Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt den Bau und die funktionelle Studien ein bispezifische Antikörper (BsAb), GPC3-S-Fab. BsAbs erkennt man zwei verschiedene Epitope durch ihre zwei verschiedenen Waffen. BsAbs sind aktiv für ihre Fähigkeit, direkt rekrutieren Immunzellen zu töten Tumorzellen untersucht worden. Gegenwärtig werden die meisten BsAbs in Form von rekombinanten Proteinen, Fc-haltigen BsAbs oder als kleiner BsAb Derivate ohne die Fc-Region hergestellt. In dieser Studie wurde GPC3-S-Fab, ein Antikörper-Fragment (Fab) basierte bispezifische Antikörper, durch die Verknüpfung der Fab Anti-GPC3 Antikörper GC33 mit einem Anti-CD16 Einzeldomäne Antikörper entwickelt. GPC3-S-Fab werden in Escherichia coli ausgedrückt und durch zwei Affinität Chromatographies gereinigt. Die gereinigte GPC3-S-Fab kann speziell an binden und Krebszellen töten GPC3 positive Leber durch die Rekrutierung von natürlichen Killerzellen, was auf eine mögliche Anwendung der GPC3-S-Fab in Leberkrebs-Therapie.
Introduction
Monoklonale Antikörper dienen heute im großen und ganzen für Krebs Behandlung1. Aufgrund der Flexibilität der Antikörper wurden verschiedene Antikörper-basierte Formate aktiv untersucht. Im Vergleich mit monoklonalen Antikörpern, haben BsAbs zwei verschiedene Antigen Bindung Module, damit sie erkennen, dass zwei verschiedene Ziele gleichzeitig und effizient lösen die Rekrutierung von immun-Effektorzellen und Tumor Zellen2töten.
Aktuelle rekombinante BsAb Formate können in der Regel zwei Klassen zugeordnet werden: Fc-haltigen BsAbs und BsAbs ohne eine Fc-Region. Verglichen mit Fc-haltigen Formate, die meist in Säugerzellen hergestellt werden, BsAbs ohne eine Fc-Region haben die Vorteile der kleineren Größen sind leichter im Mikroorganismus Expressionssysteme produziert, und dringen Tumorgewebe effizienter 3.
BsAbs ohne eine Fc-Region entstehen häufig durch die Verknüpfung von einzelnen verbindlichen Moieties, wie Single-Chain Variable Fragmente (ScFvs) oder Fabs3. Ohne die stabilisierenden Domänen kompromittiert BsAbs basierend auf ScFv-Fragmenten oft thermische Stabilität, geringe Löslichkeit oder ein erhöhtes Potenzial für Aggregation4,5. Im Gegensatz dazu sind Fab-basierte BsAbs stabiler aufgrund der Heterodimerization der CH1 und CL in der nativen Fab Glyko-4,6.
Variable Domäne aus Heavy-Kette-nur Antikörper (Fhkw, auch als Einzeldomäne Antikörper bezeichnet) sind die aktiven Antigen-bindenen Fragment der natürliche schwere Kette Antikörper7. Fhkw haben die Eigenschaften der hohen Affinität, Spezifität von konventionellen IgGs8, niedrige Immunogenität und hohe Erträge in bakteriellen Ausdruck9. Fhkw haben höhere thermische Stabilität10gegenüber den Fv Fragmente. Fhkw haben gegenüber den Fab Moieties kleinere Größen aufgrund des Fehlens von CH1 und CL. So war S-Fab, gewonnen durch die Verknüpfung der Fab mit einer Einzeldomäne Antikörper, LHKW, BsAb-Format konzipiert und studierte für seine Anti-Tumor-Effekte11,12.
In dieser Studie wurde der Bau des GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung der Fab hGC3313 mit einer Anti-CD16a LHKW14 beschrieben. Die GPC3-S-Fab kann effizient durch periplasmatischen Ausdruck in Escherichia coli (E. Coli)produziert werden. Funktionelle Studien von GPC3-S-Fab vorgeschlagen, dass GPC3-S-Fab eine vielversprechende Strategie für Leberkrebs-Therapie. So gehören die Vorteile der GPC3-S-Fab über alternative Techniken mit gültigen Verweise auf frühere Studien einfache Produktion und Reinigung und stabiler BsAbs.
Säugetier-Expressionssysteme und prokaryotischen Expressionssysteme wurden zur verschiedene Formate von BsAbs zum Ausdruck bringen. Im Gegensatz zu Säugetieren Expressionssysteme, E. Coli-basierte Protein Expressionssysteme haben viele Vorteile, einschließlich hohe Erträge, low-cost und arbeitssparend, die einfache genetische Manipulationen und hohe Umwandlung Leistungsfähigkeit15. Für die BsAbs Expression in E. Coli, gibt es zwei grundlegende Strategien: Ausdruck im Zytoplasma und Ausdruck in das Periplasma zwischen dem Zytoplasma und dem äußeren Zellmembranen15. Im Vergleich zu den reduzierenden Umgebung des Zytoplasma, ist das Periplasma ein mehr oxidierende Umgebung, die fördert die korrekte Faltung und Co Expression von Proteinen16. Korrekte Faltung spielt eine Schlüsselrolle in der Löslichkeit, Stabilität und Funktion Generation von BsAbs. Daher wurde ein Signal Sequenz PelB der N-Terminus von S-Fab Sekretion, das Periplasma von E. Coli17direkt hinzugefügt. Um sicherzustellen beschäftigt korrekte Faltung, Löslichkeit, thermische Stabilität und conformational Stabilität, reduzieren die Komplexität und die Größe eines Antikörpers ist häufig16. Das S-Fab-Format besteht aus einem Fab und einem LHKW, die im bakteriellen Systemen wahrscheinlich aufgrund der einfachen Struktur und der geringen Größe sehr gut zum Ausdruck kommt.
GPC3 wurde in diesem GPC3-S-Fab bispezifische Antikörper Format gewählt. Glypican-3 (GPC3) ist ein Mitglied der Heparin-Sulfat (HS)-Proteoglykan-Familie, die an der Zelloberfläche durch glycosylphosphatidylinositole (GPI)18verankert ist. GPC3 ist in 70 % der hepatozellulären Karzinom (HCC) Fällen, welches Konto für die Mehrheit der Leberkrebs19,20,21,22überexprimieren. Da GPC3 selten in normalen Geweben ausgedrückt wird, ist GPC3 als ein potenzielles Ziel für HCC vorgeschlagen worden. Mehrere Maus-mAbs wurden gegen GPC3 produziert. Jedoch nur GC33 stellte begrenzte Anti-Tumor-Aktivität 22und es versäumt, die klinischen Wirksamkeit bei Patienten aufweisen. In dieser Studie zeigte sich GPC3-S-Fab, NK-Zellen zu töten GPC3 Tumor Zellen14rekrutieren zu können.
NK-Zellen zu rekrutieren, wurde Anti-CD16 LHKW verwendet. CD16a ist eine geringe Affinität IgG-Rezeptor, vor allem auf einige Subtypen von T-Zellen, Monozyten und Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK) ausgedrückt. Sie engagiert sich in Antikörper-abhängige Zelle Zytotoxizität (ADCC) von NK-Zellen-23. Menschlichen NK-Zellen können unterteilt werden in zwei Typen, CD56 - CD16 + / CD56 + CD16. Im Gegensatz zu CD56 + CD16− NK-Zellen, CD56-CD16 + NK-Zellen können höhere Perforin und granzym B lösen und damit eine starke Zytotoxizität24. Kupffer Zellen (KCs), mit dem Ausdruck CD16a, sind die Bewohner Makrophagen in Leber. Kupffer Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von Leberkrebs25. So kann gezielt CD16a BsAbs eine viel versprechende Strategie als Beteiligung von T-Zellen gegen Leberkrebs sein.
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Protocol
Aller Verfahren, einschließlich menschliche Blutentnahme wurden von Sun Yat-Sen Universität Ethik-Kommission genehmigt.
1. GPC3-S-Fab Design-Strategie
- Entwerfen Sie GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung einer Fab Anti-GPC3 (vermenschlichten GC3313) mit einer Anti-CD16 LHKW14 (Abbildung 1).
- Synthetisieren Sie und Klonen Sie die VH-CH1-CD16-LHKW und VL-CL in der pET26b und pET21a Vektoren wie bereits berichtet12.
2. Transformation und Kultur
- Addieren Sie 100 ng von pET26b mit VH-CH1-CD16 (Abbildung 1A) und 100 ng von pET21a mit VL-CL (Abbildung 1A) in 100 µL kompetente BL21 (DE3) Zellen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 30 min. inkubieren im Wasserbad 42 ° C für 45-90 s, Transfer, auf Eis und inkubieren Sie für ca. 3-5 min auf Eis.
- Fügen Sie 500 µL Lysogeny Brühe (LB) Medium in ein Röhrchen mit BL21 (DE3) Zellen und dann Inkubation bei 37 ° C, 150 u/min für 45-60 min. verteilt 100 µL BL21 (DE3) Zellen auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL von Kanamycin und 100 µg/mL von Ampicillin , und dann Inkubation bei 37 ° C für 12-16 Uhr.
- Lysogeny Brühe (LB) Medium vorbereiten: 1 % wt/Vol Tryptone, 0,5 % wt/Vol Hefeextrakt, 1 % wt/Vol NaCl.
- Zellen aus einer einzigen Kolonie in 5 mL super Brühe (SB) Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillinund Kultur bei 37 ° C, 220 u/min, über Nacht zu impfen. Dann impfen Sie 1 mL der Kultur in 100 mL SB 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C, 220 u/min für 4 h-haltigem Medium. Übertragen Sie anschließend 10 mL der Kultur in 1 L des SB 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C, 220 u/min-haltigem Medium.
- Bereiten Sie super Brühe Medium: 3,2 % wt/Vol Tryptone, 2 % wt/Vol Hefeextrakt, 0,5 % wt/Vol NaCl.
- Erreicht die OD600 0,6 - fügen 0,8, Sie Isopropyl-b-D-Thio-Galactopyranoside (IPTG), eine Endkonzentration von 0,2 mM. Kultur bei 16 ° C, 180 u/min für 36-48 h für periplasmatischen Ausdruck.
3. GPC3-S-Fab periplasmatischen Reinigung
- Periplasmatischen Bruchteil Vorbereitung
- Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 x g, 4 ° C für 30 min zu, entsorgen Sie das Medium und Wägezellen Sie die.
- Aufschwemmen Sie die Zellen gründlich in 4 mL eiskaltes Saccharoselösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25 % (wt/Vol) Saccharose und 1 mM EDTA) pro Gramm der Zellen und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie bei 8.500 x g (Tischplatte Zentrifuge, Rotor mit festen Winkeln), 4 ° C für 20 min. Überstands (Saccharose-Bruch) zu entfernen und speichern Sie es auf dem Eis.
- Die Pellets in einem Mix aus eiskalten 5 mM MgCl2 und 1 mM PMSF (4 mL pro Gramm Zellen) aufzuwirbeln. Hinzufügen von 40 µL Lysozym-Lager (15 mg/mL) pro Gramm, und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
- Zentrifugieren bei 8.500 x g (Tischplatte Zentrifuge, Rotor mit Winkeln fixiert), 4 ° C für 20 min. Transfer der Überstand (periplasmatischen Bruch) und speichern Sie es auf dem Eis.
- Kombinieren Sie die Saccharose Bruchteil und periplasmatischen Bruchteil und Zentrifugieren bei 30.000 x g, 4 ° C für 30 min. Überstands entfernen und speichern Sie es in einem 50 mL konische Röhrchen auf dem Eis.
- NI-NTA-Affinitätsreinigung
- 1 mL der Ni-NTA Agarose durch gründlich mischen, um eine homogene Suspension zu erreichen, 1 mL Ni-NTA Agarose, einem frischen 15 mL konische Rohr zu entfernen und Hinzufügen von 10 Spalte Volumen (CV) Gleichgewichtherstellung Puffer Aufschwemmen (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl) zu equilibrate.
- 400 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand vorsichtig entfernen. Fügen Sie die Ni-NTA-Agarose in der 50 mL-Tube mit Saccharose Bruchteil und periplasmatischen Bruchteil. Felsen bei 4 ° C für 2 h.
- Die Mischung bei 400 X g zentrifugieren, 4 ° C für 5 min. entfernen Sie vorsichtig den überstand auf eine andere frische eiskalte Röhre als ungebundene Bruch. Übertragen Sie die Ni-NTA-Agarose in eine Schwerkraft-Spalte.
- Fügen Sie 10 CV von Waschpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM oder 40 mM imidazol) auf die Spalte, und sammeln die Elute waschen Bruch.
Anmerkung: Diese Lösungen sollten in der Reihenfolge der steigenden Konzentrationen von Imidazol hinzugefügt werden. - Fügen Sie 3 CV der Elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM oder 400 mM imidazol) in die Spalte und sammeln die Elute Elution Bruch 1, 2, 3 und 4.
Anmerkung: Diese Lösungen sollten in der Reihenfolge der steigenden Konzentrationen von Imidazol hinzugefügt werden. - Dialyse eluierten Brüche in 2 L des PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) mit Dialyse Schläuche (12,4 kDa) bei 4 ° C für 2 h überprüfen das Vorhandensein von GPC3-S-Fab um 12 % SDS-PAGE und dann durch Coomassie blaue Färbung.
- IgG-CH1 Affinitätsreinigung
- Überführen Sie 1 mL der IgG-CH1 Affinität Harz in ein 50 mL konische Röhrchen, und waschen Sie zuerst die Perlen mit PBS. Fügen Sie dann die dialysierten Lösung mit GPC3-S-Fab nach Schritt 3.2.6. Felsen bei 4 ° C für 2 h.
- Zentrifuge bei 400 X g für 5 min, 4 ° C. Sorgfältig entfernen des Überstands auf eine andere frische eiskalte Röhre und das Harz auf eine Schwerkraft-Spalte zu übertragen.
- Fügen Sie 10 CV des Waschens Puffer (PBS) in die Spalte, und sammeln Sie die Elution der Wash-Bruch.
- Bereiten Sie die Röhrchen durch Zugabe von 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL pro mL der einzelnen eluierten Fraktionen). Eluieren mit 3 CV Elution Buffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7), und sammeln den eluierten Bruch; Wiederholen Sie 3 Mal.
- Dialyse eluierten Brüche in 2 L des PBS mit Dialyse Schläuche (12,4 kDa) bei 4 ° C für 2 h zweimal wiederholen.
- Konzentration des Proteins durch Ultramicrospectrophotometer bestimmen (molare Aussterben Koeffizient: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).
(4) SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
- 5 x SDS laden Puffer 10 µL der Probe berücksichtigen und gut mischen. Kochen Sie die Proteinmischung bei 100 ° C für 5 min.
- 5 x SDS laden Puffer vorzubereiten: 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 % wt/Vol SDS, 0,5 % wt/Vol Bromophenol Blue, 50 % Vol/Vol Glycerin, 5 % Vol/Vol Beta-Mercaptoethanol.
- Bereiten Sie eine SDS-PAGE-Gel mit einem Laden Gel (5 %) und Trennung Gel (12 %) als zuvor beschriebenen26,27,28.
- Laden Sie 10 µL des gekochten Proteinmischung und Protein-Marker, und führen Sie die SDS-PAGE.
- Färben Sie das Gel durch Schütteln für 20 min mit Coomassie brilliant blau Lösung, und führen Sie dann entfärben.
- Für das westliche Beflecken, nach der Übertragung auf PVDF Membran, blockieren die Membran mit TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 % Vol/Vol Tween 20) + 5 % wt/Vol Magermilch für 1 h bei Raumtemperatur unter schütteln.
- Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörper (Anti-His oder Anti-Flag) verdünnt 1:2,000 in TBST + 5 % Magermilch für 1 h.
- Waschen mit TBST für 5 min bei Raumtemperatur, und 3 Mal wiederholen.
- Inkubieren Sie die Membran in Sekundärantikörper (HRP-linked Anti-Maus Fc Antikörper) verdünnt 1:2,000 in TBST + 5 % Magermilch für 1 h.
- Waschen mit TBST für 5 min bei Raumtemperatur, und 3 Mal wiederholen.
- Fügen Sie 1 mL der HPR Substrat pro Film, entwickeln Sie und nehmen Sie Bilder.
5. Gelanalyse Filtration
- Verwenden Sie die folgende Spalte: Spalte Volumen von 24 mL; Gleichgewichtherstellung Puffer von PBS pH 7.4; Durchfluss von 0,5 mL/min bei gemäßigten Zimmer; Probenvolumen von 200 µL.
- Verwenden Sie die folgenden Protein Volumen und Konzentration: 500 µL 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Bei 20.000 x g für 30 min zentrifugieren und 200 µL laden zu nehmen.
- Nehmen Sie für die Protein-Marker-Volumen und Konzentration 100 µL Cytochrom C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL Anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), Albumin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL und 200 µL des Alkohol-Dehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) in einem Rohr. Bei 20.000 x g für 30 min zentrifugieren und 200 µL laden zu nehmen.
- Waschen Sie vor jeder Fahrt mit mindestens 2 CV von destilliertem Wasser bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.
- Equilibrate die Spalte mit mindestens 2 CV Gleichgewichtherstellung Puffer (PBS, pH 7.4) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.
- Injizieren Sie automatisch Probe bei 0,5 mL/min auf die Probe zu laden.
- Eluieren mit Gleichgewichtherstellung Puffer mit 0,5 mL/min und bei 280 und 215 nm zu erkennen.
(6) Flow Cytometry Analysis
- Kultur der HepG2 (GPC3 positiv), Hep3B (GPC3 positiv), Huh7 (GPC3 positiv), und MHCC - 97H (GPC3 negativ) Zellen in Plastikschalen 100 x 20 mm mit DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C 5 % CO2.
- Kultur CHO (GPC3 negativ) und CHO/GPC3 Zellen beherbergen die in voller Länge menschlichen GPC3 cDNA (GPC3 positiv) in 100 mm x 20 mm Plastikschalen mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS, Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C, 5 % CO2.
- Kultur der NK92/CD16 beherbergen die in voller Länge menschlichen CD16 cDNA (CD16 positiv) in 25cm2 Kolben mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS, Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C, 5 % CO2.
- Wenn die Zellen sind 70-90 % konfluierende, verwerfen das Medium und die Zellen mit 2 mL PBS waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für ca. 2-3 min (oder bis die Zellen beginnen sich zu lösen von der Oberfläche). Fügen Sie 1 mL des Mediums komplette Wachstum zu neutralisieren die Trypsin und erneut aussetzen der Zellen durch sanft auf und ab pipettieren.
- Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Neubauer Hemocytometer und erkennen Sie die Zellviabilität Trypan blau zu.
- 3 x 106 Zellen für jede Zelllinie zu sammeln. Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA, die Zellen wieder auszusetzen. Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. zweimal wiederholen.
- Fügen Sie 0,3 mL PBS + 0,2 % BSA, die Zellen wieder auszusetzen, und übertragen Sie 100 µL (ca. 1 Million) auf jedes 5 mL Polystyrol Rundboden Röhrchen.
Hinweis: Bitte stellen Sie sicher, dass alle Schritte von hier aus an den Rohren auf Eis kühl gelagert werden sollte. Wenn der Antikörper auf der Zelle Oberfläche Antigen gebunden ist, beginnt die Anlage zu verinnerlichen. Dadurch, dass es kalt, ist der Prozess deutlich verlangsamt. - Jedes Rohr 10 µL Primärantikörper (GPC3-S-Fab oder menschlichen IgG1, Endkonzentration 5 µg/mL) hinzu, und auf Eis für 1 h inkubieren.
- Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA zu waschen, und Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie dreimal.
- Neu in 100 µL PBS + 0,2 % BSA, auszusetzen und dann fügen Sie 0,5 µL sekundäre Antikörper (Anti-Human IgG(H+L)-488, endgültige Konzentration 10 µg/mL) und Inkubation für 1 h Hinweis auf Eis: von diesem Schritt bitte halten Sie die Zellen aus dem Licht.
- Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA zu waschen, und Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie dreimal.
- Analysieren Sie die Zellen, indem Sie Durchflusszytometer nach Standardprotokoll29. Zellen mit einem 488 nm Laser Erregung zu erwerben.
(7) zytotoxischen Assays
- Bereiten Sie Tumorzellen.
- Kultur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H und CHO Zellinien wie 6.1-6.5 beschrieben.
- Verdünnen Sie Zellen 0,5 × 105/mL und Platte 100 µL Zellen (5.000 pro Well) auf 96-Well Platten. Kultur 6-8 h um die Zellen zu befestigen können.
- Menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) vorzubereiten.
- Verdünnen Sie frisches zubereitetes Blut mit ein gleiches Volumen an PBS in einer 50 mL konische Röhre. Z. B. verdünnen Sie 10 mL Blut mit 10 mL PBS.
- Eine frische 50 mL konische Rohr berücksichtigen Sie 15 mL Lymphozyten Trennmedium. Übertragen Sie das verdünnte Blut auf die Lymphozyten Trennmedium entlang der Schlauchseite langsam.
Hinweis: Halten Sie das Rohr senkrecht. Brechen Sie die Oberfläche des Mediums Lymphozyten Trennung nicht. - Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 35 min bei Raumtemperatur mit der Bremse aus.
- Langsam entfernen Sie der oberen Plasmaschicht, und die weißen Blutkörperchen-Layer mit PBMCs an der Plasma-Lymphozyten Trennung mittlere Schnittstelle.
- Verdünnen Sie die PBMCs mit einem doppelten Volumen von PBS + 2 % FBS. 400 X g für 5 min zentrifugieren.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS + 2 % FBS. Zentrifuge bei 400 X g für 5 min. zählen die Zellzahlen wie in Schritt 6.5 beschrieben.
- NK-Zellen vorbereiten.
- Bereiten Sie die PBMCs Suspension in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/mL in PBS + 2 % FBS und Stelle Sie in eine 5 mL Polystyrol Rundboden-Tube.
- Fügen Sie menschliche NK Zelle Bereicherung Cocktail 50 µL/ml von Zellen. Gut verrühren und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
- Die Magnetpartikel von NK Zelle Enrichment Kit, und gut mischen, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig durch pipettieren ausgesetzt sind oben und unten kräftig mehr als 5mal aufzuwirbeln. Übertragen Sie die resuspendierte Magnetpartikel 100 µL/ml auf die Zellsuspension. Gut mischen und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Bringen Sie die Zellsuspension bis zu einem Gesamtvolumen von 2,5 mL durch Zugabe von PBS + 2 % FBS. Mischen Sie die Zellen in der Röhre durch pipettieren sanft nach oben und unten 2 - 3 Mal. Platzieren Sie das Rohr (ohne Deckel) in den Magneten. Lassen Sie die magnetische Beads niederlassen für 2,5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Magneten. Invertieren Sie in einer kontinuierlichen Bewegung das Rohr, gießt die angereicherten Zellsuspension in einen neuen Schlauch.
- Zählen Sie die Zelle Zahlen wie im Schritt 6.5 beschrieben.
- Richten Sie die zytotoxische Reaktion.
- Verdünnen Sie die NK-Zellen, 5 × 105 Zellen/mL mit dem entsprechenden Kulturmedium. Die Tumorzellen auf einer 96-Well-Platte vergoldet fügen Sie 100 µL Zellsuspension NK hinzu.
- Fügen Sie 10 µL GPC3-S-Fab in verschiedenen Konzentrationen mit der höchsten Dosis an eine Endkonzentration von 30 µg/mL, 3-fold Verdünnung, 9-Punkt (3 Wiederholungen).
- Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 72 h.
- Entfernen Sie nach 72 h Inkubationszeit das Medium 100 µL 10 µL CCK8 Reagenz in jede Vertiefung in 96-Well Platten-haltigem DMEM Medium hinzufügen und dann bei 37 ° c inkubieren
- Lesen Sie die Platte bei 450 nm bei 1, 2, 3 und 4 h nach dem Hinzufügen des CCK8 Reagens.
- Die Daten zu analysieren. Berechnen Sie die Überlebensrate als (OD450 GPC3-S-Fab + Effektor + Tumor - OD450 Medium) / (OD450 Tumor - OD450 Medium) × 100 % und (OD450 GPC3-S-Fab + Tumor - OD450 Medium) / (OD450 Tumor - OD450 Medium) × 100 %. Die Effektorzellen sind NK-Zellen.
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Representative Results
GPC3-S-Fab-Reinigung
GPC3-S-Fab wurde von E. Coli durch eine zweistufige Affinitätsreinigung erst mit Ni-NTA-Agarose, gefolgt von IgG-CH1 Affinitätsreinigung gereinigt. Nach dem zweistufigen Affinitätsreinigung gereinigt wurde GPC3-S-Fab zur Homogenität mit zwei Ketten in der Nähe von 1:1 (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von VH-CH1-CD16 LHKW und VL-CL Polypeptide kann identifiziert werden, durch ihre ausgeprägte C-terminale Tags, Anti-His für die VL-CL etwa 25 kDa und Anti-Flag für die VH-CH1-LHKW ca. 38 kDa (Abb. 2 b). Nach dem zweistufigen Affinitätsreinigung ~1.2 mg Protein 1 L SB Kultur entnehmen. Um die gereinigten GPC3-S-Fab weiter zu charakterisieren, wurde Gel Filtration durchgeführt. Basierend auf der standard-Marker (Abbildung 2), wurde GPC3-S-Fab als eine homogene Monomer in Form von einem Heterodimer mit einer molekularen Größe von ca. 63 kDa (Abbildung 2) identifiziert.
GPC3-S-Fab Bindung Aktivitäten
Um festzustellen, ob die GPC3-S-Fab GPC3-positiven Zellen und CD16-positiven Zellen erkennt, wurde Flow Cytometry-Analyse mit GPC3-positiv-Leberkrebs-Zelllinien HepG2, Hep3B, Huh7, CHO/GPC3 und GPC3-Negative Leberkrebs Zelllinie durchgeführt, MHCC - 97H, und CHO-Zellen. Die GPC3-S-Fab konnte auf alle GPC3-positiven Zellen, obwohl mit schwächeren Bindung an Hep3B gebunden (Abb. 3 b) und Huh7 Zellen (Abbildung 3) als HepG2 (Abbildung 3A) und CHO/GPC3 (Abb. 2F). Keine oder minimale Bindung an GPC3-negativen MHCC - 97H und CHO-Zellen beobachtet werden (Abbildung 3D, 3E). GPC3-S-Fab konnte auch an den CD16-positiven Zellen, NK92/CD16 (Abbildung 3) gebunden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Ergebnissen mit anderen Anti-GPC3 Antikörper30, was darauf hindeutet, dass GPC3-S-Fab GPC3-positiv-Zell-Linien und CD16-positiven Zellen spezifisch binden kann.
Um die Zytotoxizität von GPC3-S-Fab zu bewerten, wurden Tumorzellen mit frischen isolierten NK-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von GPC3-S-Fab inkubiert. Ohne NK-Zellen hatte GPC3-S-Fab keine Zytotoxizität gegen Tumorzellen unabhängig vom GPC3 Ausdruck Status (Abbildung 4). In Anwesenheit von NK-Zellen GPC3-S-Fab löste starke Zytotoxizität gegen HepG2, Hep3B und Huh7 Zellen in einer Dosis-abhängigen Weise aber zeigte keine Wirkung auf GPC3-negativen MHCC - 97 H Zellen (Abbildung 4), darauf hindeutet, dass die Zytotoxizität von GPC3-S-Fab GPC3 Ausdruck auf der Zelloberfläche des Tumors abhängig.
Abbildung 1. Konstrukte der GPC3-S-Fab
(A) der bakteriellen Ausdruck Konstrukte der GPC3-S-Fab. Die Konstrukte enthalten eine Signalsequenz PelB , ein humanisierter Anti-GPC3 (GC33) VH-CH1-Anti-CD16 LHKW (schwere Kette) oder ein VL-CL (Lichterkette). Um Protein-Erkennung und Reinigung zu erleichtern, wurde ein Flag-Tag oder ein His8-Tag an den C-Terminus hinzugefügt. (B) Diagramm von GPC3-S-Fab nach Co Ausdruck.
Abbildung 2. GPC3-S-Fab-Reinigung von E. Coli.
(A) links nach Ni-NTA Affinitätschromatographie; Rechten Seite, nach Anti-IgG-CH1 Affinitätschromatographie; M, Molekulargewicht Leiter; Coomassie blaue Färbung. (B) links nach Ni-NTA Affinitätschromatographie; Rechten Seite, nach Anti-IgG-CH1 Affinitätschromatographie; M, Molekulargewicht Leiter; Western-Blot. (C) Gel Filtration Analyse der GPC3-S-Fab. Abdeckung, standard-Marker; Bodenplatte, GPC3-S-Fab. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. GPC3-S-Fab erkennt GPC3 positive und CD16-positiven Zellen.
Flow Cytometry Analyse der HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), MHCC - 97 H (D), (E), CHO CHO/GPC3 (F) und NK92/CD16 (G) Zellen erfolgte wie im Protokoll beschrieben. Rote Linie: Tumorzellen nur; Grüne Linie: Isotype Kontrolle, Tumorzelle menschlichen IgG1 ++ Anti-Human IgG(H+L)-488; blaue Linie: Tumorzelle + GPC3-S-Fab + Anti-Human-IgG (H + L)-488. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. GPC3-S-Fab fördert den Zelltod von Krebszellen GPC3-positiv.
Dosis-abhängige Zytotoxizität Tests wurden durchgeführt, wie in dem Protokoll für HepG2 beschrieben (A), Hep3B (B), Huh7 (C), und MHCC - 97 H (D). Die Konzentrationen von GPC3-S-Fab waren von 0.0045 µg/mL bis 30 µg/mL. Die Daten sind das Mittel der Triplicates mit Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung. Gefüllter Kreis, nur GPC3 S Fab; ausgefülltes Quadrat GPC3-S-Fab+ NK, NK-Zellen (50.000 pro Well) und Zielzellen (5.000 pro Well). Die Mischungen wurden für 72 h vor der Messung der Zytotoxizität inkubiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In dieser Studie präsentieren wir eine Strategie, um ein neues Format von BsAbs, konstruieren GPC3-S-Fab, die NK-Zellen GPC3 positive Tumorzellen gezielt rekrutieren kann. Die S-Fab basiert auf der natürlichen Fab Format durch das Hinzufügen einer Anti-CD16 LHKW11,12. Im Vergleich mit der BsAbs enthaltenden Fc Region, kann GPC3-S-Fab leicht in das Periplasma von Bakterien in großem Maßstab hergestellt werden.
Mit der im Protokoll beschriebenen Strategie zur Meinungs- und Reinigung, erhalten wir eine lösliche und funktionelle GPC3-S-Fab in großen Mengen. Um periplasmatischen Ausdruck zu erleichtern, wurde ein Signal Sequenz PelB der N-Terminus Sekretion, das Periplasma von E. Coli17direkt hinzugefügt. Im Gegensatz zu den Zytoplasma, die mehr oxidierende Umgebung in den periplasmatischen Raum zwischen den zytoplasmatischen und äußeren Membranen ist ausgestattet mit einer Reihe von Proteinen wichtig für die Proteinfaltung und Montage und fördert somit die Korrektur Faltung und Löslichkeit von rekombinanten Proteinen16. Allerdings hat die Maschinen für die Proteinfaltung und Export in das Periplasma in E. Coli Kapazität begrenzt. Hohe Expression rekombinanter Proteine oft ergibt sich in der Anhäufung von unlöslichen Produkt im Periplasma16. Um die hohe Expression des Proteins in kurzer Zeit zu vermeiden, wurden niedrige IPTG (0,2 mM) und niedriger Temperatur (16 ° C) in nahrhaften Medium in diesem Protokoll zu vermeiden, die Anhäufung von unlöslichen Protein angewendet. In dieser Studie wurde ~1.2 mg Protein aus 1 L des Mediums, Verbesserung der Erträge mindestens 2-fach im Vergleich zu früheren Werken12gewonnen.
Um Proteinabbau zu vermeiden, sollten alle Fraktionen mit GPC3-S-Fab in verschiedenen Schritten auf Eis gehalten werden. Mit seinem tag am C-terminalen VL-cl, Ni-NTA-Agarose für Reinigung verwendet wurde. Einzelne Ni-NTA-Agarose-Reinigung ist jedoch nicht ausreichend, um unerwünschte Proteine, wie z.B. ungepaarte VL-CL-Protein zu entfernen. Um die homogene heterodimerisierenden GPC3-S-Fab, der zweite Schritt zu reinigen war Anti-IgG-CH1 Affinitätsreinigung angewendet. Das gereinigte Protein hatte hohe Reinheit und zwei Polypeptiden nahe 1:1 (Abbildung 2A-2 b).
Gel-Filtration-Chromatographie bestimmen die Molmassen von Proteinen, die aufgrund ihrer molekularen Größe und Formen; analysieren Sie den Grad der Reinheit; und bestimmen, ob das gereinigte Protein ein Monomer ist, Dimer, oder Aggregate15bestehend. Durch Gel Filtration Chromatographie war GPC3-S-Fab mit der erwarteten Molekülgröße ca. 63 kDa, identifiziert in Form von einem Monomer mit Heterodimerization von GPC3-S-Fab (Abbildung 2).
Durchflusszytometrie kann bestimmen, ob ein Antikörper, seine Antigen auf der Zellmembran binden kann, verglichen mit traditionellen Western-Blot und ELISA, die Antigen-Antikörper-Bindung Reaktionen nur erkennen. Flow-zytometrie-Analyse anerkannt GPC3-S-Fab die GPC3 auf der Zellmembran, was darauf hindeutet, dass die GPC3-Fab Glyko-funktionsfähig war. Wenn Sie Flow-zytometrie-Analyse durchführen, ist es wichtig, alle Schritte auf dem Eis oder bei 4 ° C zu halten, nachdem der Antikörper hinzugefügt wird. Wenn der Antikörper auf der Zelle Oberfläche Antigen bindet, wird die Antikörper-Antigen-Komplex Internalisierung einleiten. Dadurch, dass es kalt, ist der Prozess der Verinnerlichung deutlich verlangsamt.
PBMCs und NK-Zellen wurden effizient isoliert aus dem menschlichen peripheren Blut durch Zentrifugation mit Lymphozyten Trennung Medium, gefolgt von magnetisch aktivierte Zelle Sortieren Strategien. GPC3-S-Fab zeigte potente Zytotoxizität gegen die GPC3 positive Zellen, wenn das Verhältnis von NK-Zellen auf Zielzellen (Tumorzellen) 10:1 betrug, und das Verhältnis von NK-Zellen auf Zielzellen von 50: 1 bis 5:1 variieren könnte.
Zusammenfassend bietet GPC3-S-Fab, die in einem Mikroorganismus Ausdruck System hergestellt werden können, einen neuen Weg um funktionale Formate der BsAbs gegen Tumoren zu erstellen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der R & D Planen der Provinz Guangdong (VR China) (2016A050503028) finanziell unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Shaking incubator | Thermo Fisher | MAXQ 4000 | |
| Shaking incubator | Zhicheng | ZWYR-D2402 | |
| Centrifuge | Cence | GL-10MD | |
| Centrifuge | Beckman coulter | Avanti j-26S XPI | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Thermo Fisher | Nanodrop | |
| Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus | Mini-PROTEAN® Tetra | Bio-rad | |
| Trans-blot apparatus | Criterion | Bio-rad | |
| Imaging system | Bio-rad | chemidoc tm XRS+ | |
| Fast Protein Liquid chromatogram | GE Healthcare | AKTA avant | |
| GF column | GE Healthcare | 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL | |
| Flow Cytometer | Beckman coulter | FC500 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5702R | |
| Envision plate reader | TECAN | Infinite F50 | |
| Anti His-tag | eBioscience | 14-6657-82 | |
| anti-Flag-tag | Sigma | F1804 | |
| anti-human(H&L)-488 | A11013 | Invitrogen | |
| Anti-mouse IgG HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076S | |
| Ni-NTA-Agarose | Tribioscience | TBS9202-100 | |
| IgG-CH1 affinity resin | Thermo Fisher | 194320005 | |
| Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| NK cell enrichment kit | Stemcell | 19055 | |
| Magnet | Stemcell | 18000 | |
| CCK8 kit | Dojindo | CK04 | |
| DMEM | Gibco | C11995500CP | |
| RPMI-1640 | Gibco | C11875500CP | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| Trypsin | Gibco | 15050-057 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture |
| Standard marker | Sigma Aldrich | MWGF200 | Gel filtration |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) | VWR chemicals | VWRC0487-100G | |
| Dialysis tubing | Sigma Aldrich | D0655-100FT | |
| Knanamycine | VWR | VWRC0408-100G | |
| Ampicillin | VWR | VWRC0339-100G | |
| Tryptone | Thermo Fisher | LP0042B | |
| Yeast Extract | Thermo Fisher | LP0021B | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241 | |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T6791-1KG | |
| EDTA | Sigma Aldrich | V900106 | |
| Glycine | aladdin | A110752-500g | |
| KCl | aladdin | P112134-500g | |
| MgCl | Sigma Aldrich | V900020 | |
| Agar | Sangon Biotech | A505255-0250 | |
| Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | VWR | 7778-77-0 | |
| Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) | VWR | 7558-79-4 | |
| 2-Mercaptoethanol | VWR | 60-24-2 | |
| Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) | VWR | 329-98-6 | |
| Lysozyme | Sigma Aldrich | L6876-25G | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | VWR | VWRC0472-50G | |
| Bromophenol blue | Sangon Biotech | A500922-25G | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | VWRC0332-100G | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | V900122 | |
| 100mm x 20mm plastic dish | Corning | 430167 | |
| 25cm2 flask | Corning | 430639 | |
| 96 well cell culture cluster | Corning | 3599 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A610498-0005 | |
| CHO | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | GNHa 3 | |
| MHCC-97H | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | SCSP-528 | |
| HepG2 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu 72 | |
| Huh7 | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu182 | |
| Hep3B | the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences | TCHu106 | |
| NK92 | ATCC | CRL2408 |
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