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Biology

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

Abstract

내 피 세포의 phenotypic가 소성 기초 심장 혈관 시스템 개발, 심장 혈관 질병, 및 기관 섬유 증과 관련 된 다양 한 조건. 이러한 조건에서 차별화 된 내 피 세포는 엽 같은 고기를 획득. 이 프로세스 내 피 엽 전환 (EndMT) 이라고 하 고 내 피 마커의 downregulation, 엽 마커 및 형태학 상 변화의 upregulation에 의해 특징입니다. EndMT 변형 성장 인자 (TGF)를 포함 하 여 여러 신호 통로 의해 유도-β, Wnt, 및 노치, 그리고 gastrulation, 조직 섬유 증에 대 한 비슷한 상피 엽 전환 (응급) 중요 한 분자 기계 장치에 의해 규제 및 암 전이입니다. EndMT의 메커니즘을 이해 하는 것은 EndMT를 대상으로 하는 진단 및 치료 접근을 개발 해야 합니다. 생체 외에서 EndMT의 강력한 유도 일반적인 유전자 식 서명 특성, druggable 분자 메커니즘을 식별 및 변조기 EndMT의 화면을 유용 합니다. 여기, 우리 EndMT의 유도 대 한 생체 외에서 방법을 설명합니다. MS 1 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 TGF-β에 장기간된 노출 후 EndMT를 받아야 하 고 upregulation 엽 마커 및 형태학 적 변화 뿐만 아니라 여러 염증 성 발산 및 cytokines의 유도 보여줍니다. 예측에 관한 (미르) 변조 분석을 위한 방법 또한 포함 되어 있습니다. 이 메서드는 기본 EndMT 및 EndMT miRNAs의 기여 하는 메커니즘을 조사 하는 플랫폼을 제공 합니다.

Introduction

내 피 엽 전환 (EndMT)는 차별화 된 내 피 세포 다양 한 섬유 아 세포와 같은 mesenchymal 세포1의 결과로 분자 변화를 겪 습 하는 과정입니다. EndMT 처음 심장2,3의 개발 하는 동안 내 피 세포 변환으로 설명 했다. 초기 심장 개발, 심장 관 내부 endocardium 및 외부 심근 구성 됩니다. 이 두 개의 레이어 심장 젤리 라고 하는 세포 외 매트릭스의 계층으로 구분 됩니다. 내 피 세포 마커를 획득, 배아 endocardial 셀 중간 엽 세포로 환승, 기본 심장 젤리, 침략 및 것 밸브 및 심장에 대 한 기초를 제공 하는 심장 쿠션의 형성을 촉진 그리고 semilunar 밸브입니다. 또한, EndMT 관상 동맥 혈관, 복 부 대동맥 및 폐 동맥4,,56을 포함 하 여 다른 배아 혈관 시스템에 pericytes 및 혈관 평활 근 세포의 소스를 되도록 제안 되었습니다. 또한, EndMT7돋 아 생리 신생에 연루 이다.

증거를 축적 하는 것은 EndMT도 여러 심혈 관 질환과 다른 질병1,8에 관련 된 것을 제안 했다. EndMT 관련 된 조건이 포함 혈관 석 회화, 동맥 경화 증, 폐 동맥 고혈압, 동굴 같은 기형, 기관 섬유 증, 정 맥 이식 개장, 이식 부전 신장 이식과 암8, 9,10,11,12,13,14,15,,1617, 18. 최근 보고서 설명 여러 분자 EndMT 마커 신장 이식17에서 신장 이식 부전의 진단 및 예 후 예측에 대 한 도구가 될 수 있습니다. EndMT 관련 세포 신호 통로의 변조 표시 되었습니다 심장 섬유 증을 포함 하 여 몇몇 질병 상태를 개량 하 고8,15모델 동물에 정 맥 이식 개장. 따라서, 메커니즘을 이해 기본 EndMT는 EndMT를 대상으로 하는 진단 및 치료 전략을 개발 해야 합니다.

EndMT-셀 접합, 철새 가능성, VE cadherin 같은 내 피 관련 유전자의 downregulation α-부드러운 근육 걸 (α-SMA)를 포함 한 엽 유전자의 upregulation의 손실에 의해 특징입니다. 또한, EndMT 및 상피 엽 전환 (응급), 중간 엽 세포, 상피 세포를 변환 하는 비슷한 과정 변경 된 생산의 발전에 기여할 수 있습니다 다양 한 세포 외 매트릭스 구성 요소와 연결 된 조직의 섬유 증8,19의.

최근, 여러 생체 외에서 연구 EndMT의 EndMT15,20의 분자 메커니즘의 세부 사항을 해명 했습니다. EndMT 변형 성장 인자 (TGF) 등 다양 한 신호 통로 의해 유도-β, Wnt,1단계 고. 그 중 TGF-β 응급 및 EndMT의 유도에서 중추적인 역할을 재생합니다. EndMT에 짧은 노출 부족21나타납니다 동안 노출 EndMT 다양 한 내 피 세포에서 TGF-β에 연장 한다. 우리는 여기 EndMT 유도, 어떤 마일 스벤 1 (MS-1)에서 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 받 다 생체 외에서 EndMT TGF-β20에 장기간된 노출 후에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델에서 여러 다운스트림 분석 형태 변경, 내 피 마커의 downregulation 엽 마커 및 염증 성 유전자, cytoskeletal의 upregulation 포함 하 여 EndMT의 특징 기능 조사를 수행할 수 있습니다. 재배열, 및 콜라겐 수축 젤.

MicroRNAs (miRNAs)는 22 ~ nt 다양 한 mRNA 대상22,23posttranscriptional 억압을 직접 작은 규제 RNAs. 씨앗 시퀀스 중재 대상 인식, 통해 miRNAs 대상 유전자의 수백을 억제 하 고 세포 분화, 확산, 운동 성 등 다양 한 세포 기능을 조절. 이 구급 대 및 EndMT, 규제에 대 한 경우 이며 또한 몇몇 miRNAs 응급 및 EndMT,2425의 레 귤 레이 터로 보고 되었습니다. 이 검토에서 제시 하는 EndMT 모델 EndMT에서 miRNAs의 역할을 테스트 하려면 미르 변조 절차와 쉽게 결합할 수 있습니다. 현재 검토 MS-1 세포에서 TGF-β-유도 EndMT를 조사 하기 위해 우리의 실험 절차를 요약 하 고 또한 다른 내 피 세포에서 TGF-β에 의해 EndMT 유도의 조건의 비교를 포함 한다.

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Protocol

1입니다. EndMT의 유도

  1. 표준 문화 조건에 MS-1 세포를 유지 하 고 confluency을 피하기 위해. MS-1 셀의 소스 테이블의 자료에 설명 되어 있습니다. MS-1 셀에 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 50 U/mL 페니실린, 및 50 μ g/mL 스 최소 필수 매체-α (MEM-α)를 사용 합니다.
  2. 10 cm에 씻어 MS-1 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 접시 하 고 접시에 trypsin의 1.0 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어
  3. 문화 미디어의 9 mL를 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 합니다.
  4. 실 온에서 5 분 동안 300-400 x g 에 세포 현 탁 액 원심
  5. 조심 스럽게는 상쾌한을 제거 하 고 미리 데워 진된 문화 미디어에 셀 펠 릿을 중단.
  6. Trypan 블루 솔루션 및 표준 hemocytometer 또는 자동 셀 카운터를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다.
  7. 긴 기간 문화에 대 한 c m2 당 103 셀 x 0.5에서 코팅된 표준 문화 접시에 접시 MS-1 셀. 예를 들어 당 6에서 잘 플레이트 5.0 x 103 셀 잘 격판덮개 문화. FCS의 동일한 농도 포함 하 여 동일한 문화 매체를 사용 합니다. MS-1 셀, TGF-β FCS의 사용으로 장기 문화 (적어도 48-72 h)에 EndMT을 유도합니다.
  8. 24 시간 후 TGF-β2 (1 ng/mL의 최종 농도)와 내 피 세포를 자극.
  9. (5% CO2, 37 ° C) 습도 인큐베이터에 문화 세포. 때 형태학 변화에 초점을 맞추고 세포를 매일 모니터링 합니다.
  10. 장기적인 문화에서 TGF-β와 치료의 48 h 후 TGF-β2를 포함 하는 신선한 미리 데워 진된 문화 미디어에 미디어를 바꿉니다.
  11. 다운스트림 분석을 진행 합니다. 일반적으로, 말라 개편 후 치료, 24 h 관찰 하 고 내 피 마커의 downregulation 및 엽 마커의 upregulation TGF-β와 치료의 48-72 시간 후 관찰 된다.

2. Immunocytochemical 분석

  1. MS-1 셀 표준 문화 조건에 유지 합니다.
  2. 플레이트 MS-1 셀 4에 잘 잘 (1.7 cm2) 당 103 셀 x 1.0에서 문화 챔버 슬라이드 세포. 슬라이드는 미리 젤라틴 코팅. 잘 당 문화 미디어의 사용 0.5-1.0 mL.
  3. 24 시간 후 TGF-β2 (1 ng/mL의 최종 농도)와 내 피 세포를 자극. 분석할 때 EndMT에 바위의 참여, TGF-β 치료 록 억제제 Y-27632 (10 μ M) 1 시간 전에 추가 합니다. TGF-β 신호 억제의 효과 평가할 때는 TGF-β 수용 체 키 니 아 제 억제제를 사용할 수 있습니다.
  4. (5% CO2, 37 ° C) 습도 인큐베이터에 문화 세포. 말라 개편 TGF-β와 치료의 24 h 후 MS-1 셀에서 관찰 됩니다. 다른 변경 후 48-72 h 치료의 명백한 될. 72 h 문화에 대 한 신선한 미디어 TGF-β와 치료의 48 h 후 TGF-β를 포함 미디어를 교체 합니다.
  5. F-말라 얼룩
    1. TGF-β 치료의 24 h 후 미디어를 제거 하 고 실 온에서 20 분에 대 한 1 x PBS에 4 %paraformaldehyde 셀 수정 1 x PBS 가진 세포를 씻어.
    2. 실 온에서 5 분에 대 한 Triton X-100 0.2% 품 어.
    3. 3 번 1 x PBS와 셀 린스.
    4. Phalloidin tetramethylrhodamine B isothiocyanate 버섯 phalloides 희석 150-fold에서 함께 품 어 실 온에서 1 h에 대 한 차단 버퍼.
    5. 3 번 1 x PBS와 셀 린스.
    6. 실 온에서 5 분 동안 cyanine 핵 산 바인딩 염료와 핵 얼룩.
    7. 린스 슬라이드 마운트 coverslips 미디어를 탑재 하는 슬라이드를 사용 하 여 슬라이드에 얼굴.
    8. Confocal 현미경으로 관찰 합니다. 543 nm 레이저와 560-615 nm의 방출 필터를 사용 하 여 phalloidin의 형광의 탐지를 위해. 633 nm 레이저와 650 이상 방출 필터를 사용 하 여 핵 얼룩에 대 한 nm. TGF-β와 치료, 시 두꺼운 스트레스 섬유의 형성 관찰 될 것 이다.
  6. VE cadherin와 α-SMA 얼룩
    1. TGF-β 치료의 72 h 후 미디어를 제거, 감기 50% 메탄올 및 50% 아세톤 셀 수정 (0.5-1.0 mL 잘 당) 5 분.
    2. 3 번 1 x PBS와 셀 린스 (0.5-1.0 mL 잘 당).
    3. 제조업체의 권장된 농도 따라 어둠 속에서 4 ° C에서 하룻밤 블로킹 버퍼에 1 차 항 체로 품 어. 사용 하 여 VE cadherin 단일 클론 항 체 (BV13, 1: 100 희석)와 α-SMA Cy3 활용 된 단일 클론 항 체 (1A4, 1: 200 희석)20.
    4. 3 번 1 x PBS와 셀 린스.
    5. 녹색 염료 활용 된 이차 항 체 제조 업체의 권장된 농도 따라 어둠 속에서 실 온에서 1 h에 대 한 블로킹 버퍼에 VE cadherin 항 체를 가진 세포를 품 어.
    6. 3 번 1 x PBS와 셀 린스.
    7. 실 온에서 5 분 동안 cyanine 핵 산 바인딩 염료와 핵 얼룩.
    8. 린스 슬라이드 마운트 coverslips 미디어를 탑재 하는 슬라이드를 사용 하 여 슬라이드에 얼굴.
    9. Confocal 현미경으로 관찰 합니다. 543 nm 레이저와 560-615 nm의 방출 필터를 사용 하 여 α-SMA (Cy3)의 탐지를 위해. 488 nm 레이저와 505-550 nm의 방출 필터를 사용 하 여 VE cadherin의 검출에 대 한. 일반적으로, TGF-β 치료와 치료, 따라 VE cadherin 신호 감소 하 고 α-SMA 신호에서 증가 관찰 될 것 이다.

3. 3 차원 콜라겐 젤 수축 시험

  1. 콜라겐 젤 수축 시험 전에 72 h에 대 한 MS-1 세포와 함께/없이 TGF-β의 문화를 수행 합니다.
  2. 유형 준비 나 얼음에 콜라겐 젤. 믹스 차가운 콜라겐 솔루션, 집중 10 x 메모리 매체, 0.05 N NaOH, 2.2% NaHCO3및 8: 1에서 200 mM HEPES pH 7.4 포함 된 콜라겐 희석 버퍼: 1의 비율.
  3. 혼합 제어 또는 내 피 성장 세포 TGF-β-취급 정지 (106 셀/200 μ x 1.0) 200 mL와 콜라겐 젤 솔루션의 800 μ. TGF-β에 대 한 치료 샘플 추가 TGF-β2 (1 ng/mL)는 세포 현 탁 액을.
  4. 12 잘 문화 접시의 각 음에 혼합물의 1.0 mL를 추가 하 고 30-60 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 공고히 하 허용.
  5. 젤라틴, 후 1.0 mL MEM-α의 10 %FCS, 50 U/mL 페니실린, 및 50 μ g/mL 스 젤을 오버레이. TGF-β에 대 한 치료 샘플 추가 TGF-β2 (1 ng/mL)는 미디어.
    참고: TGF-β 처리 샘플에 대 한 젤 및 문화 미디어 TGF-β를 추가 합니다.
  6. 48 h에 대 한 37 ° C에서 부동 젤 품 어.
  7. 스캐너를 사용 하 여 접시의 아래쪽에서 젤의 이미지 스캔 합니다. 또는 젤은 젤 위에 고정 된 거리에서 디지털 카메라를 사용 하 여 이미지를 기록 합니다.
  8. ImageJ를 사용 하 여 픽셀 수에 따라 젤 표면적 계량. 자유형 선택 또는 관련된 선택 도구를 사용 하 여 젤을 선택 하거나 선택 하는 젤을 사용 하 여 "이미지 | 조정 | 색상 임계값"도구를, 그리고 다음의 젤을 사용 하 여 영역을 결정" 분석 | 측정"명령입니다.

4. 잠겨 핵 산 기반 미르 억제제 여 miRNA 활동의 억제

  1. MS-1 셀 표준 문화 조건에 유지 합니다.
  2. Transfect 잠겨 핵 산 (LNA) 미르 억제제, 합성 미르 duplexes 또는 siRNAs (20 또는 50 nM) 제조 업체의 지시에 따라 lipofection 시 약을 사용 하 여. 세부 사항 및 LNA 미르 억제제, 합성 미르 duplexes와 siRNAs의 소스 우리의 이전 보고서26,27에 설명 했다. MS-1 셀, 제조업체의 지시에 따라 표준 transfection 절차 LNA 미르 억제제, 합성 미르 duplexes 또는 siRNAs의 도입을 위해 잘 작동.
  3. 16-48 h 후 TGF-β2 (1 ng/mL의 최종 농도)와 내 피 세포를 자극.
  4. RNA 식 분석 (양적 RT-PCR 및 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) 분석), immunocytochemical 분석 및 기자 시험을 포함 하 여 다양 한 다운스트림 분석을 진행 합니다. 다운스트림 분석 우리의 이전 보고서20,,2627에 설명 되어 있다.

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Representative Results

TGF-β는 다양 한 내 피 세포에서 EndMT의 강력한 유도. 24 시간 치료 후 MS-1 세포에서 TGF-β로, F 걸 대 한 얼룩 말라 스트레스 섬유 (그림 1A)20의 개편을 보여 줍니다. Y-27632 바위 억제제와 전처리 말라 개편20의 유도 억제. MS-1 내 피 세포 클래식 조약돌 모양의 형태에서 TGF-β 치료 (그림 1B)에 따라 엽 스핀 들 모양의 형태를 변경합니다. TGF-β-치료 세포 세포 세포 접촉을 잃게됩니다. 치료 후 TGF-β와 48-72 시간, immunocytochemical 분석 VE cadherin 감소 표현과 α-SMA (그림 1C)의 증가 식 보여 줍니다. TGF-β는 크게 후 치료 (그림 1D 1E)의 48-72 h α-SMA MS-1 세포의 mRNA와 단백질 수준에서의 식을 유도 한다. 포유류 TGF-β 포함 TGF-β1, 2, 및 3 isoforms. 교양 마우스 endocardial 쿠션 explants를 사용 하 여 이전 연구는 TGF-β2 하지만 하지 TGF-β3 endocardial 쿠션 셀28의 변화에 대 한 의무는 보이고 있다. 다른 한편으로, 우리는 이전 α-SMA 식에 3 개의 isoforms의 효과 비교 하 고 모든 isoforms 마찬가지로 MS-1 셀20에 α-SMA 식 유도 확인. 콜라겐 젤 수축 분석 결과 콜라겐 유형 MS-1 셀 다음 TGF-β 치료 (그림 1 층)에 의해 젤의 향상 된 수축을 보여줍니다. 이 효과 세포 외 기질을 개장 하 엽 셀 용량의 인수를 제안 합니다. 이러한 특징은 EndMT20의 전형적인 특성 이다. 우리의 이전 보고서20에서 바위 억제제 Y-27632 치료는 강하게 Fibronectin 1 MMP-2 등 다른 TGF-β 대상 유전자의 감 응 작용의 부수적인 억제 없이 엽 마커 α-SMA 및 SM22α의 유도 억제.

EndMT는 매우 역동적인 과정 이다. MS-1 셀, α-SMA 표현과 형태에 TGF-β의 효과 가역; TGF-β 박탈 후 셀을 기초 수준 (그림 2A), α-SMA 식 감소 복구 조약돌 모양의 형태 (그림 2B). 또한, EndMT 및 구급 대의 유도 동적 변화 여러 발산 및 cytokines의 분 비 능력에 연결 됩니다. 여러 염증 성 발산 및 CCL17, CX3CL1, CXCL16, cytokines 일리노이-6, 그리고 Angptl2 우리가 이전 지정 하는 EndMT 관련 된 분 비 형 (EndMT SP)26MS-1 셀에서 TGF-β에 의해 유도 된다. 이 실험적인 모델은 EndMT 및 EndMT sp.의 putative 레 귤 레이 터를 조사 하는 데 유용 우리 이전 강화 또는 억제 하는 miRNA 활동26,27EndMT에 몇몇 miRNAs의 역할을 공부 했습니다. MS-1 셀에서 miRNA 활동 튼튼하게 미르 모방 oligonucleotides 또는 miRNA LNA 기반 억제제에 의해 변조 될 수 있습니다 그리고 포함 RNA-seq 분석 쉽게 될 수 있는 여러 다운스트림 분석 수행 (그림 3). 통합 transcriptome 분석을 바탕으로, 우리는 이전 연결 constitutively 활성 미르-31 EndMT 규칙 MS-1 셀26에. 기존의 TGF-β 대상의 유도 영향을 미치지 않는 동안 RNA-seq 분석 엽 표식 (그림 3A)와 EndMT-특검팀 유전자 (그림 3C)의 유도의 감쇄에 LNA 미르 억제제 결과 미르-31의 그의 억제를 보였다 Fibronectin 1, 파이-1, Smad7 등의 유전자 (그림 3B)와 downregulation의 내 피 마커 (그림 3D)26. TGF-β와 미르-31 downregulate Stk40, NF-κB 통로, EndMT sp.의 잠재적인 레 귤 레이 터의 역할의 부정적인 레 귤 레이 터 TGF-β는 미르-31의 식을 증가 하지 않는다, 비록 TGF-β 대체 polyadenylation 중재 제외 Stk40에 내부 많은 순서의 3' UTR, 제정 활성 미르-31 그리고 마지막으로 억제 하 여 Stk40의 대상으로 그로 인하여 향상 유도 Stk4026. 또한, 우리는 이전 EndMT27에서 TGF-β-유도할 수 있는 미르-27b 역할 검사. 미르-27의 저해 기존의 TGF-β 대상 유전자, EndMT-특검팀 유전자에 영향을 하면서 엽 표식 (그림 3A)의 upregulation를 억압 하 고 내 피 마커 했다 한계 (그림 3B, 3c, 3D)27 .

Figure 1
그림 1 : MS-1에서 EndMT의 유도 TGF-β에 의해 세포. (A) MS-1에서 말라 개편 후 TGF-β2 치료 (1 ng/mL)의 24 h 세포. (B) Morphological TGF-β2 치료 (1 ng/mL)의 72 h 후 MS-1 셀에 변경합니다. (C) Immunocytochemical 후 72 h TGF-β2 치료 (1 ng/mL)의 VE cadherin와 α-SMA MS-1 셀에 대 한 분석. (D, E) Α-SMA, 표준 양적 RT-PCR 분석 (D)와 서 부에 의해 결정에 식 변화 분석 (E) 오 점. (F) 콜라겐 젤 수축 분석 결과. 원래 표면에 TGF-β2 치료 (1 ng/mL)와 함께/없이 72 h 문화 후 표면적의 비율이 표시 됩니다. 스케일 바 = (A와 C), 20 μ m 및 200 μ m (B). 그림은 Mihira 그 외 여러분 에서 수정 20. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : MS-1 세포에서 TGF-β의 가역 효과. (A) α-SMA mRNA 표정 그리고 TGF-β2 MS-1 셀에서의 철수 후 (B) 세포 형태학. 스케일 바 = 200 μ m. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : MS-1 세포에서 RNA-seq 분석. LNA 미르 억제제 및 TGF-β2 (72 h) 치료의 도입, 후 RNA-seq 분석 수행된26,27이었다. NC: 부정적인 제어 합니다. 대표적인 유전자의 표정 변화 (A, 엽 마커; 표시 됩니다. B, 기존의 TGF-β 대상 유전자; C, EndMT-특검팀 유전자; 그리고 D, 내 피 마커). FPKM (kilobase 백만 매핑된 읽기 당 대 본의 당 조각) 값 컨트롤 샘플 (TGF-β2 치료 없이 LNA-NC)의 값으로 정규화 되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다.

셀 유형 엽 마커 유도의 조건 참조
인간의 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVEC) 엽 차별화 매체 (TGF-β 5 ng/mL, PDGF BB 25 ng/mL)에 의해 유도 5 ~ 21 일. Krenning 외.
인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HCMEC) TGF-β2에 의해 유도 (10 ng/mL), FBS, 2 일 없이. 메디치 외.
인간의 관상 동맥 내 피 세포 (HCEC) TGF-β1에 의해 유도 (10 ng/mL), 6 일. BMP-7에 의해 저해입니다. Zeisberg 외.
마우스 폐 내 피 세포 (MLEC) TGF-β1에 의해 유도 (10 ng/mL), 2%로 감소 FBS, 내 피 물질, 2 일 없이. Zeisberg 외 알입니다.
쥐 뇌 내 피 세포 (BEC) TGF-β1에 의해 유도 (10 ng/mL), 2 일. Krizbai 외.
소 대동맥 내 피 세포 (BAEC) TGF-β1에 의해 유도 (1 ng/mL), 5 일. Arciniegas 외.
불멸 하 게 소 망막 microvascular 내 피 세포 (iBREC) TGF-β2에 의해 유도 (10 ng/mL), 3-6 일. Deissler 외.
양 대동맥 밸브 내 피 세포 TGF-β1 또는 3 (1 ng/mL), 6 일 감 응 작용. Paranya 외.
MS 1 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 TGF-β에 의해 유도 (10 ng/mL), Ras 식, 1 일 활성화. 하시 모토 외.
MS 1 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 TGF-β2에 의해 유도 (1 ng/mL), 2-3 일. Mihira 외.

표 1: 유도 TGF-EndMT의β 다양 한 내 피 세포에. TGF-β에 의해 EndMT 유도의 문화 조건이 요약 되어 있습니다. 혈 청 농도 추가 또는 다른 성장 요인의 제거를 포함 하 여 문화 조건에 변화는 또한 지적 했다.

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Discussion

그것은 24 h에 대 한 활성화 된 Ras 및 TGF-β 치료에 MS-1 셀, EndMT 유도 TGF-β 혼자21이 짧은 기간 EndMT를 유도 하는 데 실패 하는 동안 보고 되었습니다. 지속적으로, 우리는 TGF-β 실질적으로 유도 EndMT 더 이상 치료 (48-72 h) 후 MS-1 셀20에 관찰. 인간의 배꼽 등 다양 한 내 피 세포에서 TGF-β (2-6 일)와 장기 치료 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HCMEC), 인간 관상 동맥 내 피 세포 (후 EndMT 반복적으로 관찰 되었다 HCEC), 마우스 폐 내 피 세포 (MLEC), 쥐 뇌 내 피 세포 (BEC), 소 대동맥 내 피 세포 (BAEC), 불멸 하 게 소 망막 microvascular 내 피 세포 (iBREC), 그리고 양 대동맥 밸브 내 피 세포8, 18,29,30,31,32,,3334. 표 1에서 우리는 다양 한 내 피 세포8,18,20,,2129, TGF-β에 의해 엽 마커 유도의 조건 요약 30,,3132,,3334. 이러한 보고서의 비교 각 내 피 세포 라인 EndMT에 대 한 서로 다른 임계값을가지고 나왔다. TGF-β 또는 다른 메커니즘을 차동 감도 다른 장기에서 다양 한 EndMT 관련 병 적인 조건 기반이 될 수 있습니다 됩니다. 이 비보에 연구의 결과 함께 고려 되어야 한다.

생체 외에서 EndMT 유도 프로토콜의 세부 사항을 다른 세포 라인에 맞게 해야: ., TGF-β, 혈 청, 추가 또는 다른 성장 요인과 문화 기간의 제거의 농도의 농도. 예를 들어 HUVECs는 종종 저조한 TGF-β에 응답 및 EndMT PDGF BB 및 염증 성 자극에와 같은 다른 요소와 함께 또는 혈 청 농도 및 설정29 이상 문화에서 다른 중간 구성 요소 변조에 의해 유도 될 것 , 35. 또한, overconfluency TGF-β에 대 한 응답을 완화 것입니다.

EndMT는 동적 프로세스와는 반대 과정 내 피 엽 전환 (MEndoT) 라는 최근 보고 된36되었습니다. TGF-β 혼자에 의해 엽 마커의 유도 MS-1 셀 (그림 2)에 뒤집을 수 있는 동안에, 그것은 보고 되었습니다 활성화 된 Ras와 MS-1 셀에서 내 피 마커의 그 downregulation TGF-β21의 철수 후에 유지. 돌이킬 수 없는 EndMT iBREC 양 대동맥 밸브 내 피 세포33,34에 또한 보고 되었습니다. 또한, 이전 보고서 EndMT 프로세스 Ras GTP의 지속적인된 활성화와 인간의 관상 동맥 내 피 세포37RASAL1 발기인의 메 틸 화 TGF-β의 철수 후에 유지 했다. 따라서, 이러한 모델의 비교 내 피 세포가 소성의 규제 메커니즘을 이해 하는 유용한 또한 있을 수 있습니다.

EndMT 유도에 내 피 세포의 응답 실질적으로 유형의38나타납니다. 샤 오 외. 유 방 종양 모델에서 종양 전용 내 피 세포 TGF-β 자극38에 대 한 응답 EndMT의 뚜렷한 형태를 표시 했다. TGF-β 기반 EndMT는 또한 FGF-2, BMP-7, 그리고 일 1β35,,3738를 포함 하 여 다른 신호 통로 의해 변조 된다. 우리는 또한 TNF-α 강화 TGF-β-유도 된 EndMT 및 EndMT-SP MS-1에서 셀26발견. 또한, 그것은 잘 알려진 EndMT Wnt, 노치와 hypoxia1를 포함 하 여 다른 신호 통로 의해 유발 됩니다. 따라서, 다양 한 내 피 세포에 다른 자극과 함께 EndMT 응답의이 이해 하는 것이 중요 있을 수 있습니다.

여기에 제시 된 EndMT 프로토콜 조사 EndMT의 레 귤 레이 터를 쉽게 수정할 수 있습니다. 사실, 우리는 MS-1 셀20,,2627에 EndMT의 다양 한 레 귤 레이 터 특징 있다. 구 아닌 뉴클레오티드 교환 요인 Arhgef5 및 myocardin 관련 된 녹음 방송 요인-둘 다 MS-1 셀20에 α-SMA upregulation에 기여 하 고 있습니다 (MRTF A) Smad 신호에 의해 유도 된다. 따라서, 모두로 신호를 활성화 TGF-β 신호 및 EndMT 유도 하 MRTF-A. 또한, 우리는 또한 constitutively 활성 미르-31 및 TGF-β-유도할 수 있는 미르-27b 긍정적으로 EndMT 유도26,27규제 발견. MS-1 셀에 constitutively 활성 미르-31은 또한 TGF-β-유도 EndMT SP26. 전반적으로, 이러한 생체 외에서 EndMT 유도 절차는 EndMT의 생물학을 이해 하 고, EndMT 관련 유전자 서명을 식별 하 고이 과정을 조절 하는 전략을 개발 도움이 될 것.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 지 시 Borok와 고헤이 Miyazono 원고 준비에 대 한 감사. 당사와 수소 우에하라 기념 재단 연구 친교에 의해 지원 되 고 당사 해외 유학에 대 한 수정 Hayaishi 기념 장학금에 의해 지원 됩니다. 이 작품은 다케다 과학 재단 (A.S.)에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

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내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석
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Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

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