Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Молекулярный анализ эндотелиальной мезенхимальных перехода, вызванных преобразования сигналов фактор роста β

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

Протокол для индукции в vitro эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT), которая является полезной для расследования сотовой сигнальных путей, участвующих в EndMT, описал. В этой экспериментальной модели EndMT вызванные лечение с TGF-β в эндотелиальных клетках MS-1.

Abstract

Фенотипические пластичности эндотелиальных клеток лежит в основе развития сердечно-сосудистой системы, сердечно-сосудистые заболевания и различные условия, связанные с фиброзом орган. В этих условиях дифференцированной эндотелиальные клетки приобретают мезенхимы как фенотипы. Этот процесс называется эндотелиальной мезенхимальных перехода (EndMT) и характеризуется Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров, и морфологических изменений. EndMT индуцируется несколько сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и паз и регулируется молекулярные механизмы аналогичны эпителия мезенхимальных перехода (EMT) важные для гаструляция, фиброз тканей, и метастазами рака. Понимание механизмов EndMT имеет важное значение для разработки диагностических и терапевтических подходов, ориентации EndMT. Надежные индукции EndMT в vitro полезным характеризовать общим подписи выражение гена, определять druggable молекулярных механизмов и экран для модуляторы EndMT. Здесь мы описываем в vitro метод для индукции EndMT. MS-1 мыши поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки проходят EndMT после увеличиваемой подвержения к TGF-β и показать upregulation мезенхимальных маркеров и морфологические изменения, а также индукции несколько воспалительных chemokines и цитокинов. Также включены методы для анализа микроРНК (miRNA) модуляции. Эти методы предоставляют платформу для изучения механизмов лежащих в основе EndMT и вклад адаптивной к EndMT.

Introduction

Эндотелия мезенхимальных переход (EndMT) является процессом, в котором дифференцированной эндотелиальных клеток проходит целый ряд молекулярных изменений, что приводит к фибробластоподобных мезенхимальных клеток1. Первоначально EndMT был описан как преобразование эндотелиальных клеток во время разработки в сердце2,3. В начале развития сердца сердце трубка состоит из эндокарда внутренний и наружный миокарде. Эти два слоя разделены слоем внеклеточного матрикса, называется сердечной желе. Эмбриональные клетки эндокарда, которые приобретают эндотелиальных клеток маркеры, транзита в Мезенхимальные клетки, вторгнуться базовой сердца желе и способствуем формированию сердца подушки, создавая основу для Предсердно-желудочковые клапаны и перегородки и Полулунные клапаны. Кроме того было предложено EndMT быть источники pericytes и сосудистой гладкой мышечной клетки в других эмбриональной сосудистой системы, включая коронарных сосудов, брюшной аорты и легочной артерии4,5,6. Кроме того EndMT причастны физиологических ангиогенных прорастания7.

Накапливая доказательства предположил, что EndMT также участвует в нескольких сердечно-сосудистых заболеваний и других болезней1,8. EndMT связанного условия включают сосудистой кальцификации, атеросклероз, легочной артериальной гипертензии, кавернозных мальформация, орган фиброз, вен трансплантата Ремоделирование, аллотрансплантатом дисфункции в трансплантации почки и рак8, 9,10,11,12,13,14,,1516,17, 18. недавнем докладе говорится, что несколько молекулярных маркеров EndMT может быть инструментом для диагностики и прогноза предсказания дисфункции почек трансплантата в почечной трансплантации17. Модуляции клеточных сигнальных путей, связанных с EndMT было показано для улучшения несколько условий болезни, включая фиброз сердца и вен трансплантата Ремоделирование в животных моделей8,15. Таким образом понимание механизмов базовой EndMT важно развивать диагностические и терапевтические стратегии, ориентированные EndMT.

EndMT характеризуется потерей ячеек развязок, увеличение миграционным потенциалом, Даунрегуляция эндотелиальной конкретных генов как ве Кадгерины и upregulation мезенхимальных генов, включая актина α-гладких мышц (α-SMA). Кроме того EndMT и эпителия мезенхимальных перехода (EMT), аналогичный процесс, который преобразует эпителиальных клеток мезенхимальных клеток, связаны с измененной производства различных компонентов внеклеточного матрикса, которые могут внести вклад в развитие 8,фиброз тканей19.

Недавно несколько исследований в пробирке EndMT раскрыты подробности молекулярных механизмов EndMT15,20. EndMT индуцируется различных сигнальных путей, включая трансформирующий фактор роста (TGF)-β, Wnt и надрезать1. Среди них TGF-β играет ключевую роль в индукции EMT и EndMT. В EndMT продолжительное воздействие TGF-β результаты в EndMT в различных эндотелиальных клеток, в то время как короткие выдержки, как представляется, недостаточно21. Здесь мы описали простой протокол для индукции EndMT, в которых Свен 1 миля (МС-1) поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши пройти EndMT в vitro после увеличиваемой подвержения к TGF-β20. В этой модели можно выполнить несколько ниже по течению анализа расследовать отличительной черты EndMT, в том числе морфологические изменения, Даунрегуляция эндотелиальной маркеров, upregulation мезенхимальных маркеров и воспалительные гены, цитоскелета перестановки и сокращение гель коллагена.

МикроРНК (интерферирующим) являются ~ 22 nt малых регулирования РНК, которые направляют посттранскрипционного репрессии в отношении различных мРНК целей22,-23. Через признание целевой последовательности опосредованной семян адаптивной подавить сотни целевых генов и модулировать различных клеточных функций, таких как дифференцировки клеток, распространением и подвижности. Это также касается регулирования EMT и EndMT, и несколько интерферирующим были зарегистрированы как регуляторы EMT и EndMT24,25. EndMT модель, представленная в этом обзоре можно легко комбинируется с Мирна модуляции процедур для проверки роли интерферирующим в EndMT. Настоящий обзор обобщает наши экспериментальные процедуры расследования TGF-β-индуцированной EndMT в клетках MS-1 и также включает в себя сравнение условий EndMT индукции, TGF-β в других эндотелиальных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. индукция EndMT

  1. Поддерживать клетки MS-1 в условиях стандартной культуры и избежать confluency. Источник клеток MS-1 описан в Таблице материалов. Для MS-1 ячеек используйте минимум основных средне α (MEM-α) с 10% плода телячьей сыворотки (FCS), 50 ед/мл пенициллин и 50 мкг/мл стрептомицина.
  2. Вымойте MS-1 клетки на 10 см блюдо с 1 x-фосфатный буфер (PBS) и добавить 1,0 мл трипсина к пластине. Инкубировать в течение 5 минут при 37 ° C.
  3. Отсоедините ячейки, используя 9 мл культуры средств массовой информации. Собирайте суспензию клеток в 15 мл.
  4. Центрифуга суспензию клеток на 300 – 400 x g 5 мин при комнатной температуре.
  5. Тщательно удалить супернатант и приостановить Пелле клеток в подогретым культуры средств массовой информации.
  6. Количество жизнеспособных клеток с помощью Трипановый синий раствор и стандартные Горяева или счетчик автоматический клеток.
  7. Плита MS-1 клетки на немелованной стандартных культуры пластин на 0,5 x 103 клеток на2 см для долгосрочной термин культуры. К примеру плита 5.0 x 103 клеток на хорошо в 6 хорошо культуры пластины. Используйте же культура СМИ, включая такой же концентрации FCS. В MS-1 клеток TGF-β индуцирует EndMT в долгосрочной перспективе культуре (по крайней мере 48-72 ч) с использованием FCS.
  8. Стимулировать эндотелиальных клеток с TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл) после 24 ч.
  9. Культура клетки в увлажненные инкубатора (5% CO2, 37 ° C). Ежедневно контролировать клетки при фокусировке на морфологические изменения.
  10. Замените свежей подогретым культуры носителей, содержащих TGF-β2 после 48 часов лечения с TGF-β в долгосрочной перспективе культуры средств массовой информации.
  11. Перейти к течению анализы. Как правило Даунрегуляция эндотелиальной маркеров и upregulation мезенхимальных маркеров наблюдаются после 48-72 ч лечения с TGF-β, и реорганизации актина наблюдается после 24 часов лечения.

2. иммуноцитохимическое анализ

  1. Сохранить клетки MS-1 в стандартной культуры условиях.
  2. Плита MS-1 клетки на 4 хорошо клетки культуры палата слайды на 1,0 x 103 клеток / колодец (1,7 см2). Слайды предварительно покрытых с желатином. Использование 0,5 – 1,0 мл культуры средств массовой информации за хорошо.
  3. Стимулировать эндотелиальных клеток с TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл) после 24 ч. При анализе участия рок в EndMT, добавьте рок ингибитор Y-27632 (10 мкм) 1 h предварительного лечения TGF-β. При оценке воздействия сигналов торможения TGF-β, может использоваться ингибитора киназы рецепторов TGF-β.
  4. Культура клетки в увлажненные инкубатора (5% CO2, 37 ° C). Реорганизация актина наблюдается в MS-1 клеток после 24 ч лечения с TGF-β. Другие изменения становятся очевидными после 48-72 ч лечения. 72 h культуры замените свежим СМИ, содержащий TGF-β после 48 часов лечения с TGF-β СМИ.
  5. F-актина пятнать
    1. После 24 часов лечения TGF-β удалите СМИ, исправить клетки с параформальдегида 4% в однократном ПБС втечение 20 мин при комнатной температуре и промойте клетки с ПБС.
    2. Проинкубируйте с 0,2% Тритон X-100 5 минут при комнатной температуре.
    3. Промойте клетки три раза с ПБС.
    4. Проинкубируйте с Фаллоидин тетраметилродамина B Изотиоцианаты от бледная поганка, разбавленный 150-fold с блокирующий буфер за 1 ч при комнатной температуре.
    5. Промойте клетки три раза с ПБС.
    6. Пятно ядер с привязки нуклеиновой кислоты цианиновые красители для 5 мин при комнатной температуре.
    7. Промыть слайды и гора coverslips лицом вниз на слайде с помощью слайд монтаж средств массовой информации.
    8. Наблюдения с помощью конфокального микроскопа. Используйте для обнаружения флуоресценции Фаллоидин 543 Нм лазер и фильтр выбросов 560 – 615 Нм. Используйте 633 нм лазер и фильтра выбросов более чем 650 Нм для ядерных пятнать. После лечения с TGF-β будет соблюдаться формирования волокна толщиной стресс.
  6. VE-Кадгерины и пятнать α-SMA
    1. После 72 ч TGF-β лечения, удаления средств массовой информации, исправить клетки с холодной 50% метанола и 50% ацетона (0,5 – 1,0 мл в колодец) за 5 мин.
    2. Промойте клетки три раза с ПБС (0,5 – 1,0 мл в колодец).
    3. Проинкубируйте с первичных антител в блокирующем буфере на ночь при 4 ° C в темноте по данным производителя рекомендуемая концентрация. Использование VE-Кадгерины моноклональных антител (BV13, разведение 1: 100) и конъюгированных Cy3 α-SMA моноклональных антител (1A4, разведение 1: 200)20.
    4. Промойте клетки три раза с ПБС.
    5. Инкубируйте клетки с зеленый краситель конъюгированных вторичное антитело для VE-Кадгерины антитела в блокирующем буфере 1 ч при комнатной температуре в темноте по данным производителя рекомендуемая концентрация.
    6. Промойте клетки три раза с ПБС.
    7. Пятно ядер с привязки нуклеиновой кислоты цианиновые красители для 5 мин при комнатной температуре.
    8. Промыть слайды и гора coverslips лицом вниз на слайде с помощью слайд монтаж средств массовой информации.
    9. Наблюдения с помощью конфокального микроскопа. Используйте для обнаружения α-SMA (Cy3) 543 Нм лазер и фильтр выбросов 560 – 615 Нм. Используйте для обнаружения VE-Кадгерины 488 нм лазер и фильтр выбросов 505 – 550 Нм. Обычно, после обращения с TGF-β лечения, уменьшение VE-Кадгерины сигналов и будет наблюдаться увеличение α-SMA сигналов.

3. трехмерные коллаген гель сужением Assay

  1. Выполняют культуры клеток MS-1 с/без TGF-β за 72 ч до пробирного сужением гель коллагена.
  2. Подготовить тип я гель коллагена на льду. Смесь холодной коллагена раствор, 10 x сосредоточены MEM среднего и коллаген разрежения буфер, содержащий 0,05 N NaOH, 2,2% NaHCO3и 200 мм HEPES рН 7,4 на 8:1:1 соотношение.
  3. Смешайте 200 мл суспензии TGF-β-лечение эндотелиальных клеток (1.0 х 106 клеток/200 мкл) или управления и 800 мкл раствора гель коллагена. TGF-β обработанных образцов, добавить TGF-β2 (1 нг/мл) для суспензии клеток.
  4. Добавить 1,0 мл смеси в каждой скважине 12-ну культуры пластин и позволяют закрепить в инкубаторе при 37 ° C за 30-60 мин.
  5. После желатинизации наложение 1,0 мл MEM-α содержащий 10% FCS, 50 ед/мл пенициллина и стрептомицина 50 мкг/мл до плавать геля. TGF-β обработанных образцов, добавить TGF-β2 (1 нг/мл) в средствах массовой информации.
    Примечание: Для TGF-β обработанных образцов, добавить TGF-β гель и культуры средств массовой информации.
  6. Инкубируйте плавающей гели при 37 ° C в течение 48 часов.
  7. Сканирование изображений Гели от нижней части пластины с помощью сканера. Кроме того записи изображения с помощью цифровой камеры на фиксированном расстоянии выше Гели гели.
  8. Определить площадь поверхности геля на основе числа пикселей с помощью ImageJ. Выберите гель с помощью freehand selection или связанные выбор инструментов, или с использованием геля «изображение | Отрегулируйте | Цветовой порог» инструмент, а затем определить области применения геля «анализ | Мера» команда.

4. ингибирование Мирна мероприятий, основанных на Locked нуклеиновых кислот Мирна ингибиторы

  1. Сохранить клетки MS-1 в стандартной культуры условиях.
  2. Transfect к морю нуклеиновой кислоты (LNA) Мирна ингибиторы, искусственных микроРНК дуплексы или малые интерферирующие РНК (20 или 50 Нм) с использованием реагентов липофекция согласно инструкции производителя. В наших предыдущих докладах26,27были описаны детали и источники Мирна ингибиторы LNA, искусственных микроРНК дуплексы и малые интерферирующие РНК. В MS-1 клетки transfection стандартные процедуры, основанные на инструкции изготовителя хорошо работать для введения LNA Мирна ингибиторы, искусственных микроРНК дуплексы или малые интерферирующие РНК.
  3. После 16-48 h стимулировать эндотелиальных клеток с TGF-β2 (конечная концентрация 1 нг/мл).
  4. Перейти к различных течению анализов, включая анализ выражения (последовательности РНК (РНК seq) анализы и количественного RT-PCR) РНК, иммуноцитохимическое и assay репортера. Вниз по течению анализы были описаны в наших предыдущих докладах20,26,27.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TGF-β является мощным индуктором EndMT в различных эндотелиальных клеток. После лечения в 24 ч с TGF-β в клетках МС-1 пятнать для F-актина показывает реорганизации актина стресс волокон (рис. 1A)20. Предварительной обработки с рок ингибитор Y-27632 подавляет всасывание актина реорганизации20. MS-1 эндотелиальных клеток меняются от классическая морфология булыжник как к мезенхимальных веретеновидной формы морфология после лечения TGF-β (рис. 1B). TGF-β-лечение клетки теряют контакт ячеек. После лечения с TGF-β для 48-72 ч иммуноцитохимическое анализы показывают снижение выражение VE-Кадгерины и увеличение выражение α-SMA (рис. 1 c). TGF-β резко Индуцирует экспрессию α-SMA уровня мРНК и белков в клетках MS-1 после 48-72 ч лечения (цифры 1 d и 1E). У млекопитающих TGF-β включает TGF-β1, 2 и 3 изоформы. Предыдущего исследования, с помощью мыши культивированный эндокарда подушки эксплантов показал, что TGF-β2 но не TGF-β3 является обязательным для преобразования эндокарда подушки клетки28. С другой стороны мы ранее сравнил эффекты трех изоформ на α-SMA выражения и подтвердил, что все изоформ аналогично индуцированную экспрессию α-SMA в MS-1 клетки20. Коллаген гель сужением пробирного показывает расширение сжатие коллагена типа, которую я гель клетками МС-1, после лечения TGF-β (Рисунок 1F). Этот эффект предполагает приобретение потенциала мезенхимальных клеток для того чтобы remodel внеклеточного матрикса. Эти функции являются отличительной черты EndMT20. В наших предыдущих доклада20лечение ингибитором рок Y-27632 сильно подавлены индукции мезенхимальных маркеры α-SMA и SM22α без сопутствующего подавления индукции других генов-мишеней TGF-β например фибронектин 1 и ММП-2.

EndMT представляет собой весьма динамичный процесс. В клетках МС-1 обратимы эффекты TGF-β на α-SMA выражение и морфологии; после лишения TGF-β α-SMA выражение уменьшается базальных уровней (рисунок 2A), и клетки восстановить булыжник как морфология (рис. 2B). Кроме того индукции EndMT и EMT ассоциируется с динамических изменений в секреторную способность несколько chemokines и цитокинов. Несколько воспалительных chemokines и включая CCL17, CX3CL1, CXCL16, цитокинов ИЛ-6 и Angptl2 индуцированных TGF-β в MS-1 клетки, которые мы ранее назначали EndMT связанные секреторной фенотип (EndMT-SP)26. Эта экспериментальная модель полезна для расследования предполагаемого регуляторы EndMT и EndMT-SP. Ранее мы изучили роль несколько интерферирующим в EndMT путем повышения или ингибирования Мирна деятельности26,27. В MS-1 клеток Мирна мероприятия можно надежно модулировать Мирна мимических олигонуклеотиды или ингибиторов на основе LNA Мирна, и несколько ниже по течению анализов, включая анализ РНК seq может быть легко выполнена (рис. 3). Основываясь на анализе интегративной транскриптом, мы ранее связаны конститутивно активных мир-31 с EndMT регулирование в MS-1 клетки26. РНК seq анализ показал что ингибирование мир-31 LNA Мирна ингибитор результаты в затухания индукции мезенхимальных маркеров (Рисунок 3А) и EndMT-SP генов (рис. 3 c), хотя это не влияет на всасывание обычных целевой фонд TGF-β гены фибронектин 1, PAI-1 и Smad7 (рис. 3B) и Даунрегуляция эндотелиальной маркеры (рис. 3D)26. TGF-β и мир-31 помощью Stk40, негативный регулятор NF-κB путь, который действует как потенциального регулятор EndMT-SP. Хотя Фонд TGF-β не увеличивает выражение мир-31, TGF-β индуцирует альтернативные сплайсингу опосредованной исключение внутреннего poly(A) последовательности в Stk40 3' УТР, укрепив тем самым нападения на Stk40 учредительный активных мир-31 и наконец подавления Stk4026. Кроме того мы рассмотрели ранее роли TGF-β-индуцибельной мир 27b в EndMT27. Ингибирование мир-27 подавлены upregulation мезенхимальных маркеров (Рисунок 3А) при воздействии на обычных TGF-β целевых генов, EndMT-SP генов, и эндотелиальных маркеров были маргинальным (цифры 3B, 3 C и 3D)27 .

Figure 1
Рисунок 1 : Индукция EndMT в MS-1 клеток путем TGF-β. (A) актин реорганизации в MS-1 клетки после 24 ч лечения TGF-β2 (1 нг/мл). (B) морфологический изменения в клетках MS-1 после 72 ч лечения TGF-β2 (1 нг/мл). (C) иммуноцитохимическое анализ для VE-Кадгерины и α-SMA в MS-1 клеток после 72 ч лечения TGF-β2 (1 нг/мл). (D, E) Изменения выражения в α-SMA, определяется Стандартный количественный анализ ПЦР-(D) и западной помарки анализа (E). (F) коллагена гель пробирного сужением. Отношение площади поверхности после 72 ч культуры с/без лечения TGF-β2 (1 нг/мл) к исходной поверхности отображаются. Масштаб баров = 20 мкм (A и C) и 200 мкм (B). Данные изменяются от Михира и др. 20. погрешностей представляют стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Обратимые эффекты TGF-β в клетках МС-1. Выражение mRNA α-SMA (A) и (B) морфологии клеток после вывода TGF-β2 в клетках МС-1. Масштаб баров = 200 мкм. Планки погрешностей представляют стандартных отклонений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Анализ РНК seq в клетках МС-1. После введения LNA Мирна ингибиторы и обращения с TGF-β2 (72 ч.) выполненных в26,27был РНК seq анализ. NC: отрицательный контроль. Показаны изменения выражения представитель генов (A, мезенхимальные маркеров; B, обычные TGF-β целевых генов; C, EndMT-SP генов; и D, эндотелиальные маркеров). FPKM (фрагментов на kilobase транскрипт на миллион сопоставленных прочтений) значения были нормализованы значениями контрольной пробы (LNA-NC без лечения TGF-β2). Планки погрешностей представляют стандартных отклонений.

Тип ячейки Состояние мезенхимальных маркер индукции Ссылка
эндотелиальные клетки человека пупочную вену (HUVEC) Индукция средой мезенхимальных дифференциации (TGF-β 5 нг/мл, PDGF-BB 25 нг/мл), 5 – 21 дней. Проектная и др.
кожный микрососудистой эндотелиальных клеток человека (HCMEC) Индукции, TGF-β2 (10 нг/мл), без FBS, 2 дня. Медичи и др.
эндотелиальные клетки человека коронарного (НСЕС) Индукции, TGF-β1 (10 нг/мл), 6 дней. Ингибирование BMP-7. Zeisberg и др.
эндотелиальные клетки мыши легких (ТЗЭТ) Индукции, TGF-β1 (10 нг/мл), сократить до 2% FBS, без эндотелиальной Митоген, 2 дня. Zeisberg и др.
эндотелиальные клетки мозга крысы (BEC) Индукции, TGF-β1 (10 нг/мл), 2 дня. Krizbai и др.
говядину аорты эндотелиальных клеток (КАЭБ) Индукции, TGF-β1 (1 нг/мл), 5 дней. Арсиньегас и др.
увековечен говядину микрососудистой эндотелиальных клеток сетчатки (iBREC) Индукции, TGF-β2 (10 нг/мл), 3 – 6 дней. Deissler и др.
эндотелиальные клетки баранину аортального клапана Индукция TGF-β1 или 3 (1 нг/мл), 6 дней. Параня и др.
Поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши MS-1 Индукции, TGF-β (10 нг/мл), активированный РАН выражение, 1 день. Хасимото и др.
Поджелудочной железы микрососудистой эндотелиальные клетки мыши MS-1 Индукции, TGF-β2 (1 нг/мл), 2-3 дня. Михира и др.

Таблица 1: индукция EndMT TGF-β в различных клетках эндотелия. Кратко излагаются условия культуры EndMT индукции, TGF-β. Также отмечены изменения в условиях культуры, включая концентрацию сыворотки и добавление или удаление других факторов роста.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сообщается, что активированные ран и TGF-β лечения для 24 h индуцированных EndMT в клетках МС-1, в то время как TGF-β только удалось побудить EndMT в этот короткий период21. Последовательно мы наблюдали, что TGF-β существенно индуцированных EndMT после длительного лечения (48-72 ч) в MS-1 клетки20. EndMT неоднократно наблюдалось после длительного лечения с TGF-β (2 – 6 дней) в различных эндотелиальных клеток, таких как человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC), человеческого кожного микрососудистой эндотелиальных клеток (HCMEC), коронарный эндотелиальных клеток человека ( НСЕС), эндотелиальные клетки мыши легких (ТЗЭТ), эндотелиальные клетки мозга крысы (BEC), говядину аорты эндотелиальных клеток (КАЭБ), увековечен говядину микрососудистой эндотелиальные клетки сетчатки (iBREC) и баранину аортального клапана эндотелиальные клетки8, 18,29,30,,3132,,3334. В таблице 1мы кратко условия мезенхимальных маркер индукции, TGF-β в различных эндотелиальных клеток8,18,20,21,29, 30,,3132,,3334. Сравнение этих докладов свидетельствует о том, что каждая линия эндотелиальных клеток имеет различные пороговые значения для EndMT. Дифференциальный чувствительность TGF-β или другие механизмы могут лежать в основе различных патологических состояний, связанных с EndMT в различных органах. Это следует рассматривать вместе с результатами исследований в естественных условиях .

Детали в пробирке EndMT индукции протоколе должны быть адаптированы в различных клеточных линий: например., концентрация TGF-β, концентрации сыворотки, добавление или удаление других факторов роста и культуры периода. К примеру HUVECs часто плохо реагировать TGF-β и EndMT бы индуцированных сочетании с другими факторами, например, PDGF-BB и воспалительных стимулы и/или модуляции сывороточной концентрации и других компонентов среды в более культуры, установив29 , 35. Кроме того, overconfluency бы смягчить ответы TGF-β.

EndMT представляет собой динамичный процесс и противоположный процесс, называемый мезенхимы эндотелиальные перехода (MEndoT) был недавно сообщили36. Хотя индукции мезенхимальных маркеров, TGF-β только является обратимым в клетках МС-1 (рис. 2), было сообщено, что Даунрегуляция эндотелиальной маркеров в ячейках MS-1 с активированной РАН сохраняется после вывода TGF-β21. Необратимых EndMT также сообщалось в iBREC и баранину аортального клапана эндотелиальных клеток33,34. Кроме того предыдущий доклад показал, что процесс EndMT сохраняется после вывода TGF-β из-за постоянной активации рас-GTP и метилирования RASAL1 промоутер в эндотелиальных клеток человека коронарного37. Таким образом сравнение этих моделей может быть также полезно понять механизмы регулирования пластичности эндотелиальных клеток.

Оперативности эндотелиальных клеток к EndMT индукции, как представляется, существенно гетерогенных38. Xiao et al. сообщили, что опухоль – специфичные эндотелиальные клетки из опухоли молочной железы модели показывают различные формы EndMT в ответ на стимуляцию TGF-β38. TGF-β-driven EndMT модулируется также другие сигнальные пути, включая BMP-7 ФБП-2 и ИЛ 1β35,,3738. Мы также обнаружили, что TNF-α повышает TGF-β-индуцированной EndMT и EndMT-SP в MS-1 клетки26. Кроме того это хорошо известно, что EndMT индуцируется других сигнальных путей, включая Wnt, паз и гипоксия1. Таким образом сочетание с другими стимулами в различных эндотелиальных клеток может быть важно понимать неоднородность EndMT реакции.

Протокол EndMT, представленные здесь могут быть легко изменены для расследования регуляторов EndMT. В самом деле мы были характерны различные регуляторы EndMT в MS-1 клетки20,,2627. Фактор обменом нуклеотида гуанина Arhgef5 и myocardin связанных транскрипционный фактор-(MRTF-A) вызванных Smad сигналов, и способствуют upregulation α-SMA в MS-1 клетки20. Таким образом, Фонд TGF-β сигнализации активирует обоих ро сигналов и MRTF-A, чтобы заставить EndMT. Кроме того мы также обнаружили, что конститутивно активных мир-31 и TGF-β-индуцибельной мир 27b положительно регулировать EndMT индукции26,27. В MS-1 клеток конститутивно активных мир-31 необходима также для TGF-β-индуцированной EndMT-СП26. В целом эти в vitro процедуры индукции EndMT будет полезным для понимания биологии EndMT, определение EndMT связанных генов подписей и разработки стратегий для модуляции этот процесс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарим Zea Борок и Kohei Miyazono за предложения по подготовке рукописи. H.I.S. и M.H. поддерживаются Уэхара Мемориальный фонд исследовательских стипендий, и H.I.S. поддерживается Осаму Hayaishi Мемориал стипендии для обучения за рубежом. Эта работа была поддержана грант от фонда науки Такеда (А.С).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42, (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77, (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80, (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12, (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35, (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13, (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125, (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129, (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131, (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498, (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225, (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6, (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67, (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18, (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151, (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43, (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88, (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149, (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9, (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109, (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21, (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161, (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248, (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29, (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437, (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10, (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103, (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18, (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159, (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218, (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514, (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105, (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75, (7), 1244-1254 (2015).
Молекулярный анализ эндотелиальной мезенхимальных перехода, вызванных преобразования сигналов фактор роста β
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter