Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

doi: 10.3791/57577 Published: August 3, 2018

Summary

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Abstract

Endotel hücrelerinin fenotipik plastisite kardiyovasküler sistem geliştirme, kalp-damar hastalıkları ve organ fibrozis ile ilişkili çeşitli koşullar altında yatan. Bu koşullar içinde farklılaştırılmış endotel hücreleri gibi mezenkimal fenotipleri elde etmek. Bu işlem mezenkimal endotel geçiş (EndMT) adı verilir ve downregülasyon endotel işaretleri, upregulation mezenkimal işaretleri ve morfolojik değişiklikler ile karakterizedir. EndMT dönüştürme büyüme faktörü (TGF) de dahil olmak üzere birkaç sinyal yolları tarafından indüklenen-β, Wnt ve çentik ve gastrulasyon, doku fibrozu, epitelyal ve mezenkimal geçiş (EMT) önemli benzer moleküler mekanizmaları tarafından düzenlenir ve kanser metastaz. EndMT mekanizmaları anlama EndMT hedefleme tanı ve tedavi edici yaklaşımlar geliştirmek önemlidir. EndMT vitro sağlam indüksiyon ortak gen ifade imzalar karakterize druggable moleküler mekanizmaları tanımlayıp EndMT modülatörler için ekran yararlıdır. Burada, EndMT indüksiyon için bir vitro yöntemi açıklanmaktadır. MS-1 fare pankreas mikrovasküler endotel hücreler TGF-β uzun süre maruz kaldıktan sonra EndMT geçmesi ve upregulation mezenkimal işaretleri ve morfolojik değişiklikler yanı sıra birden fazla inflamatuar kemokinler ve sitokinler indüksiyon gösterir. MikroRNA (miRNA) modülasyon analizi için yöntemler de yer almaktadır. Bu yöntemleri EndMT ve miRNAs EndMT için katkısını temel mekanizmaları araştırmak için bir platform sağlar.

Introduction

Mezenkimal endotel geçiş (EndMT) tarafından fibroblast benzeri mezenkimal hücre1' kaynaklanan moleküler değişiklikler çeşitli farklı endotel hücre uğrar işlemidir. EndMT başlangıçta bir endotel hücre dönüştürme sırasında kalp2,3gelişimi olarak nitelendirildi. Erken kalp geliştirme, bir iç endokard ve bir dış Miyokardiyum kalbini tüp oluşur. Bu iki kat hücre dışı matriks kardiyak jöle adı verilen bir tabaka tarafından ayrılır. Endotel hücre işaretleri elde, embriyonik endocardial hücreleri mezenkimal hücrelerin içine transit, altta yatan kalp jöle istila ve kardiyak minderler, atriyoventriküler kapaklar ve septum için temel sağlayan oluşumu teşvik ve Semilunar kapaklar. Ayrıca, EndMT kaynaklar perisitlerden ve vasküler düz kas hücreleri embriyonik diğer damar sistemleri Koroner damarları, abdominal aort ve pulmoner arter4,5,6dahil olarak öne sürülmüştür. Buna ek olarak, EndMT fizyolojik anjiogenik7çimlenme karıştığı.

Kanıt biriken EndMT birden fazla kalp-damar hastalıkları ve diğer hastalıklar1,8' de ilgilenmektedir önerdi. EndMT ilişkili koşullar vasküler kalsifikasyon, ateroskleroz, pulmoner arteriyel hipertansiyon, derin malformasyon, organ fibrozis, ven greft remodeling, homogreft disfonksiyon böbrek nakli ve kanser8'yer, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. son raporunda açıklanan birkaç moleküler EndMT işaretleri böbrek nakli17böbrek nakli işlev bozukluğu tanısı ve prognoz tahmini için bir araç olabilir. Kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere birçok hastalığı koşulları iyileştirmek için modülasyon EndMT ilgili hücresel sinyal yollar gösterilmiştir ve damar grefti hayvan remodeling modelleri8,15. Bu nedenle, mekanizmaları anlama temel EndMT EndMT hedefleme tanı ve tedavi stratejileri geliştirmek önemlidir.

EndMT hücre-hücre kavşaklar, göçmen potansiyel artış, VE-cadherin gibi özel endotel genlerin downregülasyon ve α-düz kas aktin (α-SMA) dahil olmak üzere mezenkimal genlerin upregulation kaybı ile karakterizedir. Ayrıca, EndMT ve mezenkimal epitel geçiş (EMT), epitel hücreleri dönüştürür mezenkimal hücreler için benzer bir süreç gelişmesine katkıda bulunabilir çeşitli hücre dışı matriks bileşenlerinin değişmiş üretim ile ilişkili olan doku fibrozu8,19.

Son zamanlarda, EndMT birkaç vitro çalışmalar EndMT15,20moleküler mekanizmaları ayrıntılarını aydınlatılmamıştır. EndMT dönüştürme büyüme faktörü (TGF) de dahil olmak üzere çeşitli sinyal yolları tarafından indüklenen-β, Wnt ve çentik1. Bunlar arasında TGF-β EMT ve EndMT indüksiyon çok önemli rol oynar. Kısa maruz kalma yetersiz21gibi görünüyor iken EndMT içinde EndMT çeşitli endotel hücrelerinde sonuçlarında TGF-β maruz uzun. Biz burada EndMT indüksiyon, hangi mil SVEN 1 (MS-1) fare pankreas mikrovasküler endotel hücreleri TGF-β20uzun süreli maruz kaldıktan sonra EndMT vitro geçmesi için basit bir protokol nitelendirdi. Bu modelde, EndMT morfolojik değişiklikler, downregülasyon endotel işaretleri, upregulation mezenkimal işaretleri ve inflamatuar genler, hücre iskeleti de dahil olmak üzere, hallmark özelliklerini araştırmak için birden çok aşağı akım analizleri yapılabilir düzenlemeler ve kollajen jel kasılma.

MikroRNA (miRNAs) ~ 22 olan nt çeşitli mRNA hedefleri22,23posttranscriptional baskı doğrudan küçük düzenlemesinde. Tohum Serisi-aracılı hedef tanıma, miRNAs hedef genlerin yüzlerce bastırmak ve hücre farklılaşması, yayılması ve motilite gibi çeşitli hücresel fonksiyonları modüle. Bu da EMT ve EndMT düzenlemesine yönelik olgusu ve birkaç miRNAs EMT ve EndMT24,25düzenleyiciler bildirilmiştir. Bu derlemede sunulan EndMT modeli kolayca miRNAs rolleri EndMT içinde test etmek için miRNA modülasyon yordamlar ile kombine edilebilir. Mevcut İnceleme TGF-β-indüklenen EndMT MS-1 hücrelerdeki araştırmak için deneysel prosedürlerimiz özetler ve karşılaştırma EndMT indüksiyon TGF-β tarafından koşullarının diğer endotel hücrelerinde de içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indüksiyon EndMT

  1. MS-1 Standart kültür koşulları hücrelerde korumak ve confluency kaçının. MS-1 hücre bir kaynak Tablo reçetesiaçıklanmıştır. MS-1 hücreler için en az gerekli orta-α (MEM-α) % 10 fetal buzağı serum (FCS), 50 U/mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin ile kullanın.
  2. 10 cm hücrelerdeyse yıkama MS-1 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x ile bulaşık ve tripsin 1.0 mL plaka ekleyin. 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
  3. Kültür ortamının 9 mL kullanarak hücre bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon 15 mL tüp içinde toplamak.
  4. 300-400 x g oda sıcaklığında 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
  5. Dikkatle süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet önceden ısıtılmış kültür medyada askıya alma.
  6. Trypan mavi çözüm ve standart bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak canlı hücreleri hesaplama.
  7. 0,5 cm2 uzun vadeli kültür için başına 103 hücre x, kaplamasız standart kültür plakalar üzerine plaka MS-1 hücreleri. Örneğin, bir 6 bir kuyu başına plaka 5.0 x 103 hücreleri de plaka kültür. FCS aynı konsantrasyonu da dahil olmak üzere aynı kültür ortamı kullanın. MS-1 hücrelerde, TGF-β EndMT FCS kullanımı ile uzun vadeli Kültür (en az 48-72 h) neden olmaktadır.
  8. TGF-B2 (bir son konsantrasyonu 1 ng/ml) ile endotel hücreleri 24 h sonra teşvik.
  9. Kültür hücreleri oksijen kuluçka (%5 CO2, 37 ° C). Hücreleri her gün morfolojik değişiklikler üzerinde netleme yaparken izlemek.
  10. Taze önceden ısıtılmış kültür TGF-β ile tedavisinde uzun süreli kültür 48 saat sonra TGF-B2 içeren medya ile ortamı değiştirin.
  11. Aşağı akım analizleri için devam edin. Genellikle, aktin reorganizasyon sonra 24 saat tedavi görülmektedir ve downregülasyon endotel işaretleri ve upregulation mezenkimal işaretlerinin gözlenen TGF-β ile tedavi 48-72 saat sonra.

2. Immunocytochemical Analizi

  1. MS-1 Standart kültür koşulları hücrelerde korumak.
  2. Plaka MS-1 hücreleri üzerine 4 kültür odası slaytlar 1.0 x 103 hücre başına iyi (1,7 cm2)'de de hücre. Slaytlar önceden jelatin ile kaplı bulunmaktadır. Kültür ortamı Yani başına kullanım 0.5-1.0 mL.
  3. TGF-B2 (bir son konsantrasyonu 1 ng/ml) ile endotel hücreleri 24 h sonra teşvik. EndMT ROCK katılımı analiz ederken, bir ROCK inhibitörü Y-27632 (10 mikron) 1 h önceden TGF-β tedavi için ekleyin. TGF-β sinyal inhibisyon etkisini değerlendirirken, TGF-β reseptör kinaz inhibitörleri kullanılabilir.
  4. Kültür hücreleri oksijen kuluçka (%5 CO2, 37 ° C). Aktin reorganizasyon MS-1 hücreler TGF-β ile tedavinin 24 saat sonra görülmektedir. Diğer değişiklikler tedavi 48-72 saat sonra belli olur. 72 h kültür için tedavi TGF-β ile 48 saat sonra TGF-β içeren taze medya ile ortamı değiştirin.
  5. F-aktin boyama
    1. 24 h TGF-β tedavi sonra medyayı çıkarın, 1 x PBS için oda sıcaklığında 20 dakika içinde %4 paraformaldehyde ile hücreleri tamir ve 1 x PBS hücrelerle durulayın.
    2. %0,2 ile Triton X-100 oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    3. Hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın.
    4. Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate 150-fold seyreltilmiş Amanita phalloides dan ile kuluçkaya oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabellek ile.
    5. Hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın.
    6. Oda sıcaklığında 5 min için siyanür nükleik asit bağlama boyar maddeler ile çekirdeği leke.
    7. Durulama slaytlar ve mount coverslips ortam takma slayt kullanarak bir slaytta Yüzükoyun yat.
    8. Confocal mikroskop gözlemlemek. 543 nm lazer ve bir emisyon filtresi 560-615 nm phalloidin floresan algılaması için kullanabilir. 633 nm lazer ve 650 uzun bir emisyon filtresi kullanmak nm nükleer boyama için. TGF-β ile tedavi kalın stres lifleri oluşumu gözlenen.
  6. VE-cadherin ve α-SMA boyama
    1. 72 h TGF-β tedavi sonra medyayı çıkarın, soğuk % 50 metanol ve % 50 aseton ile hücreleri tamir (0.5-1.0 mL iyi başına) 5 min için.
    2. Hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın (0.5-1.0 mL iyi başına).
    3. Gecede 4 ° C'de üreticinin tavsiye edilen konsantrasyon göre karanlıkta engelleme arabellekte birincil antikorlar ile kuluçkaya. Kullanım VE-cadherin monoklonal antikor (BV13, 1: 100 seyreltme) ve Cy3-Birleşik α-SMA monoklonal antikor (1A4, 1: 200 seyreltme)20.
    4. Hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın.
    5. Bir yeşil boya Birleşik ikincil antikor VE-cadherin antikor üreticinin tavsiye edilen konsantrasyon göre karanlık oda sıcaklığında 1 h için engelleme arabelleği için hücrelerle kuluçkaya.
    6. Hücreleri üç kez 1 x PBS ile yıkayın.
    7. Oda sıcaklığında 5 min için siyanür nükleik asit bağlama boyar maddeler ile çekirdeği leke.
    8. Durulama slaytlar ve mount coverslips ortam takma slayt kullanarak bir slaytta Yüzükoyun yat.
    9. Confocal mikroskop gözlemlemek. 543 nm lazer ve bir emisyon filtresi 560-615 nm α-SMA (Cy3) algılaması için kullanabilir. 488 nm lazer ve bir emisyon filtresi 505-550 nm VE-cadherin algılaması için kullanabilir. Genellikle, TGF-β tedavi ile tedavi VE-cadherin sinyalleri azaltmak ve α-SMA sinyalleri artış gözlendi.

3. üç boyutlu kollajen jel daralma tahlil

  1. Kültür MS-1 hücre olan/olmayan TGF-β kollajen jel daralma tahlil önce 72 h için gerçekleştirin.
  2. Türü hazırlamak ben kollajen jel buz üzerinde. Mix soğuk kollajen çözüm, 10 x konsantre MEM orta ve kollajen seyreltme arabellek içeren 0,05 N NaOH, %2,2 NaHCO3ve 200 mM HEPES pH 7.4 bir 8:1:1 oranı.
  3. Denetim veya endotel hücre TGF-β-tedavi süspansiyonlar (1.0 x 106 hücreler/200 μL) 200 mL ve kollajen jel çözüm 800 μl karıştırın. TGF-β için tedavi örnekleri, TGF-B2 ekleyin (1 ng/mL) hücre süspansiyon için.
  4. 12-şey kültür plakaları her şey için 1.0 mL karışımı ekleyin ve 37 ° C'de kuluçka için 30-60 dk kuvvetlendirmek için.
  5. Gelatinization sonra MEM-%10 FCS, 50 U/mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin içeren jel float için α 1.0 mL yerleşimi. TGF-β için tedavi örnekleri, TGF-B2 ekleyin (1 ng/mL) medya.
    Not: TGF-β tedavi örnekleri için TGF-β jel ve Kültür medya için ekleyin.
  6. 48 h 37 ° C'de kayan jelleri kuluçkaya.
  7. Jelleri alt plakaların bir tarayıcı kullanarak resimleri tarayın. Alternatif olarak, jeller üzerinde sabit bir mesafede bir dijital kamera ile jelleri görüntülerini kaydedin.
  8. ImageJ kullanarak piksel sayısı temelinde jel yüzey alanı ölçmek. Serbest bir seçim veya ilgili seçim araçlarını kullanarak jel veya jel kullanarak seçin "görüntü | Ayarlamak | Renk eşiği"aracı ve jel kullanarak alan belirlemek" Analyze | Ölçü birimi"komutu.

4. miRNA faaliyetleri kilitli nükleik asit tabanlı miRNA inhibitörleri tarafından inhibisyonu

  1. MS-1 Standart kültür koşulları hücrelerde korumak.
  2. Kilitli nükleik asit (LNA) miRNA inhibitörleri, sentetik miRNA Dubleks veya üreticinin yönerge göre lipofection reaktifler kullanarak çift (20-50 nM) transfect. Ayrıntılar ve LNA miRNA inhibitörleri, sentetik miRNA dubleks ve çift kaynakları bizim önceki raporlar26,27tarif edildi. MS-1 hücrelerde de LNA miRNA inhibitörleri, sentetik miRNA Dubleks veya çift giriş için üreticinin eğitimi temel standart transfection yordamlar çalışır.
  3. Sonra 16-48 h, TGF-B2 (bir son konsantrasyonu 1 ng/ml) ile endotel hücreleri uyarmak.
  4. RNA ifade analizi (kantitatif RT-PCR ve RNA-sıralama (RNA-seq) analizleri), immunocytochemical analiz ve muhabir tahlil de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akım analizleri için devam edin. Aşağı akım analizleri bizim önceki raporlar20,26,27tarif edilmistir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TGF-β çeşitli endotel hücrelerinde EndMT güçlü bir uyarıcı olduğunu. TGF-β MS-1 hücrelerdeki ile 24 h tedaviden sonra F-aktin için boyama aktin stres lifleri (Şekil 1A)20düzenlenmesi gösterir. Önarıtma ROCK inhibitörü Y-27632 ile aktin yeniden yapılanma20indüksiyon engeller. MS-1 endotel hücreleri mezenkimal seklinde morfoloji TGF-β tedavi (Şekil 1B) üzerine klasik bir Arnavut kaldırımlı benzeri morfoloji değiştirin. Hücreler TGF-β-tedavi hücre-hücre kaybetmek. 48-72 saat için TGF-β ile tedaviden sonra immunocytochemical analizleri VE-cadherin azalmış ifade ve α-SMA (Şekil 1 c) artan ifade gösterir. TGF-β α-SMA MS-1 hücrelerinde mRNA ve protein düzeylerinde ifade (rakamlar 1 d ve 1E) 48-72 saat sonra büyük ölçüde indükler. Memeli TGF-β içerir TGF-β1, 2 ve 3 izoformlarının. Kültürlü fare endocardial yastık explants kullanarak bir önceki çalışma TGF-B2 ama değil TGF-β3 endocardial yastık hücreleri28dönüştürme için zorunlu olduğunu göstermiştir. Öte yandan, biz daha önce α-SMA ifade üç izoformlarının etkileri karşılaştırıldığında ve tüm izoformlarının benzer şekilde MS-1 hücreleri20ifadede α-SMA indüklenen doğruladı. Kollajen jel daralma tahlil TGF-β tedavi (Şekil 1F) aşağıdaki MS-1 hücreleri tarafından jel kollajen türü gelişmiş kasılma gösterir. Bu etkiyi mezenkimal hücre kapasitesi hücre dışı matriks yeni model edinimi öneriyor. Bu özellikler EndMT20hallmark özellikleri vardır. Bizim önceki rapor20yılında ROCK inhibitörü Y-27632 ile tedavi güçlü mezenkimal işaretleri α-SMA ve SM22α indüksiyon indüksiyon fibronektin 1 ve MMP-2 gibi diğer TGF-β hedef genlerin eşlik eden bastırılması olmadan bastırılır.

EndMT son derece dinamik bir süreçtir. MS-1 hücrelerde, α-SMA ifade ve morfoloji TGF-β etkileri tersine çevrilebilir; TGF-β yoksunluğu sonra α-SMA ifade azalır bazal düzeyleri (Şekil 2A) ve hücreleri bir Arnavut kaldırımlı benzeri morfoloji (Şekil 2B) yeniden elde etmek. Ayrıca, EndMT ve EMT indüksiyon dinamik değişiklikleri birden çok kemokinler ve sitokinler salgı kapasitesi ile ilişkilidir. Birden fazla inflamatuar kemokinler ve sitokinler de dahil olmak üzere CCL17, CX3CL1, CXCL16, IL-6 ve Angptl2 TGF-β biz önceden belirlenmiş salgı fenotip (EndMT-SP) EndMT ilişkili26MS-1 hücrelerdeki tarafından indüklenen. Bu deneysel model EndMT ve EndMT-SP. sözde düzenleyiciler araştırmak yararlıdır Biz daha önce birkaç miRNAs EndMT rolleri artırılması veya miRNA faaliyetleri26,27inhibe inceledik. MS-1 hücrelerdeki miRNA faaliyetleri sağlam miRNA kopyalama oligonucleotides veya LNA tabanlı miRNA inhibitörleri tarafından modüle ve dahil olmak üzere RNA-seq analiz-ebilmek var olmak kolayca birden çok akış aşağı deneyleri (resim 3) uygulandı. Bütünleştirici transcriptome analize dayalı, biz daha önce yapısal etkin miR-31 EndMT MS-1 hücreleri26Yönetmelikte için bağlantılı. Bu geleneksel TGF-β hedef indüksiyon etkilemez LNA miRNA inhibitörü sonuçlarında mezenkimal işaretleri (Şekil 3A) ve EndMT-SP genler (Şekil 3 c) tarafından zayıflama indüksiyon miR-31 o inhibisyonu RNA-seq analiz gösterdi Fibronektin 1, PAI-1 ve Smad7 gibi genlerin (Şekil 3B) ve downregülasyon endotel işaretleri (şekil 3D)26. TGF-β ve miR-31 tümleyici Stk40, EndMT-SP. potansiyel bir düzenleyici gibi davranır NF-κB yolu negatif bir regülatör Her ne kadar TGF-β miR-31 ifade artırmaz, TGF-β Stk40 iç poli(a) sırayla 3' UTR, böylece Stk40 bünye etkin miR-31 ve son olarak baskılayarak tarafından hedefleme geliştirme alternatif Poliadenilasyon aracılı dışlanması neden olmaktadır Stk4026. Ayrıca, daha önce TGF-β-indüklenebilir miR-27b EndMT27' deki rolleri inceledi. MiR-27 inhibisyonu geleneksel TGF-β hedef genlerin, EndMT-SP genler, üzerindeki etkileri ise upregulation (3A rakam) mezenkimal işaretlerinin bastırılır ve endotel işaretleri marjinal (rakamlar 3B, 3 C ve 3D)27 .

Figure 1
Resim 1 : EndMT MS-1 indüksiyon hücreler TGF-β tarafından. (A)MS-1 aktin reorganizasyon hücreler TGF-B2 tedavi (1 ng/mL) 24 saat sonra. (B) Morphological MS-1 hücreler TGF-B2 tedavi (1 ng/mL) 72 h sonra değiştirir. (C) Immunocytochemical VE-cadherin ve α-SMA MS-1 hücreler TGF-B2 tedavi (1 ng/mL) 72 h sonra inceliyor. (D, E) α-SMA, standart kantitatif RT-PCR analiz (D) ve Batı tarafından belirlenen ifade değişiklikleri analiz (E) leke. (F) kolajen daralma tahlil jel. 72 h kültür olan/olmayan TGF-B2 tedavi (1 ng/mL) orijinal yüzeye sonra yüzey alanı oranında görüntülenir. Ölçek çubukları 20 mikron (A ve C) ve 200 mikron (B) =. Rakamlar Mihira ve ark. değiştirilir 20. hata çubukları temsil eden standart sapmalar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Geri dönüşümlü TGF-β MS-1 hücrelerdeki etkileri. (A)α-SMA mRNA ifade ve (B) hücre morfolojisi TGF-B2 MS-1 hücrelerdeki çekilmesinden sonra. Ölçek Bar = 200 mikron. Hata çubukları standart sapmalar gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : RNA-seq analiz MS-1 hücrelerdeki. Sonra giriş LNA miRNA inhibitörleri ve TGF-B2 (72 h) ile tedavi, RNA-seq Analizi gerçekleştirilen26,27oldu. NC: negatif kontrol. Temsilcisi genlerin ifade değişiklikler (A, mezenkimal işaretleri; gösterilir B, geleneksel TGF-β hedef genlerin; C, EndMT-SP genler; ve D, endotel işaretleri) FPKM (transkript milyon eşlenen okuma başına kilobaz başına parça) değerleri denetim örneği (TGF-B2 tedavi olmadan LNA-NC) değerleri normalleştirilmiş. Hata çubukları standart sapmalar gösterir.

Hücre tipi Koşul mezenkimal marker indüksiyon Başvuru
insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC) İndüksiyon mezenkimal farklılaşma Orta (TGF-β 5 ng/mL, PDGF-BB 25 ng/mL), 5-21 gün. Krenning vd.
insan kutanöz mikrovasküler endotel hücreleri (HCMEC) İndüksiyon TGF-B2 tarafından (10 ng/mL), FBS, 2 gün olmadan. Medici vd.
insan koroner endotel hücreleri (HCEC) İndüksiyon TGF-β1 tarafından (10 ng/mL), 6 gün. İnhibisyon BMP-7 tarafından. Zeisberg vd.
fare akciğer endotel hücreleri (MLEC) İndüksiyon TGF-β1 tarafından (10 ng/mL), % 2'ye azaltmak FBS, endotel mitojenle, 2 gün olmadan. Zeisberg ve ark.
sıçan beyin endotel hücreleri (BEC) İndüksiyon TGF-β1 tarafından (10 ng/mL), 2 gün. Krizbai vd.
sığır aort endotel hücreleri (BAEC) İndüksiyon TGF-β1 tarafından (1 ng/mL), 5 gün. Arciniegas vd.
ölümsüzleştirdi sığır Retina mikrovasküler endotel hücreleri (iBREC) İndüksiyon TGF-B2 tarafından (10 ng/mL), 3-6 gün. Deissler vd.
ovine aort endotel hücreleri İndüksiyon TGF-β1 veya 3 (1 ng/mL), 6 gün. Paranya vd.
MS-1 fare pankreas mikrovasküler endotel hücreleri İndüksiyon TGF-β tarafından (10 ng/mL), etkin Ras ifade, 1 gün. Hashimoto vd.
MS-1 fare pankreas mikrovasküler endotel hücreleri İndüksiyon TGF-B2 tarafından (1 ng/mL), 2-3 gün. Mihira vd.

Tablo 1: EndMT tarafından TGF - indüksiyonβ çeşitli endotel hücrelerinde. Kültür koşulları EndMT indüksiyon TGF-β tarafından özetlenmiştir. Serum konsantrasyonu ve alanlarının eklenmesini ve kaldırılmasını diğer büyüme faktörleri de dahil olmak üzere kültür koşullarında değişiklik Ayrıca belirtilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

TGF-β yalnız EndMT bu kısa dönem21' ikna etmek başarısız iken 24 h için etkin Ras ve TGF-β tedavi EndMT MS-1 hücrelerdeki indüklenen bildirilmiştir. Sürekli olarak, TGF-β önemli ölçüde EndMT sonra uzun tedavi (48-72 h) MS-1 hücreleri20dakika sonra indüklenen görülmektedir. Sonra uzun süreli tedavi ile TGF-β (2-6 gün) insan göbek gibi çeşitli endotel hücrelerinde damar endotel hücreleri (HUVEC), insan kutanöz mikrovasküler endotel hücreleri (HCMEC), insan koroner endotel hücre (EndMT defalarca görülmüştür HCEC), fare akciğer endotel hücreleri (MLEC), sıçan beyin endotel hücreleri (BEC), sığır aort endotel hücreleri (BAEC), ölümsüzleştirdi sığır Retina mikrovasküler endotel hücrelerinin (iBREC) ve ovine aortik valf endotel hücreleri8, 18,29,30,31,32,33,34. Tablo 1' de, biz mezenkimal marker indüksiyon TGF-β tarafından çeşitli endotel hücreleri8,18,20,21,29şartları özetlenebilir, 30,31,32,33,34. Bu raporların karşılaştırılması her endotel hücre kültürünü EndMT için farklı eşikler sahip olduğunu göstermektedir. TGF-β veya diğer mekanizmaları fark duyarlılık EndMT ile ilgili çeşitli patolojik koşulları farklı organlarda altında yatan. Bu in vivo çalışmalar sonuçları ile birlikte düşünülmelidir.

Vitro EndMT indüksiyon protokolü ayrıntılarını farklı hücre hatlarında uygun gerekir: Örneğin., TGF-β, serum, ekleme ya da kaldırma diğer büyüme faktörleri ve kültür dönemi konsantrasyonu konsantrasyonu. Örneğin, HUVECs genellikle kötü TGF-β için yanıt ve EndMT PDGF-BB ve inflamatuar uyaranlara gibi diğer faktörler ile birlikte ve/veya serum konsantrasyonu ve diğer orta bileşenlerinin29 ayarlama daha uzun bir kültür modülasyon tarafından indüklenen , 35. Buna ek olarak, overconfluency TGF-β yanıtlarını azaltmak.

EndMT dinamik bir süreçtir ve endotel mezenkimal geçiş (MEndoT) adı verilen bir ters işlem son zamanlarda bildirilen36oldu. İndüksiyon TGF-β yalnız tarafından mezenkimal işaretlerinin MS-1 hücreleri (Şekil 2) tersine çevrilebilir iken bildirilmiştir o downregülasyon etkin Ras ile MS-1 hücreler endotel işaretlerinin TGF-β21çekilme sonra kalıcı. Geri dönüşü olmayan EndMT da iBREC ve ovine aort endotel hücreleri33,34bildirilmiştir. Ayrıca, önceki bir rapor EndMT işleminin TGF-β geri çekilmesi nedeniyle Ras-GTP sürekli aktivasyonu ve insan koroner endotel hücreleri37RASAL1 düzenleyicinin metilasyonu sonra kalıcı gösterdi. Bu nedenle, karşılaştırma bu modellerin de endotel hücre plastisite düzenleyici mekanizmaları anlamak yararlı olabilir.

Yanıt EndMT indüksiyon için endotel hücrelerinin önemli ölçüde heterojen38gibi görünüyor. Xiao vd. tümör özgü endotel hücreleri bir meme tümör modelinden TGF-β stimülasyon38yanıt EndMT farklı formları gösterir bildirdi. TGF-β-driven EndMT da FGF-2, BMP-7 ve IL-1β35,37,38de dahil olmak üzere diğer sinyal yolları tarafından modüle. Ayrıca TNF-α TGF-β-indüklenen EndMT geliştirir ve EndMT-SP MS-126hücreleri bulduk. Ayrıca, iyi EndMT Wnt, çentik ve hipoksi1de dahil olmak üzere diğer sinyal yolları tarafından indüklenen olduğu bilinmektedir. Böylece, diğer uyaranların çeşitli endotel hücreleri ile birlikte heterojen EndMT yanıt verme hızını anlamak önemli olabilir.

Burada sunulan EndMT protokol EndMT düzenleyiciler araştırmak için kolayca değiştirilebilir. Aslında, EndMT MS-1 hücreleri20,26,27' deki çeşitli düzenleyiciler nitelendirmiştir. Bir guanin nükleotid değişim faktörü Arhgef5 ve myocardin ile ilgili transkripsiyon faktörü-A (MRTF-A) Smad sinyalleri tarafından indüklenen vardır ve her ikisi de α-SMA upregulation MS-1 hücreleri20katkıda. Böylece, TGF-β sinyal her iki Rho sinyali etkinleştirir ve MRTF-A EndMT ikna etmek için. Buna ek olarak, ayrıca yapısal etkin miR-31 ve TGF-β-indüklenebilir miR-27b olumlu EndMT indüksiyon26,27düzenleyen bulduk. MS-1 hücrelerinde yapısal etkin miR-31 TGF-β-indüklenen EndMT-SP26için gereklidir. Genel olarak, bu vitro EndMT indüksiyon yordamları EndMT biyoloji anlama, gen EndMT ilişkili imzaları belirlenmesi ve bu işlem modüle stratejileri geliştirmek için yararlı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz Zea Borok ve Kohei Miyazono el yazması hazırlanmasında öneriler için teşekkür ederiz. H.I.S. ve M.H. Uehara Memorial Vakfı Araştırma Bursu tarafından desteklenir ve HIS Osamu Hayaishi Memorial bursu tarafından yurtdışında eğitim için desteklenir. Bu eser bir hibe Takeda Bilim Vakfı (A.S.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MS-1 cells American Type Culture Collection CRL-2279
MEM-alpha Thermo Fisher Scientific 32571036
TGF-beta2 R&D 302-B2-002
4 well Lab-Tek II Chamber Slide Thermo Fisher Scientific 154526
Y-27632  Sigma-Aldrich Y0503
Blocking One nacalai tesque 03953-95
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich P1951
TOTO-3 iodide Thermo Fisher Scientific T3604
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) Thermo Fisher Scientific 14-1441-82
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) Sigma-Aldrich C6198
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Thermo Fisher Scientific A-11001
Cover slip Thermo Fisher Scientific 174934
Collagen solution Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
Collagen dilution buffer Nitta gelatin Inc. Cellmatrix I-P
LNA miRNA inhibitor EXIQON  miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA)
synthetic miRNA duplex Qiagen  miScript miRNA Mimic
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778030
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668027

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry. Developmental Dynamics. (2017).
  2. Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. Structural analysis of endocardial cytodifferentiation. Developmental Biology. 42, (1), 160-180 (1975).
  3. Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis. Circulation Research. 77, (1), 1-6 (1995).
  4. Chen, Q., et al. Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells. Nature Communications. 7, 12422 (2016).
  5. DeRuiter, M. C., et al. Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro. Circulation Research. 80, (4), 444-451 (1997).
  6. Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development. Endothelium. 12, (4), 193-200 (2005).
  7. Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35, (2), 303-308 (2015).
  8. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13, (8), 952-961 (2007).
  9. Chen, P. Y., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression. Journal of Clinical Investigation. 125, (12), 4514-4528 (2015).
  10. Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification. Atherosclerosis. 124-127 (2016).
  11. Qiao, L., et al. Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension. Circulation. 129, (6), 692-703 (2014).
  12. Ranchoux, B., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131, (11), 1006-1018 (2015).
  13. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498, (7455), 492-496 (2013).
  14. Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis. Journal of Cell Physiology. 225, (3), 631-637 (2010).
  15. Cooley, B. C., et al. TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling. Science Translational Medicine. 6, (227), 227ra234 (2014).
  16. Wang, Z., et al. Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction. Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).
  17. Xu-Dubois, Y. C., et al. Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients. Journal of the American Society of Nephrology. 27, (1), 324-332 (2016).
  18. Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts. Cancer Research. 67, (21), 10123-10128 (2007).
  19. Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 18, (10), (2017).
  20. Mihira, H., et al. TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A. Journal of Biochemistry. 151, (2), 145-156 (2012).
  21. Hashimoto, N., et al. Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43, (2), 161-172 (2010).
  22. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway. Journal of Molecular Medicine (Berl). 88, (11), 1085-1094 (2010).
  23. Suzuki, H. I., Miyazono, K. Emerging complexity of microRNA generation cascades. Journal of Biochemistry. 149, (1), 15-25 (2011).
  24. Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases. Nature Reviews Cancer. 9, (4), 293-302 (2009).
  25. Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production. Circulation Research. 109, (6), 649-657 (2011).
  26. Katsura, A., et al. MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta. Genes Cells. 21, (1), 99-116 (2016).
  27. Suzuki, H. I., et al. Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27. Journal of Biochemistry. 161, (5), 417-420 (2017).
  28. Camenisch, T. D., et al. Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis. Developmental Biology. 248, (1), 170-181 (2002).
  29. Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices. Biomaterials. 29, (27), 3703-3711 (2008).
  30. Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling. Biochemical Journal. 437, (3), 515-520 (2011).
  31. Krizbai, I. A., et al. Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation. PLoS One. 10, (3), e0119655 (2015).
  32. Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro. Journal of Cell Science. 103, (Pt 2), 521-529 (1992).
  33. Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells. International Journal of Molecular Medicine. 18, (4), 577-582 (2006).
  34. Paranya, G., et al. Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro. American Journal of Pathology. 159, (4), 1335-1343 (2001).
  35. Maleszewska, M., et al. IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner. Immunobiology. 218, (4), 443-454 (2013).
  36. Ubil, E., et al. Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization. Nature. 514, (7524), 585-590 (2014).
  37. Xu, X., et al. Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis. Cardiovasc Research. 105, (3), 279-291 (2015).
  38. Xiao, L., et al. Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition. Cancer Research. 75, (7), 1244-1254 (2015).
Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).More

Suzuki, H. I., Horie, M., Mihira, H., Saito, A. Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-β Signaling. J. Vis. Exp. (138), e57577, doi:10.3791/57577 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter