 受容体キナーゼ阻害剤が使用できます。
  4. (5% CO2、37 ° C) の加湿インキュベーターで培養細胞。アクチン再編成は、TGF-β 治療の 24 時間後 MS 1 細胞で観察されます。その他の変更は、治療の 48-72 時間後に明らかになります。72 h 文化、TGF-β 投与の 48 時間後 TGF-β を含む新鮮なメディアでメディアを交換してください。
  5. F-アクチン染色
    1. TGF-β 治療の 24 時間後に、メディアを取り出し、1 × PBS、室温で 20 分間で 4% パラホルムアルデヒドとセルを修正 1 × PBS のセルをすすいでください。
    2. 0.2% トリトン X-100 室温で 5 分間、インキュベートします。
    3. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
    4. タマゴテングタケ有機希釈からファロイジン tetramethylrhodamine B イソチオ シアン酸と孵化に室温で 1 時間ブロッキング バッファー。
    5. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
    6. 室温で 5 分間シアニン核酸結合色素を持つ核を染色します。
    7. リンス スライドやマウント coverslips スライド メディアのマウントを使用してスライドの下向き。
    8. 共焦点顕微鏡で観察します。ファロイジンの蛍光性の検出の 543 nm レーザーと 560-615 nm の発光フィルターを使用します。633 nm レーザーと 650 を超える排出フィルターを使用して、染色性が核の nm。TGF-β による治療、時に厚いストレスファイバー形成過程を観察するでしょう。
  6. VE カドヘリンと α SMA 染色
    1. TGF-β 治療の 72 時間後メディアを削除、50% メタノールとアセトン 50% セルを修正 (0.5-1.0 mL/ウェル) 5 分。
    2. すすぎ 3 回 1 × PBS のセル (0.5-1.0 mL の井戸あたり)。
    3. 製造元の推奨濃度によると暗闇の中で 4 ° C で一晩ブロック バッファーで一次抗体とインキュベートします。VE カドヘリン モノクローナル抗体 (BV13、1: 100 希釈)、Cy3 共役 α SMA モノクローナル抗体 (1A4、希釈 1: 200)20を使用します。
    4. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
    5. 製造元の推奨濃度によると暗闇の中で室温で 1 時間ブロッキング バッファーで VE カドヘリン抗体緑色素結合の二次抗体と細胞を孵化させなさい。
    6. 3 回 1 × PBS のセルをすすいでください。
    7. 室温で 5 分間シアニン核酸結合色素を持つ核を染色します。
    8. リンス スライドやマウント coverslips スライド メディアのマウントを使用してスライドの下向き。
    9. 共焦点顕微鏡で観察します。543 nm レーザーと 560-615 nm の発光フィルターを α SMA (Cy3) の検出のために使用します。488 nm レーザーと 505-550 nm の発光フィルターを使用して、VE カドヘリンの発見のため。通常は、TGF-β 治療による治療、時に VE カドヘリン信号が小さくなり、α SMA 信号の増加が観察されます。

3. 三次元コラーゲン ゲル収縮アッセイ

  1. コラーゲン ゲル収縮アッセイ前 72 h の TGF-β なしで MS 1 細胞の培養を実行します。
  2. 型を準備私コラーゲンゲル氷の上。ミックス冷たいコラーゲン溶液、濃縮 10 倍 MEM 媒体、0.05 N 水酸化ナトリウム、2.2% NaHCO3、および 200 mM HEPES pH 7.4 8:1 を含むコラーゲン希釈バッファー: 1 比。
  3. ミックスのコントロールや TGF β 治療の血管内皮細胞懸濁液 (1.0 x 106セル/200 μ L) の 200 mL とコラーゲン ゲル溶液の 800 μ l。TGF-β の扱われたサンプルは TGF-β 2 を追加 (1 ng/mL) 細胞懸濁液を。
  4. 12 も培養プレートの各ウェルに 1.0 mL の混合物を追加し、37 ° C で 30-60 分のためのインキュベーターで固化することができます。
  5. 糊では、MEM α 10 %fcs、50 U/mL ペニシリン、50 μ g/mL ストレプトマイシンを含むゲルをフロートに 1.0 mL をオーバーレイします。TGF-β の扱われたサンプルは TGF-β 2 を追加 (1 ng/mL) メディアに。
    注: TGF-β の扱われたサンプル追加 TGF-β ゲルと培地の両方に。
  6. 48 h の 37 ° C でフローティングのゲルを孵化させなさい。
  7. スキャナーを使用してプレートの底からゲルの画像をスキャンします。また、ゲル、ゲル上の固定距離でデジタル カメラを使用しての画像を記録します。
  8. ImageJ を用いた画素数に基づくゲル表面領域を定量化します。フリーハンド選択範囲または選択ツールを使用してゲルを選択またはゲルを使用して選択"画像 |調整 |色のしきい値」ツールをクリックし、ゲルを使用して領域を決定する"分析 |メジャー"コマンドです。

4. miRNA 活動によってロックされた核酸を用いた miRNA 阻害剤の阻害

  1. MS 1 細胞標準培養条件を維持します。
  2. ロックされた核酸 (LNA) miRNA 阻害剤、合成マイクロ Rna 二重鎖または製造元の指示に従ってリポフェクション試薬を用いる Sirna (20 または 50 nM) を transfect します。詳細および LNA miRNA 阻害剤、合成 miRNA デュープレックスと Sirna のソースは、以前レポート26,27に記載されました。MS 1 セルの製造元の指示に基づく標準的な導入手順は LNA miRNA 阻害剤、合成マイクロ Rna 二重鎖や Sirna の導入のために働きます。
  3. 16-48 時間後に、TGF-β 2 (最終濃度 1 ng/mL) と内皮細胞を刺激します。
  4. RNA 発現解析 (定量的 RT-PCR と RNA シーケンス (seq RNA) 解析)、免疫組織化学的解析、レポーターアッセイなど各種の下流の分析に進みます。下流の分析は、以前レポート20,26,27に記載されています。

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Representative Results

TGF β は様々 な血管内皮細胞の EndMT の強力な誘導です。MS 1 細胞における TGF-β の 24 時間投与、F-アクチン染色アクチン ストレス線維 (図 1 a)20の再編成を示しています。ROCK 阻害剤の Y-27632 の前処理は、アクチン再編成20の誘導を阻害します。MS 1 血管内皮細胞は、古典的な石畳のような形態から TGF-β 治療 (図 1 b) に間葉系紡錘状の形態に変更します。TGF β 処理細胞は、細胞間の接触を失います。48-72 時間 TGF-β の投与、免疫細胞化学的解析は VE カドヘリンの発現の低下と α SMA (図 1) の発現の増加を示しています。TGF-β は、大幅に治療 (数字 11E) の 48-72 時間後 MS 1 細胞の mRNA および蛋白質レベルで α SMA の発現を誘導します。哺乳類の TGF-β は、TGF-β 1、2 と 3。培養マウス心内植を使用して以前の研究は、TGF-β 2 がない TGF β3 は心内膜クッション細胞28の変換のための義務を示しています。その一方で、以前 α SMA 表現に及ぼす 3 つのアイソ フォームを比較し、すべてアイソ フォーム同様に MS 1 セル20α SMA の表現を誘発したことを確認しました。コラーゲン ゲル収縮アッセイは、MS 1 細胞 TGF-β 治療 (図 1 階)、次ゲル私コラーゲン タイプの拡張収縮を示しています。この効果は、細胞外マトリックスを改造する間葉系細胞の能力の獲得を示唆しています。これらの機能は、EndMT20の特徴の特徴です。私たち以前レポート20、ROCK 阻害剤の Y-27632 の治療は強くフィブロネクチン 1 や MMP 2 など他の TGF-β 標的遺伝子の誘導の併用抑制せず間葉系マーカー α SMA と SM22α の誘導を抑制しました。

EndMT は、非常にダイナミックなプロセスです。MS 1 細胞における α SMA 表現と形態に及ぼす TGF-β が可逆的;TGF-β 剥奪後基底レベル (図 2 a) と細胞に α SMA 式減少は石畳のような形状 (図 2 b) を回復します。さらに、EndMT と EMT の誘導は複数のケモカイン、サイトカインの分泌能のダイナミックな変化に関連付けられます。複数の炎症性ケモカイン、CCL17、CX3CL1、CXCL16、サイトカイン IL-6、および Angptl2 我々 に以前指定 EndMT 関連付けられている分泌型表現型 (EndMT SP)26MS 1 細胞における TGF-β によって引き起こされます。この実験モデルは EndMT と EndMT SP の推定のレギュレータを調査する役に立つ強化や miRNA 活動26,27を阻害することによって、EndMT でいくつかの Mirna の役割を学んだこともあります。MS 1 細胞における miRNA 活動は確実 miRNA 模倣オリゴヌクレオチドまたは LNA ベース miRNA 阻害剤によって変調されることができます、含む RNA シーケンス解析を簡単にすることができます複数のダウン ストリーム試金実行 (図 3)。統合的なトランスクリプトーム解析に基づいて、以前にリンクされて恒常活性ミール 31 MS 1 細胞26EndMT 規制。従来の TGF-β のターゲットの誘導は影響しませんの間葉系マーカー (図 3 a) と EndMT SP 遺伝子 (図 3)、高周波の減衰に LNA miRNA 阻害剤結果によってミール 31 の抑制することを示した RNA シーケンス解析フィブロネクチン 1、PAI-1 Smad7 など遺伝子 (図 3 b) と内皮マーカー (図 3 D)26の。TGF-β とミール 31 レセプター Stk40、EndMT SP. の潜在的な調節因子として機能する NF κ B 経路の負の調節因子TGF-β ミール 31 の発現が増加しないが TGF-β 誘導 Stk40 で内部ポリ a シーケンス 3' UTR、構成アクティブ ミール-31 と最終的に抑制によって Stk40 のターゲットを強化することの代替起こるを介した除外Stk4026。さらに、以前では、TGF-β-誘導ミール-27b EndMT27の役割を調べた。ミール 27 の阻害は従来 TGF-β 標的遺伝子、EndMT SP 遺伝子に及ぼす影響中 (図 3 a) 間葉系のマーカーの発現を抑制し、血管内皮マーカーが限界 (図 3 b、3 C3 D)27.

Figure 1
図 1: TGF-β の細胞 MS 1 で EndMT の誘導します。(A) MS 1 アクチン再構成細胞 TGF β 2 治療 (1 ng/mL) の 24 時間後。(B) 形態は、TGF-β 2 治療 (1 ng/mL) の 72 時間後 MS 1 セルに変更します。(C) 免疫は TGF-β 2 治療 (1 ng/mL) の 72 時間後 VE カドヘリンおよび MS 1 細胞における α SMA の分析します。(D, E)Α SMA を標準的な定量的 RT-PCR 解析 (D) と西部によって決定の表現変更ブロット分析 (E) です。(F) コラーゲンのゲル収縮アッセイ。あり/なしの元のサーフェスに TGF β 2 治療 (1 ng/mL) 72 時間培養後の表面積の比率が表示されます。スケール バー = (A、C) 20 μ m、200 μ m (B)。みひらさんぺいからの数字が変更されます。20です。 誤差範囲は、標準偏差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: MS 1 細胞における TGF-β の可逆的効果。(A) α SMA mRNA の発現および MS 1 細胞における TGF β 2 の撤退後 (B) 細胞の形態。スケール バー 200 μ m を =。エラーバーは標準偏差を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: MS 1 細胞における RNA シーケンス解析します。LNA miRNA 阻害剤と TGF-β 2 (72 h) による治療の導入後 RNA シーケンス解析は実行26,27だったNC: 否定的な制御。代表的な遺伝子の表現の変更 (A、間葉系のマーカー表示します。B、従来 TGF-β 遺伝子;C、EndMT SP 遺伝子;D、内皮マーカー)。FPKM (マップされたリードの百万のコピーのプラスミドあたりの断片) の値は、コントロールのサンプル (TGF β 2 治療せずノースカロライナ州の LNA) の値で正規化されました。エラーバーは標準偏差を表しています。

セルの種類 間葉系マーカー誘導の条件 参照
ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (新生活) 間葉系分化培地 (TGF β 5 ng/mL、PDGF BB 25 ng/mL) による誘導 5-21 日。 Krenning
ひと皮膚微小血管内皮細胞 (HCMEC) TGF β 2 による誘導 (10 ng/mL)、政府短期証券、2 日なし。 メディチ家
ひと冠動脈内皮細胞 (HCEC) TGF-β 1 による誘導 (10 ng/mL) 6 日間。7 BMP による抑制。 Zeisberg
マウス肺血管内皮細胞 (MLEC) TGF-β 1 による誘導 (10 ng/mL)、2 %fbs、内皮細胞マイトーゲンで 2 日間なし。 Zeisberg ら。
ラット脳血管内皮細胞 (BEC) TGF-β 1 による誘導 (10 ng/mL)、2 日間。 Krizbai
ウシ大動脈血管内皮細胞 (BAEC) TGF-β 1 による誘導 (1 ng/mL) の 5 日間。 Arciniegas
不死化ウシ網膜微小血管内皮細胞 (iBREC) TGF β 2 による誘導 (10 ng/mL)、3-6 日間。 Deissler
羊大動脈内皮細胞 TGF-β 1 または 3 (1 ng/mL) の 6 日間で誘導。 Paranya
MS 1 マウス膵微小血管内皮細胞 TGF-β の誘導 (10 ng/mL)、Ras 式、1 日をアクティブ化します。 橋本
MS 1 マウス膵微小血管内皮細胞 TGF β 2 による誘導 (1 ng/mL)、2-3 日。 みひらさんぺい

表 1: TGF による EndMT の誘導β様々 な血管内皮細胞で。TGF-β による EndMT の誘導の培養条件をまとめます。血清中濃度および追加または他の成長因子の除去を含む培養条件の変化はまた指摘しました。

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Discussion

それは 24 時間活性化 Ras および TGF-β 治療による MS 1 セルで EndMT である TGF-β 単独でこの短い期間21EndMT を誘導するために失敗したことが報告されています。一貫して、TGF-β 大幅に誘導 EndMT 長い治療 (48-72 h) 後 MS 1 セル20を見ました。ひと臍帯など様々 な血管内皮細胞における TGF-β (2-6 日) との長期治療静脈内皮細胞 (株) ひと皮膚微小血管内皮細胞 (HCMEC)、冠動脈内皮細胞 (後、EndMT は、何度も観察されています。HCEC)、マウス肺血管内皮細胞 (MLEC)、ラット脳血管内皮細胞 (BEC)、ウシ大動脈血管内皮細胞 (BAEC)、不死化ウシ網膜微小血管内皮細胞 (iBREC)、およびヒツジ大動脈弁血管内皮細胞8, 18,29,30,31,32,33,34テーブル 1、我々 は様々 な血管内皮細胞8,18,20,21,29、における TGF-β の間葉系マーカー誘導条件を要約 30,31,32,33,34。これらのレポートの比較では、内皮細胞の各行では、EndMT の異なるしきい値を示唆しています。TGF-β や他のメカニズムに対する感受性の差が異なる臓器の多様な EndMT 関連病態の根底にあります。これは、生体内での研究の結果と共に考慮されなければなりません。

体外EndMT 誘導プロトコルの詳細が別の細胞で調整しなければならない:例えば。、TGF-β、血清、追加または削除、他の成長要因、および培養期間の濃度の濃度。たとえば、比較は頻繁に不完全 TGF-β に対応、EndMT は PDGF BB や炎症性刺激などその他の要因との組み合わせや血清濃度と29の設定より長い文化の他の中のコンポーネントの変調によって引き起こされるだろう,35です。 また、overconfluency TGF β への応答を軽減。

EndMT 動的プロセスと内皮間葉系移行 (MEndoT) と呼ばれる反対プロセスは、最近報告された36をされています。TGF-β 単独での間葉系マーカーの誘導は MS 1 細胞 (図 2) でリバーシブル、それが報告されている活性化 Ras と MS 1 細胞における内皮マーカー、ダウンレギュレーションが TGF-β21の撤退後永続化します。不可逆的な EndMT は、iBREC と羊大動脈内皮細胞33,34も報告されています。さらに、以前レポートは、Ras GTP の持続的な活性化と冠動脈内皮細胞37RASAL1 プロモーターのメチル化による TGF-β の脱退後、EndMT プロセスが保持されていることを示した。したがって、これらのモデルの比較は内皮細胞の可塑性制御機構を理解する役に立つまたかもしれません。

EndMT 誘導する血管内皮細胞の応答性は、大幅に異種38のように見えます。暁は、乳腺腫瘍モデルから特定の腫瘍血管内皮細胞が TGF-β 刺激38に応えて EndMT の明瞭な形態を示すことを報告しました。TGF β 駆動 EndMT FGF 2、BMP-7、および il-1 の35,37,38を含む他のシグナル伝達経路によっても調整します。また、TNF α を高める TGF β 誘導 EndMT、MS - 1 EndMT SP 細胞26発見します。さらに、EndMT は Wnt, 切欠き、および低酸素症の1を含む他のシグナル伝達経路によることが知られています。したがって、さまざまな血管内皮細胞におけるその他の刺激との組み合わせは、EndMT 応答性の不均一性を理解することが重要かもしれません。

ここで紹介する EndMT プロトコルは、EndMT のレギュレータを調査する簡単に変更できます。実際には、MS-1 細胞20,26,27EndMT の豊富なレギュレータ群を特徴付けた。グアニンヌクレオチド交換因子 Arhgef5 と myocardin 関連転写因子-Smad 信号によって (MRTF A) を誘発し、両方は MS 1 セル20α SMA アップレギュレーションに貢献。したがって、ロー信号の両方をアクティブに TGF-β シグナルと MRTF - EndMT を誘導します。さらに、また恒常活性ミール-31 と TGF-β-誘導ミール-27b 積極的に規制 EndMT 誘導26,27分かった。MS 1 細胞の恒常活性ミール 31 も TGF β 誘導 EndMT SP26のため必要です。全体的にみて、これらの in vitro EndMT 誘導の手順は EndMT の生物学を理解、EndMT 関連遺伝子の署名を識別する、このプロセスを調整するための戦略の開発に有用であります。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

原稿の準備の提案、Zea ボロックと宮園浩平に感謝します。上原記念財団研究員で立替払やかサポートされてし、留学の立替払修早石記念奨学金としています。この作品は武田科学財団 (社) からの助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

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References

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成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析
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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

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