내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

Summary

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

Abstract

내 피 세포의 phenotypic가 소성 기초 심장 혈관 시스템 개발, 심장 혈관 질병, 및 기관 섬유 증과 관련 된 다양 한 조건. 이러한 조건에서 차별화 된 내 피 세포는 엽 같은 고기를 획득. 이 프로세스 내 피 엽 전환 (EndMT) 이라고 하 고 내 피 마커의 downregulation, 엽 마커 및 형태학 상 변화의 upregulation에 의해 특징입니다. EndMT 변형 성장 인자 (TGF)를 포함 하 여 여러 신호 통로 의해 유도-β, Wnt, 및 노치, 그리고 gastrulation, 조직 섬유 증에 대 한 비슷한 상피 엽 전환 (응급) 중요 한 분자 기계 장치에 의해 규제 및 암 전이입니다. EndMT의 메커니즘을 이해 하는 것은 EndMT를 대상으로 하는 진단 및 치료 접근을 개발 해야 합니다. 생체 외에서 EndMT의 강력한 유도 일반적인 유전자 식 서명 특성, druggable 분자 메커니즘을 식별 및 변조기 EndMT의 화면을 유용 합니다. 여기, 우리 EndMT의 유도 대 한 생체 외에서 방법을 설명합니다. MS 1 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 TGF-β에 장기간된 노출 후 EndMT를 받아야 하 고 upregulation 엽 마커 및 형태학 적 변화 뿐만 아니라 여러 염증 성 발산 및 cytokines의 유도 보여줍니다. 예측에 관한 (미르) 변조 분석을 위한 방법 또한 포함 되어 있습니다. 이 메서드는 기본 EndMT 및 EndMT miRNAs의 기여 하는 메커니즘을 조사 하는 플랫폼을 제공 합니다.

Introduction

내 피 엽 전환 (EndMT)는 차별화 된 내 피 세포 다양 한 섬유 아 세포와 같은 mesenchymal 세포¹의 결과로 분자 변화를 겪 습 하는 과정입니다. EndMT 처음 심장^2,3의 개발 하는 동안 내 피 세포 변환으로 설명 했다. 초기 심장 개발, 심장 관 내부 endocardium 및 외부 심근 구성 됩니다. 이 두 개의 레이어 심장 젤리 라고 하는 세포 외 매트릭스의 계층으로 구분 됩니다. 내 피 세포 마커를 획득, 배아 endocardial 셀 중간 엽 세포로 환승, 기본 심장 젤리, 침략 및 것 밸브 및 심장에 대 한 기초를 제공 하는 심장 쿠션의 형성을 촉진 그리고 semilunar 밸브입니다. 또한, EndMT 관상 동맥 혈관, 복 부 대동맥 및 폐 동맥^4,,56을 포함 하 여 다른 배아 혈관 시스템에 pericytes 및 혈관 평활 근 세포의 소스를 되도록 제안 되었습니다. 또한, EndMT⁷돋 아 생리 신생에 연루 이다.

증거를 축적 하는 것은 EndMT도 여러 심혈 관 질환과 다른 질병^1,8에 관련 된 것을 제안 했다. EndMT 관련 된 조건이 포함 혈관 석 회화, 동맥 경화 증, 폐 동맥 고혈압, 동굴 같은 기형, 기관 섬유 증, 정 맥 이식 개장, 이식 부전 신장 이식과 암^{8, 9,10,11,12,13,14,15,,1617, 18}. 최근 보고서 설명 여러 분자 EndMT 마커 신장 이식¹⁷에서 신장 이식 부전의 진단 및 예 후 예측에 대 한 도구가 될 수 있습니다. EndMT 관련 세포 신호 통로의 변조 표시 되었습니다 심장 섬유 증을 포함 하 여 몇몇 질병 상태를 개량 하 고^8,15모델 동물에 정 맥 이식 개장. 따라서, 메커니즘을 이해 기본 EndMT는 EndMT를 대상으로 하는 진단 및 치료 전략을 개발 해야 합니다.

EndMT-셀 접합, 철새 가능성, VE cadherin 같은 내 피 관련 유전자의 downregulation α-부드러운 근육 걸 (α-SMA)를 포함 한 엽 유전자의 upregulation의 손실에 의해 특징입니다. 또한, EndMT 및 상피 엽 전환 (응급), 중간 엽 세포, 상피 세포를 변환 하는 비슷한 과정 변경 된 생산의 발전에 기여할 수 있습니다 다양 한 세포 외 매트릭스 구성 요소와 연결 된 조직의 섬유 증^8,19의.

최근, 여러 생체 외에서 연구 EndMT의 EndMT^15,20의 분자 메커니즘의 세부 사항을 해명 했습니다. EndMT 변형 성장 인자 (TGF) 등 다양 한 신호 통로 의해 유도-β, Wnt,¹단계 고. 그 중 TGF-β 응급 및 EndMT의 유도에서 중추적인 역할을 재생합니다. EndMT에 짧은 노출 부족²¹나타납니다 동안 노출 EndMT 다양 한 내 피 세포에서 TGF-β에 연장 한다. 우리는 여기 EndMT 유도, 어떤 마일 스벤 1 (MS-1)에서 마우스 췌 microvascular 내 피 세포 받 다 생체 외에서 EndMT TGF-β²⁰에 장기간된 노출 후에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 모델에서 여러 다운스트림 분석 형태 변경, 내 피 마커의 downregulation 엽 마커 및 염증 성 유전자, cytoskeletal의 upregulation 포함 하 여 EndMT의 특징 기능 조사를 수행할 수 있습니다. 재배열, 및 콜라겐 수축 젤.

MicroRNAs (miRNAs)는 22 ~ nt 다양 한 mRNA 대상^22,23posttranscriptional 억압을 직접 작은 규제 RNAs. 씨앗 시퀀스 중재 대상 인식, 통해 miRNAs 대상 유전자의 수백을 억제 하 고 세포 분화, 확산, 운동 성 등 다양 한 세포 기능을 조절. 이 구급 대 및 EndMT, 규제에 대 한 경우 이며 또한 몇몇 miRNAs 응급 및 EndMT^,2425의 레 귤 레이 터로 보고 되었습니다. 이 검토에서 제시 하는 EndMT 모델 EndMT에서 miRNAs의 역할을 테스트 하려면 미르 변조 절차와 쉽게 결합할 수 있습니다. 현재 검토 MS-1 세포에서 TGF-β-유도 EndMT를 조사 하기 위해 우리의 실험 절차를 요약 하 고 또한 다른 내 피 세포에서 TGF-β에 의해 EndMT 유도의 조건의 비교를 포함 한다.

Protocol

1입니다. EndMT의 유도 표준 문화 조건에 MS-1 세포를 유지 하 고 confluency을 피하기 위해. MS-1 셀의 소스 테이블의 자료에 설명 되어 있습니다. MS-1 셀에 10% 태아 종 아리 혈 청 (FCS), 50 U/mL 페니실린, 및 50 μ g/mL 스 최소 필수 매체-α (MEM-α)를 사용 합니다. 10 cm에 씻어 MS-1 셀 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 접시 하 고 접시에 trypsin의 1.0 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 5 분 동안 품 어</…

Representative Results

TGF-β는 다양 한 내 피 세포에서 EndMT의 강력한 유도. 24 시간 치료 후 MS-1 세포에서 TGF-β로, F 걸 대 한 얼룩 말라 스트레스 섬유 (그림 1A)20의 개편을 보여 줍니다. Y-27632 바위 억제제와 전처리 말라 개편20의 유도 억제. MS-1 내 피 세포 클래식 조약돌 모양의 형태에서 TGF-β 치료 (그림 1B)에 따라 ?…

Discussion

그것은 24 h에 대 한 활성화 된 Ras 및 TGF-β 치료에 MS-1 셀, EndMT 유도 TGF-β 혼자²¹이 짧은 기간 EndMT를 유도 하는 데 실패 하는 동안 보고 되었습니다. 지속적으로, 우리는 TGF-β 실질적으로 유도 EndMT 더 이상 치료 (48-72 h) 후 MS-1 셀²⁰에 관찰. 인간의 배꼽 등 다양 한 내 피 세포에서 TGF-β (2-6 일)와 장기 치료 정 맥 내 피 세포 (HUVEC), 인간의 피부 microvascular 내 피 세포 (HC…

Materials

MS-1 cells	American Type Culture Collection	CRL-2279
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	32571036
TGF-beta2	R&D	302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide	Thermo Fisher Scientific	154526
Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503
Blocking One	nacalai tesque	03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
TOTO-3 iodide	Thermo Fisher Scientific	T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13)	Thermo Fisher Scientific	14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4)	Sigma-Aldrich	C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11001
Cover slip	Thermo Fisher Scientific	174934
Collagen solution	Nitta gelatin Inc.	Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer	Nitta gelatin Inc.	Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor	EXIQON	miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex	Qiagen	miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778030
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668027