Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.
Endotel hücrelerinin fenotipik plastisite kardiyovasküler sistem geliştirme, kalp-damar hastalıkları ve organ fibrozis ile ilişkili çeşitli koşullar altında yatan. Bu koşullar içinde farklılaştırılmış endotel hücreleri gibi mezenkimal fenotipleri elde etmek. Bu işlem mezenkimal endotel geçiş (EndMT) adı verilir ve downregülasyon endotel işaretleri, upregulation mezenkimal işaretleri ve morfolojik değişiklikler ile karakterizedir. EndMT dönüştürme büyüme faktörü (TGF) de dahil olmak üzere birkaç sinyal yolları tarafından indüklenen-β, Wnt ve çentik ve gastrulasyon, doku fibrozu, epitelyal ve mezenkimal geçiş (EMT) önemli benzer moleküler mekanizmaları tarafından düzenlenir ve kanser metastaz. EndMT mekanizmaları anlama EndMT hedefleme tanı ve tedavi edici yaklaşımlar geliştirmek önemlidir. EndMT vitro sağlam indüksiyon ortak gen ifade imzalar karakterize druggable moleküler mekanizmaları tanımlayıp EndMT modülatörler için ekran yararlıdır. Burada, EndMT indüksiyon için bir vitro yöntemi açıklanmaktadır. MS-1 fare pankreas mikrovasküler endotel hücreler TGF-β uzun süre maruz kaldıktan sonra EndMT geçmesi ve upregulation mezenkimal işaretleri ve morfolojik değişiklikler yanı sıra birden fazla inflamatuar kemokinler ve sitokinler indüksiyon gösterir. MikroRNA (miRNA) modülasyon analizi için yöntemler de yer almaktadır. Bu yöntemleri EndMT ve miRNAs EndMT için katkısını temel mekanizmaları araştırmak için bir platform sağlar.
Mezenkimal endotel geçiş (EndMT) tarafından fibroblast benzeri mezenkimal hücre1‘ kaynaklanan moleküler değişiklikler çeşitli farklı endotel hücre uğrar işlemidir. EndMT başlangıçta bir endotel hücre dönüştürme sırasında kalp2,3gelişimi olarak nitelendirildi. Erken kalp geliştirme, bir iç endokard ve bir dış Miyokardiyum kalbini tüp oluşur. Bu iki kat hücre dışı matriks kardiyak jöle adı verilen bir tabaka tarafından ayrılır. Endotel hücre işaretleri elde, embriyonik endocardial hücreleri mezenkimal hücrelerin içine transit, altta yatan kalp jöle istila ve kardiyak minderler, atriyoventriküler kapaklar ve septum için temel sağlayan oluşumu teşvik ve Semilunar kapaklar. Ayrıca, EndMT kaynaklar perisitlerden ve vasküler düz kas hücreleri embriyonik diğer damar sistemleri Koroner damarları, abdominal aort ve pulmoner arter4,5,6dahil olarak öne sürülmüştür. Buna ek olarak, EndMT fizyolojik anjiogenik7çimlenme karıştığı.
Kanıt biriken EndMT birden fazla kalp-damar hastalıkları ve diğer hastalıklar1,8‘ de ilgilenmektedir önerdi. EndMT ilişkili koşullar vasküler kalsifikasyon, ateroskleroz, pulmoner arteriyel hipertansiyon, derin malformasyon, organ fibrozis, ven greft remodeling, homogreft disfonksiyon böbrek nakli ve kanser8‘yer, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. son raporunda açıklanan birkaç moleküler EndMT işaretleri böbrek nakli17böbrek nakli işlev bozukluğu tanısı ve prognoz tahmini için bir araç olabilir. Kardiyak fibrozis de dahil olmak üzere birçok hastalığı koşulları iyileştirmek için modülasyon EndMT ilgili hücresel sinyal yollar gösterilmiştir ve damar grefti hayvan remodeling modelleri8,15. Bu nedenle, mekanizmaları anlama temel EndMT EndMT hedefleme tanı ve tedavi stratejileri geliştirmek önemlidir.
EndMT hücre-hücre kavşaklar, göçmen potansiyel artış, VE-cadherin gibi özel endotel genlerin downregülasyon ve α-düz kas aktin (α-SMA) dahil olmak üzere mezenkimal genlerin upregulation kaybı ile karakterizedir. Ayrıca, EndMT ve mezenkimal epitel geçiş (EMT), epitel hücreleri dönüştürür mezenkimal hücreler için benzer bir süreç gelişmesine katkıda bulunabilir çeşitli hücre dışı matriks bileşenlerinin değişmiş üretim ile ilişkili olan doku fibrozu8,19.
Son zamanlarda, EndMT birkaç vitro çalışmalar EndMT15,20moleküler mekanizmaları ayrıntılarını aydınlatılmamıştır. EndMT dönüştürme büyüme faktörü (TGF) de dahil olmak üzere çeşitli sinyal yolları tarafından indüklenen-β, Wnt ve çentik1. Bunlar arasında TGF-β EMT ve EndMT indüksiyon çok önemli rol oynar. Kısa maruz kalma yetersiz21gibi görünüyor iken EndMT içinde EndMT çeşitli endotel hücrelerinde sonuçlarında TGF-β maruz uzun. Biz burada EndMT indüksiyon, hangi mil SVEN 1 (MS-1) fare pankreas mikrovasküler endotel hücreleri TGF-β20uzun süreli maruz kaldıktan sonra EndMT vitro geçmesi için basit bir protokol nitelendirdi. Bu modelde, EndMT morfolojik değişiklikler, downregülasyon endotel işaretleri, upregulation mezenkimal işaretleri ve inflamatuar genler, hücre iskeleti de dahil olmak üzere, hallmark özelliklerini araştırmak için birden çok aşağı akım analizleri yapılabilir düzenlemeler ve kollajen jel kasılma.
MikroRNA (miRNAs) ~ 22 olan nt çeşitli mRNA hedefleri22,23posttranscriptional baskı doğrudan küçük düzenlemesinde. Tohum Serisi-aracılı hedef tanıma, miRNAs hedef genlerin yüzlerce bastırmak ve hücre farklılaşması, yayılması ve motilite gibi çeşitli hücresel fonksiyonları modüle. Bu da EMT ve EndMT düzenlemesine yönelik olgusu ve birkaç miRNAs EMT ve EndMT24,25düzenleyiciler bildirilmiştir. Bu derlemede sunulan EndMT modeli kolayca miRNAs rolleri EndMT içinde test etmek için miRNA modülasyon yordamlar ile kombine edilebilir. Mevcut İnceleme TGF-β-indüklenen EndMT MS-1 hücrelerdeki araştırmak için deneysel prosedürlerimiz özetler ve karşılaştırma EndMT indüksiyon TGF-β tarafından koşullarının diğer endotel hücrelerinde de içerir.
TGF-β yalnız EndMT bu kısa dönem21‘ ikna etmek başarısız iken 24 h için etkin Ras ve TGF-β tedavi EndMT MS-1 hücrelerdeki indüklenen bildirilmiştir. Sürekli olarak, TGF-β önemli ölçüde EndMT sonra uzun tedavi (48-72 h) MS-1 hücreleri20dakika sonra indüklenen görülmektedir. Sonra uzun süreli tedavi ile TGF-β (2-6 gün) insan göbek gibi çeşitli endotel hücrelerinde damar endotel hücreleri (HUVEC), insan kutanöz mikrovasküler endotel hücreleri (…
The authors have nothing to disclose.
Biz Zea Borok ve Kohei Miyazono el yazması hazırlanmasında öneriler için teşekkür ederiz. H.I.S. ve M.H. Uehara Memorial Vakfı Araştırma Bursu tarafından desteklenir ve HIS Osamu Hayaishi Memorial bursu tarafından yurtdışında eğitim için desteklenir. Bu eser bir hibe Takeda Bilim Vakfı (A.S.) tarafından desteklenmiştir.
MS-1 cells | American Type Culture Collection | CRL-2279 | |
MEM-alpha | Thermo Fisher Scientific | 32571036 | |
TGF-beta2 | R&D | 302-B2-002 | |
4 well Lab-Tek II Chamber Slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 | |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Blocking One | nacalai tesque | 03953-95 | |
phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 | |
TOTO-3 iodide | Thermo Fisher Scientific | T3604 | |
VE cadherin monoclonal antibody (BV13) | Thermo Fisher Scientific | 14-1441-82 | |
alpha-SMA Cy3 monoclonal antibody (1A4) | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
Cover slip | Thermo Fisher Scientific | 174934 | |
Collagen solution | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
Collagen dilution buffer | Nitta gelatin Inc. | Cellmatrix I-P | |
LNA miRNA inhibitor | EXIQON | miRCURY LNAmicroRNA Power Inhibitor (Negative Control B and target miRNA) | |
synthetic miRNA duplex | Qiagen | miScript miRNA Mimic | |
Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778030 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |