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Cancer Research

एक GPC3-लक्ष्यीकरण Bispecific एंटीबॉडी, GPC3-एस-फैब, शक्तिशाली Cytotoxicity के साथ

Published: July 12, 2018 doi: 10.3791/57588
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, 2Center for Cellular & Structural Biology, Sun Yat-Sen University

Summary

यहां, हम ई कोलाई में एक bispecific एंटीबॉडी GPC3-एस-फैब का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । शुद्ध GPC3-एस फैब GPC3 सकारात्मक जिगर कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ प्रबल cytotoxicity है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल में एक bispecific एंटीबॉडी (bsAb), GPC3-एस-फैब के निर्माण और कार्यात्मक अध्ययन का वर्णन है । bsAbs अपने दो अलग हथियारों के माध्यम से दो अलग epitopes पहचान सकते हैं । bsAbs सक्रिय रूप से अपने को सीधे प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भर्ती करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को मारने की क्षमता के लिए अध्ययन किया गया है । वर्तमान में, bsAbs के बहुमत रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के रूप में उत्पादित कर रहे हैं, या तो एफसी के रूप में bsAbs युक्त या एफसी क्षेत्र के बिना छोटे bsAb डेरिवेटिव के रूप में । इस अध्ययन में, GPC3-एस-फैब, एक एंटीबॉडी अंश (फैब) आधारित bispecific एंटीबॉडी, एंटी-GPC3 एंटीबॉडी GC33 के फैब को एंटी-CD16 एकल डोमेन एंटीबॉडी के साथ लिंक करके डिज़ाइन किया गया था । GPC3-एस-फैब ई कोलाई में व्यक्त किया जा सकता है और दो अपनत्व chromatographies द्वारा शुद्ध । शुद्ध GPC3-एस-फैब विशेष रूप से करने के लिए और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं की भर्ती द्वारा GPC3 सकारात्मक जिगर कैंसर की कोशिकाओं को मारने के लिए बाध्य कर सकते हैं, जिगर कैंसर थेरेपी में GPC3 एस-फैब के एक संभावित अनुप्रयोग का सुझाव ।

Introduction

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अब मोटे तौर पर कैंसर के इलाज के लिए इस्तेमाल कर रहे है1। एंटीबॉडी के लचीलेपन के कारण विभिन्न एंटीबॉडी आधारित स्वरूपों का सक्रिय रूप से पता लगाया गया है । मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ तुलना में, bsAbs दो अलग प्रतिजन बाध्यकारी मॉड्यूल है, उन्हें एक साथ दो विभिन्न लक्ष्यों को पहचानने के लिए सक्षम करने और कुशलतापूर्वक लक्ष्य और ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए प्रतिरक्षा प्रभाव कोशिकाओं की भर्ती को ट्रिगर2.

वर्तमान रिकॉमबिनेंट bsAb स्वरूपों आम तौर पर दो वर्गों को सौंपा जा सकता है: एफसी एक एफसी क्षेत्र के बिना bsAbs और bsAbs युक्त । एफसी के साथ तुलना स्वरूपों कि ज्यादातर स्तनधारी कोशिकाओं में उत्पादित कर रहे हैं, एक एफसी क्षेत्र के बिना bsAbs छोटे आकार के फायदे हैं, और अधिक आसानी से सूक्ष्मजीवों अभिव्यक्ति प्रणालियों में उत्पादित कर रहे हैं, और ट्यूमर के ऊतकों और अधिक कुशलता से प्रवेश कर सकते है 3.

एक एफसी क्षेत्र के बिना bsAbs सामांयतः एकल श्रृंखला चर टुकड़े (scFvs) या Fabs3के रूप में व्यक्तिगत बाध्यकारी moieties, जोड़ने के द्वारा बनाई गई हैं । स्थिर डोमेन के बिना, bsAbs scFv टुकड़े पर आधारित अक्सर थर्मल स्थिरता समझौता किया है, कम घुलनशीलता, या एकत्रीकरण के लिए एक वृद्धि की क्षमता4,5. इसके विपरीत, फैब आधारित bsAbs की heterodimerization के कारण अधिक स्थिर हैं और देशी फैब moiety4,6में CH1 और सीएल है ।

भारी श्रृंखला से चर डोमेन-केवल एंटीबॉडी (VHHs, भी एक डोमेन एंटीबॉडी के रूप में संदर्भित) सक्रिय प्रतिजन-प्राकृतिक भारी श्रृंखला एंटीबॉडी7के टुकड़े बाध्यकारी हैं । VHHs उच्च समानता, पारंपरिक IgGs8, कम immunogenicity की विशिष्टता, और बैक्टीरियल अभिव्यक्ति9में उच्च पैदावार की विशेषताओं है । Fv टुकड़े के साथ तुलना में, VHHs उच्च थर्मल स्थिरता10है । फैब moieties की तुलना में, VHHs में CH1 और सीएल की कमी के कारण छोटे आकार होते हैं । इस प्रकार, एस फैब, bsAb एक डोमेन एंटीबॉडी, VHH के साथ फैब जोड़ने के द्वारा प्राप्त स्वरूप, डिजाइन और इसके विरोधी ट्यूमर प्रभाव11,12के लिए अध्ययन किया गया था ।

इस अध् ययन में GPC3-एस-फैब को hGC3313 के फैब को एक एंटी-CD16a VHH14 के साथ जोडऩे के द्वारा निर्माण का वर्णन किया गया । GPC3-एस-फैब कुशलतापूर्वक ई कोलाई (ई. कोलाई)में periplasmic अभिव्यक्ति द्वारा उत्पादित किया जा सकता है । GPC3 के कार्यात्मक अध्ययन-एस फैब का सुझाव दिया है कि GPC3-एस-फैब जिगर कैंसर थेरेपी के लिए एक आशाजनक रणनीति है । इस प्रकार, पिछले अध्ययनों के लागू संदर्भों के साथ वैकल्पिक तकनीकों पर GPC3-S-फैब के लाभ आसान उत्पादन और शुद्धि, और अधिक स्थिर bsAbs शामिल हैं ।

BsAbs के विभिन्न स्वरूपों को व्यक्त करने के लिए स्तनधारी एक्सप्रेशन सिस्टम और prokaryotic एक्सप्रेशन सिस्टम का इस्तेमाल किया गया है । स्तनधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों के विपरीत, ई. कोलाईआधारित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों उच्च पैदावार, कम लागत और श्रम की बचत, आनुवंशिक जोड़तोड़ की आसानी, और उच्च परिवर्तन दक्षता15सहित कई लाभ, है । ई. कोलाईमें bsAbs अभिव्यक्ति के लिए, वहां दो बुनियादी रणनीतियों रहे हैं: कोशिका द्रव्य और बाह्य कोशिका झिल्ली15के बीच periplasm में कोशिका द्रव्य और अभिव्यक्ति में अभिव्यक्ति । कोशिका द्रव्य के कम करने के वातावरण की तुलना में, periplasm एक अधिक ऑक्सीकरण वातावरण है, जो सही तह और प्रोटीन की सह अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है16. सही तह घुलनशीलता, स्थिरता और bsAbs के समारोह पीढ़ी में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इसलिए, एक संकेत अनुक्रम pelB ई. कोलाई17के periplasm के लिए प्रत्यक्ष स्राव करने के लिए एस-फैब के एन-टर्मिनस के लिए जोड़ा गया था । सही तह, घुलनशीलता, थर्मल स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, और संरचना स्थिरता, जटिलता को कम करने और एक एंटीबॉडी के आकार अक्सर16कार्यरत है । एस फैब प्रारूप एक फैब और एक VHH है, जो बहुत अच्छी तरह से बैक्टीरिया की संभावना सरल संरचना और छोटे आकार के कारण प्रणालियों में व्यक्त की है के होते हैं ।

GPC3 को इस GPC3-एस-फैब bispecific एंटीबॉडी फॉर्मेट में चुना गया था । Glypican-3 (GPC3) हेपरिन सल्फेट (एच एस) proteoglycan परिवार है कि glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई)18के माध्यम से सेल की सतह के लिए लंगर का एक सदस्य है । GPC3 hepatocellular कार्सिनोमा (HCC) मामलों, जो जिगर कैंसर के बहुमत के लिए खाते19,20,21,22के ७०% में व्यक्त की है । क्योंकि GPC3 शायद ही कभी सामांय ऊतकों में व्यक्त की है, GPC3 HCC के लिए एक संभावित लक्ष्य के रूप में प्रस्तावित किया गया है । एकाधिक माउस mAbs GPC3 के खिलाफ उत्पादन किया गया है । हालांकि, केवल GC33 सीमित विरोधी ट्यूमर गतिविधि का प्रदर्शन 22, और यह रोगियों में नैदानिक प्रभावकारिता प्रदर्शित करने में विफल । इस अध्ययन में, GPC3-एस-फैब को NK कोशिकाओं को GPC3 ट्यूमर कोशिकाओं को मारने के लिए भर्ती करने में सक्षम दिखाया गया था14.

NK कोशिकाओं की भर्ती के लिए एंटी CD16 VHH का इस्तेमाल किया गया । CD16a एक कम समानता आईजीजी रिसेप्टर, प्राकृतिक हत्यारा पर मुख्य रूप से व्यक्त (NK) कोशिकाओं, मैक्रोफेज, monocytes और टी कोशिकाओं के कुछ उपप्रकार है. यह एंटीबॉडी-निर्भर सेल cytotoxicity (ADCC) में शामिल है NK कोशिकाओं द्वारा23। मानव NK कोशिकाओं को दो प्रकार से वर्गीकृत किया जा सकता है, CD56-CD16 + और CD56 + CD16-. CD56 + CD16 − NK कोशिकाओं के विपरीत, CD56-CD16 + NK कोशिकाओं perforin और granzyme बी के उच्च स्तर जारी कर सकते हैं और इस तरह एक मजबूत cytotoxicity24मौजूद हैं । Kupffer कोशिकाओं (केसीएस), व्यक्त CD16a, जिगर में निवासी मैक्रोफेज हैं. Kupffer कोशिकाओं जिगर कैंसर25के दमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस प्रकार, bsAbs लक्ष्यीकरण CD16a जिगर कैंसर के खिलाफ टी कोशिकाओं उलझाने से एक अधिक आशाजनक रणनीति हो सकती है ।

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Protocol

मानव रक्त संग्रह सहित प्रक्रियाओं के सभी सूर्य यत्-सेन विश्वविद्यालय नीतिशास्त्र समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. GPC3-एस-फैब डिजाइन रणनीति

  1. विरोधी के एक फैब-GPC3 (मानवतावादी GC3313) एक विरोधी CD16 VHH14 (चित्रा 1) के साथ जोड़ने के द्वारा डिजाइन GPC3-S-फैब ।
  2. संश्लेषित और वीएल और pET26b वैक्टर में VH-CH1-CD16-VHH और pET21a-सीएल क्लोन के रूप में पहले12की सूचना दी ।

2. परिवर्तन और संस्कृति

  1. pET26b युक्त VH के १०० एनजी जोड़ें-CH1-CD16 (चित्रा 1a) और pET21a युक्त वीएल के १०० एनजी-सीएल (चित्रा 1a) में सक्षम µ (BL21) कोशिकाओं के १०० DE3 l । अच्छी तरह से मिश्रण और ४५ के लिए एक ४२ ° c पानी स्नान में 30 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी-९० एस, हस्तांतरण, और 3-5 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  2. BL21 (DE3) कोशिकाओं से युक्त ट्यूब में lysogeny शोरबा (पौंड) मध्यम के ५०० µ एल जोड़ें और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, ४५-६० मिनट के लिए १५० आरपीएम पर फैला १०० µ l की BL21 (DE3) कोशिकाओं पर पौंड-आगर वाली प्लेट्स जिसमें ५० µ g /एमएल ऑफ कनमीसिन और १०० µ g /एमएल के एम्पीसिलीन , और फिर ३७ ° c में 12-16 h के लिए मशीन ।
    1. तैयार lysogeny शोरबा (LB) मध्यम: 1% wt/vol tryptone, ०.५% wt/vol खमीर उद्धरण, 1% wt/
  3. एक एकल कॉलोनी से Inoculate कोशिकाओं सुपर शोरबा (एसबी) के 5 मिलीलीटर में ५० µ जी/एमएल कनमीसिन और १०० µ जी/ एम्पीसिलीनके एमएल, और संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस, २२० rpm, रात भर में युक्त । फिर, inoculate 1 मिलीलीटर संस्कृति के १०० मिलीलीटर में ५० µ g/एमएल कनमीसिन और १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन और संस्कृति के ३७ ° c, २२० rpm पर 4 एच के लिए शामिल है । इसके बाद, संस्कृति के 10 मिलीलीटर का 1 एल में स्थानांतरण एसबी मध्यम से ५० µ g/एमएल का कनमीसिन और १०० µ g/एमएल का ३७ डिग्री सेल्सियस, २२० rpm पर एम्पीसिलीन और संस्कृति का है ।
    1. सुपर शोरबा मध्यम तैयार: ३.२% wt/vol tryptone, 2% wt/vol खमीर निकालने, ०.५% wt/vol NaCl ।
  4. जब आयुध डिपो६०० ०.६-०.८ तक पहुंचता है, isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) ०.२ mM के अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें । संस्कृति पर 16 ° c, ३६ के लिए १८० आरपीएम-periplasmic अभिव्यक्ति के लिए ४८ एच.

3. GPC3-एस-फैब Periplasmic शुद्धिकरण

  1. Periplasmic अंश वडा
    1. ४,००० x g, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा, मध्यम त्यागें, और कोशिकाओं वजन ।
    2. कोशिकाओं को अच्छी तरह से resuspend बर्फ के 4 मिलीलीटर-शीत सुक्रोज समाधान (20 मिमी of Tris-HCl, pH ७.५; 25% (wt/vol) सुक्रोज और 1 मिमी के EDTA) प्रति ग्राम कोशिकाओं, और 15 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    3. ८,५०० x g पर केंद्रापसारक (तालिका शीर्ष केंद्रापसारक, निश्चित कोण रोटर), 4 ° c 20 मिनट के लिए supernatant (सुक्रोज अंश) निकालें और इसे बर्फ पर सहेजें ।
    4. बर्फ के मिश्रण में छर्रों resuspend-ठंड 5 मिमी MgCl2 और PMSF के 1 मिमी (ग्राम कोशिकाओं प्रति 4 मिलीलीटर). जोड़ें ४० µ lysozyme स्टॉक के एल (15 मिलीग्राम/एमएल) प्रति ग्राम, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    5. ८,५०० x g पर केंद्रापसारक (तालिका शीर्ष केंद्रापसारक, निश्चित कोण रोटर), 4 ° c 20 मिनट के लिए supernatant (periplasmic अंश) हस्तांतरण और बर्फ पर इसे बचाने के लिए ।
    6. सुक्रोज अंश और periplasmic अंश का मिश्रण है, और ३०,००० x g, 30 मिनट के लिए 4 ° c पर केंद्रापसारक । supernatant को निकालें और बर्फ पर एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सहेजें ।
  2. Ni-ंत् संबध शुद्धि
    1. एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से मिश्रण द्वारा नी-ंत् agarose के 1 मिलीलीटर resuspend, एक ताजा 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए नी-ंत् agarose की 1 मिलीलीटर निकालें, और NaCl के लिए 10 कॉलम खंड (CV) equilibration बफर (25 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ७.५; 1 एम के equilibrate) जोड़ें ।
    2. 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक, और supernatant ध्यान से हटा दें । फिर, एनआई-ंत् agarose ५० मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें सुक्रोज अंश और periplasmic अंश युक्त. 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक
    3. ४०० x जी, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण केंद्रापसारक । ध्यान से असीम अंश के रूप में एक और ताजा बर्फ ठंडा ट्यूब को supernatant निकालें । Ni-ंत् agarose को गुरुत्वाकर्षण स्तंभ में स्थानांतरित करना ।
    4. धोने बफर के 10 CV जोड़ें (25 Tris-एचसीएल के मिमी, पीएच ७.५; NaCl के 1 मीटर; 20 मिमी, 30 मिमी या ४० मिमी imidazole) के कॉलम, और elute के रूप में धुलाई अंश इकट्ठा ।
      नोट: imidazole की सांद्रता बढ़ाने के क्रम में इन समाधानों को जोड़ा जाना चाहिए ।
    5. रेफरेंस बफर के 3 सीवी जोड़ें (25 एमएम का Tris-एचसीएल, पीएच ७.५; ३०० एमएम का NaCl; १०० एमएम, २०० एमएम, ३०० एमएम या ४०० एमएम का imidazole) कॉलम और elute को रेफरेंस अंश 1, 2, 3, और 4 के रूप में जमा करें ।
      नोट: imidazole की सांद्रता बढ़ाने के क्रम में इन समाधानों को जोड़ा जाना चाहिए ।
    6. पंजाब के 2 एल में डायलिसिस eluted अंश (१३७ mM of NaCl, KCl के २.७ मिमी, एनए2HPO4, KH2पीओ4, पीएच ७.४) के 10 मिमी का उपयोग डायलिसिस टयूबिंग (१२.४ केडीए) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए की उपस्थिति की जांच GPC3-S-फैब द्वारा 12% एसडीएस-पृष्ठ और फिर द्वारा Coomassie नीला दाग ।
  3. आईजीजी-CH1 अपनत्व शुद्धि
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में आईजीजी-CH1 संबध राल के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण, और पहले पंजाबियों के साथ मोतियों को धो लें । फिर, चरण 3.2.6 के बाद GPC3-S-फैब युक्त dialyzed समाधान जोड़ें । 2 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रॉक
    2. 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक । ध्यान से एक और ताजा बर्फ ठंडा ट्यूब के लिए supernatant को दूर, और एक गुरुत्वाकर्षण कॉलम को राल हस्तांतरण ।
    3. स्तंभ के लिए वाशिंग बफर (पंजाब) के 10 सीवी जोड़ें, और इस रेफरेंस को वॉश अंश के रूप में इकट्ठा करें ।
    4. Tris पीएच ९.० (प्रत्येक eluted अंश के प्रति मिलीलीटर ०.१ मिलीलीटर) के 1 मीटर जोड़कर संग्रह ट्यूबों तैयार करते हैं । 3 सीवी रेफरेंस बफर के साथ Elute (glycine-एचसीएल का ०.१ मीटर, पीएच २.७), और eluted अंश इकट्ठा; दोहराएं 3 बार ।
    5. 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलिसिस ट्यूबिंग (१२.४ केडीए) का उपयोग कर पंजाब के 2 एल में eluted अंश डायलिसिस दो बार दोहराएँ.
    6. ultramicrospectrophotometer द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण (दाढ़ विलुप्त गुणांक: ९११०५ .1 A२८० = ०.६९ mg/L).

4. एसडीएस-पृष्ठ और पश्चिमी-सोख्ता विश्लेषण

  1. 5x एसडीएस लोड हो रहा है बफर में नमूना के एक 10 µ एल ले लो और अच्छी तरह से मिश्रण । 5 मिनट के लिए १०० ° c पर प्रोटीन मिश्रण उबाल लें ।
    1. 5x एसडीएस लोडिंग बफ़र तैयार करें: २५० mM of Tris-HCl, pH ६.८, 10% wt/vol एसडीएस, ०.५% wt/vol bromophenol blue, ५०% vol/vol ग्लिसरॉल, 5% vol/
  2. एक लोडिंग जेल (5%) और जुदाई जेल (12%) के साथ एक एसडीएस-पृष्ठ जेल तैयार के रूप में पहले वर्णित26,27,28।
  3. उबला हुआ प्रोटीन मिश्रण और प्रोटीन मार्कर के 10 µ एल लोड, और एसडीएस-पृष्ठ चलाते हैं ।
  4. Coomassie शानदार नीले समाधान के साथ 20 मिनट के लिए मिलाते हुए जेल दाग, और फिर दाग प्रदर्शन ।
  5. पश्चिमी सोख्ता के लिए, एक PVDF झिल्ली को स्थानांतरित करने के बाद, TBST के साथ झिल्ली ब्लॉक (Tris के 20 मिमी-एचसीएल, NaCl के १५० मिमी, ०.१% vol/20) + 5% wt/vol स्किम दूध 1 के लिए कमरे के तापमान पर ज जबकि मिलाते हुए ।
  6. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली मशीन (विरोधी अपने या विरोधी झंडा) 1 पतला: TBST में 2000 + 5% 1 एच के लिए दूध स्किम ।
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए TBST से धो लें, और 3 बार दोहराएं ।
  8. माध्यमिक एंटीबॉडी में झिल्ली मशीन (एचआरपी-विरोधी माउस एफसी एंटीबॉडी से जुड़े) 1 पतला: TBST में 2000 + 5% 1 एच के लिए दूध स्किम ।
  9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए TBST से धो लें, और 3 बार दोहराएं ।
  10. फिल्म प्रति HPR सब्सट्रेट के 1 मिलीलीटर जोड़ें, विकसित करने और छवियों को ले लो ।

5. जेल निस्पंदन विश्लेषण

  1. निंन स्तंभ का उपयोग करें: 24 मिलीलीटर के स्तंभ खंड; पंजाब पीएच ७.४ के Equilibration बफर; शीतोष्ण कक्ष में ०.५ मिलीलीटर की दर/ २०० µ की मात्रा का नमूना l
  2. निंनलिखित प्रोटीन की मात्रा और एकाग्रता का प्रयोग करें: ५०० १.२ मिलीग्राम/एमएल GPC3-एस-फैब के µ एल । 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक, और ले २०० µ एल लोड करने के लिए ।
  3. प्रोटीन मार्कर मात्रा और एकाग्रता के लिए, cytochrome सी के १०० µ एल ले लो (2 मिलीग्राम/१२.४ केडीए), १४० के µ एल के anhydrase (3 मिलीग्राम/एमएल, 29 केडीए), १४० µ एल के एल्ब्युमिन (10 एमजी/एमएल, ६६ केडीए) और २०० µ एल के शराब डिहाइड्रोजनेज (5 एमजी/एमएल, १५० केडीए) को एक-एक ट्यूब में. 30 मिनट के लिए २०,००० x g पर केंद्रापसारक, और ले २०० µ एल लोड करने के लिए ।
  4. प्रत्येक रन से पहले, ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर आसुत जल के कम से कम 2 CV के साथ धो/
  5. Equilibrate equilibration बफर (पंजाबियों, पीएच ७.४) के ंयूनतम 2 CV के साथ कॉलम ०.५ मिलीलीटर की एक प्रवाह दर/
  6. नमूने को लोड करने के लिए स्वचालित रूप से ०.५ मिलीलीटर/
  7. equilibration बफर के साथ Elute पर ०.५ मिलीलीटर/मिनट और पता लगाने में २८० और २१५ एनएम ।

6. फ्लो Cytometry एनालिसिस

  1. कल्चर द HepG2 (GPC3 positive), Hep3B (GPC3 पॉजिटिव), Huh7 (GPC3 पॉजिटिव), और MHCC-97H (GPC3 नकारात्मक) कोशिकाओं में १०० मिमी x 20 मिमी प्लास्टिक व्यंजन जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (DMEM), पेनिसिलिन (१०० FBS g/ml), और µ (५० streptomycin g/ml) के साथ ३७ ° c, 5% कं2।
  2. संस्कृति चो (GPC3 नकारात्मक) कोशिकाओं और चो/GPC3 कोशिकाओं पूर्ण लंबाई मानव GPC3 सीडीएनए (GPC3 सकारात्मक) बंदरगाह में १०० मिमी x 20 मिमी प्लास्टिक युक्त RPMI १६४० मध्यम 10% FBS के साथ बर्तन, पेनिसिलिन (१०० µ g/ml), और streptomycin (५० µ g/ml) पर ३७ ° c, 5% सह2.
  3. संस्कृति NK92/CD16 बंदरगाह में पूर्ण लंबाई मानव CD16 सीडीएनए (CD16 सकारात्मक) 25cm2 कुप्पी युक्त RPMI में 10% FBS के साथ मध्यम, पेनिसिलिन (१०० µ g/एमएल), और streptomycin (५० µ जी/एमएल) ३७ ° c, 5% सह2पर ।
  4. जब कोशिकाओं ७०-९०% धाराप्रवाह हैं, मध्यम त्याग और पंजाब के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें । 2-3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ०.२५% trypsin और मशीन की 1 मिलीलीटर जोड़ें (या जब तक कोशिकाओं को सतह से अलग करने के लिए शुरू) । trypsin बेअसर और धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए पूर्ण विकास के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. एक Neubauer hemocytometer का उपयोग कर सेल संख्या गिनती और Trypan नीले रंग से सेल व्यवहार्यता का पता लगाने ।
  6. प्रत्येक सेल लाइन के लिए 3 एक्स 106 कोशिकाओं को इकट्ठा । पंजाब के 1 मिलीलीटर + ०.२% BSA कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए जोड़ें । २०० x जी, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर दो बार दोहराने के केंद्रापसारक ।
  7. पंजाब के ०.३ मिलीलीटर जोड़ें + ०.२% BSA कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए, और हस्तांतरण १०० µ l (लगभग १,०००,०००) प्रत्येक 5 मिलीलीटर polystyrene राउंड-नीचे ट्यूब करने के लिए ।
    नोट: कृपया सुनिश्चित करें कि यहां से ट्यूबों के लिए सभी कदम बर्फ पर ठंडा रखा जाना चाहिए । एंटीबॉडी कक्ष सतह antigen करने के लिए बाइंडिंग है, जब जटिल internalize करने के लिए प्रारंभ होगा । इसे ठंडा रखने से प्रक्रिया काफी धीमी हो जाती है ।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी के 10 µ एल जोड़ें (GPC3-एस-फैब या मानव IgG1, अंतिम एकाग्रता 5 µ g/एमएल) हर ट्यूब के लिए, और 1 एच के लिए बर्फ पर मशीन ।
  9. पंजाब के 1 मिलीलीटर + ०.२% BSA को धोने के लिए जोड़ें, और २०० x g, 5 मिनट के लिए 4 ° c पर केंद्रापसारक तीन बार दोहराने ।
  10. पंजाब के १०० µ L में री-सस्पेंड + ०.२% BSA, और फिर माध्यमिक एंटीबॉडी के ०.५ µ एल जोड़ें (विरोधी मानव आईजीजी (एच + एल)-४८८, अंतिम एकाग्रता 10 µ जी/नोट: इस कदम से, कृपया कोशिकाओं को प्रकाश से रखें......
  11. पंजाब के 1 मिलीलीटर + ०.२% BSA को धोने के लिए जोड़ें, और २०० x g, 5 मिनट के लिए 4 ° c पर केंद्रापसारक तीन बार दोहराने ।
  12. मानक प्रोटोकॉल29के अनुसार प्रवाह cytometer द्वारा कक्षों का विश्लेषण करें । उत्तेजना के लिए एक ४८८ एनएम लेजर के साथ कोशिकाओं का अधिग्रहण ।

7. साइटोटोक्सिक परख

  1. ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार ।
    1. कल्चर HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC-97H, और चो कक्ष लाइनों के रूप में ६.१-६.५ चरणों में वर्णित है ।
    2. ०.५ × 105/mL के लिए कोशिकाओं को पतला, और प्लेट १०० µ l कोशिकाओं (५,००० कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से) पर ९६-अच्छी तरह से प्लेटों. Culture 6-8 h अनुलग्न करने के लिए कक्षों की अनुमति दें करने के लिए ।
  2. ह्यूमन पेरिफेरल ब्लड mononuclear सेल (PBMCs) तैयार करें ।
    1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पंजाब के एक बराबर मात्रा के साथ ताजा तैयार रक्त पतला । उदाहरण के लिए, पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ 10 मिलीलीटर रक्त पतला ।
    2. लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम से एक ताजा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 15 मिलीलीटर ले लो । लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम पर ट्यूब पक्ष के साथ धीरे से पतला रक्त हस्तांतरण ।
      नोट: ट्यूब ऊर्ध्वाधर रखो । लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम की सतह को न तोड़ें ।
    3. ३५ मिनट के लिए ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. धीरे ऊपरी प्लाज्मा परत को हटा दें, और प्लाज्मा-लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम अंतरफलक पर PBMCs युक्त सफेद रक्त परत ले ।
    5. पंजाबियों की डबल मात्रा के साथ PBMCs को पतला + 2% FBS । 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो + 2% FBS । 5 मिनट के लिए ४०० x g पर केंद्रापसारक । चरण ६.५ में वर्णित के रूप में कक्ष संख्याओं की गणना ।
  3. NK कोशिकाओं को तैयार करें ।
    1. 5 x 107 कोशिकाओं में से एक एकाग्रता पर PBMCs सस्पेंशन तैयार करें + 2% FBS, और उन्हें एक 5 मिलीलीटर polystyrene दौर-नीचे ट्यूब में जगह है ।
    2. ५० पर मानव NK सेल संवर्धन कॉकटेल जोड़ें µ एल/ मिश्रण अच्छी तरह से, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    3. NK सेल संवर्धन किट से चुंबकीय कणों resuspend, और अच्छी तरह से वे समान रूप से pipetting द्वारा निलंबित कर रहे है और सख्ती से अधिक से अधिक 5 बार सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण । सेल निलंबन के लिए १०० µ l/एमएल पर resuspend चुंबकीय कणों स्थानांतरण । मिश्रण अच्छी तरह से, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    4. पंजाब + 2% FBS जोड़कर २.५ मिलीलीटर की कुल मात्रा तक सेल सस्पेंशन को लाएं । ट्यूब में कोशिकाओं को धीरे से ऊपर और नीचे 2-3 बार pipetting द्वारा मिक्स । चुंबक में ट्यूब (एक टोपी के बिना) प्लेस । चुंबकीय मोती कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए नीचे बसा दो ।
    5. चुंबक निकालें । एक सतत गति में, ट्यूब पलटना, बंद एक नया ट्यूब में समृद्ध सेल निलंबन डालने ।
    6. चरण ६.५ में बताए अनुसार कक्ष संख्याओं को गिनना ।
  4. साइटोटोक्सिक प्रतिक्रिया सेट करें ।
    1. NK कोशिकाओं को पतला करने के लिए 5 × 105 कोशिकाओं/एमएल इसी संस्कृति माध्यम का उपयोग कर । एक ९६-well प्लेट पर चढ़ाया ट्यूमर कोशिकाओं को NK सेल निलंबन के १०० µ एल जोड़ें ।
    2. 30 µ g/mL, 3-गुना कमजोर पड़ने, 9 बिंदु (तीन दोहराने) की एक अंतिम एकाग्रता पर उच्चतम खुराक के साथ, विभिन्न सांद्रता पर GPC3-S-फैब के 10 µ एल जोड़ें ।
    3. ३७ ° c, 5% सह पर मशीन ७२ एच के लिए2 ।
    4. के बाद ७२ मशीन के एच, मध्यम निकालें, और DMEM मध्यम के १०० µ एल जोड़ने के 10 µ एल CCK8 एजेंट के एक अच्छी तरह से प्लेटों में ९६ अच्छी तरह से, और फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. CCK8 रिएजेंट जोड़ने के बाद 1, 2, 3, और 4 एच में ४५० एनएम पर प्लेट पढ़ें ।
    6. डेटा का विश्लेषण करें । (OD450 GPC3-एस-फैब + effect + ट्यूमर -OD450 मीडियम)/(OD450 ट्यूमर -OD450 मीडियम) × १००% और (OD450 GPC3-एस-फैब + ट्यूमर -OD450 मीडियम)/(OD450 ट्यूमर - OD450 मध्यम) × १००% । प्रभाव कोशिकाओं NK कोशिकाओं रहे हैं ।

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Representative Results

GPC3-एस-फैब शुद्धि

GPC3-S-फैब ई. कोलाई से एक दो कदम अपनत्व शुद्धि द्वारा शुद्ध किया गया था, पहले Ni-ंत्-agarose के साथ, आईजीजी-CH1 अपनत्व शुद्धि के बाद. दो कदम संबध शुद्धि के बाद, GPC3-S-फैब दो जंजीरों के साथ सजातीयता को शुद्ध किया गया 1:1 (चित्रा 2a) के करीब । दोनों VH-CH1-CD16 VHH और वीएल-cl polypeptides की उपस्थिति उनके विशिष्ट सी-टर्मिनल टैग, एंटी-वीएल-सीएल लगभग 25 केडीए के लिए, और विरोधी झंडा VH-CH1-VHH के लिए लगभग ३८ केडीए (आंकड़ा बी) के द्वारा पहचाना जा सकता है । दो कदम संबंध शुद्धि के बाद, ~ १.२ मिलीग्राम प्रोटीन SB संस्कृति के 1 एल से प्राप्त किया जा सकता है । आगे शुद्ध GPC3-एस-फैब, जेल निस्पंदन की विशेषता प्रदर्शन किया गया था । मानक मार्करों (चित्रा 2c) के आधार पर, GPC3-एस-फैब की पहचान एक समरूप मोनोमर के रूप में एक heterodimer के रूप में एक आणविक आकार के साथ लगभग ६३ केडीए (चित्रा 2c) के रूप में की गई.

GPC3-एस-फैब बाइंडिंग गतिविधियां

मूल्यांकन करने के लिए कि क्या GPC3-S-फैब पहचानता है GPC3-सकारात्मक कोशिकाओं और CD16-सकारात्मक कोशिकाओं, प्रवाह cytometry विश्लेषण GPC3-सकारात्मक जिगर कैंसर सेल लाइनों HepG2, Hep3B, Huh7, चो/GPC3 और GPC3-नकारात्मक जिगर कैंसर सेल लाइन का उपयोग कर आयोजित किया गया था, MHCC-97H, और चो कोशिकाओं । GPC3-S-फैब सभी GPC3-सकारात्मक कोशिकाओं को बांध सकता है, हालांकि कमजोर के साथ Hep3B के लिए बाध्यकारी (चित्र 3बी) और Huh7 कोशिकाओं (चित्रा3सी) से HepG2 करने के लिए (चित्राएक) और चो/GPC3 (चित्रा 2F) । कोई या ंयूनतम GPC3-नकारात्मक MHCC-97H और चो कोशिकाओं को बाध्यकारी (चित्रा 3 डी, 3E) मनाया गया । GPC3-S-फैब भी CD16 के लिए बाध्य कर सकता है-सकारात्मक कोशिकाओं, NK92/CD16 कोशिकाओं (चित्रा 3 जी) । इन परिणामों के अंय विरोधी GPC3 एंटीबॉडी30का उपयोग कर पिछले परिणामों के अनुरूप हैं, सुझाव है कि GPC3-एस-फैब विशेष रूप से GPC3-सकारात्मक कोशिका लाइनों और CD16-सकारात्मक कोशिकाओं को बांध कर सकते हैं ।

GPC3-एस-फैब के cytotoxicity का मूल्यांकन करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं GPC3-एस-फैब के विभिन्न सांद्रता के साथ ताजा अलग NK कोशिकाओं के साथ मशीन थे । NK कोशिकाओं के बिना, GPC3-S-फैब GPC3 अभिव्यक्ति की स्थिति (चित्रा 4) के बावजूद ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ कोई cytotoxicity था । NK कोशिकाओं की उपस्थिति में, GPC3-एस-फैब एक खुराक पर निर्भर तरीके से HepG2, Hep3B, और Huh7 कोशिकाओं के खिलाफ मजबूत cytotoxicity ट्रिगर, लेकिन GPC3-नकारात्मक MHCC-97H कोशिकाओं (चित्रा 4) पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया, सुझाव है कि cytotoxicity के GPC3-एस-फैब ट्यूमर सेल सतह पर GPC3 अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है ।

Figure 1
चित्र 1. GPC3-एस-फैब का निर्माण
(क) जीवाणु अभिव्यक्ति GPC3 का निर्माण-एस-फैब । निर्माण एक pelB संकेत अनुक्रम, एक मानव विरोधी GPC3 (GC33) VH-CH1-विरोधी CD16 VHH (भारी श्रृंखला), या एक वीएल-सीएल (प्रकाश श्रृंखला) होते हैं । प्रोटीन डिटेक्शन और शुद्धिकरण की सुविधा के लिए, एक फ्लैग टैग या एक His8 टैग को सी-टर्मिनस से जोड़ा गया था । (ख) सह-अभिव्यक्ति के बाद GPC3-एस-फैब के आरेख ।

Figure 2
चित्र 2. ई. कोलाई से GPC3-एस-फैब शुद्धि ।
(क) वाम फलक, के बाद नी-ंत् संबध क्रोमैटोग्राफी; दाहिने फलक के बाद, anti-आईजीजी-CH1 अपनत्व क्रोमैटोग्राफी; मीटर, आणविक वजन सीढ़ी; Coomassie नीला दाग । (ख) वाम फलक, के बाद नी-ंत् संबध क्रोमैटोग्राफी; दाहिने फलक के बाद, anti-आईजीजी-CH1 अपनत्व क्रोमैटोग्राफी; मीटर, आणविक वजन सीढ़ी; पाश्चात्य-सोख्ता. (ग) GPC3-एस-फैब के जेल निस्पंदन विश्लेषण । शीर्ष पैनल, मानक मार्करों; नीचे पैनल, GPC3-एस-फैब । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. GPC3-S-फैब पहचानता है GPC3 सकारात्मक कोशिकाओं और CD16-सकारात्मक कोशिकाओं ।
HepG2 के प्रवाह cytometry विश्लेषण (क), Hep3B (ख), Huh7 (ग), MHCC-97H (घ), चो (ङ), चो/GPC3 (च) और NK92/CD16 (छ) कोशिकाओं को प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया गया । लाल रेखा: केवल ट्यूमर कोशिकाओं; ग्रीन लाइन: isotype नियंत्रण, ट्यूमर सेल + मानव IgG1 + एंटी ह्यूमन आईजीजी (एच + एल)-४८८; ब्लू लाइन: ट्यूमर सेल + GPC3-एस-फैब + एंटी-ह्यूमन आईजीजी (H + L)-४८८ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. GPC3-एस-फैब GPC3-पॉजिटिव कैंसर कोशिकाओं की कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देता है ।
HepG2 (A), Hep3B (B), Huh7 (C), और MHCC-97H (D) के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में खुराक-निर्भर cytotoxicity परख प्रदर्शन किया गया । GPC3-एस-फैब की सांद्रता ०.००४५ µ g/ml से 30 µ g/ डेटा मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करने वाली त्रुटि पट्टियों के साथ triplicates का अर्थ है । ठोस वृत्त, केवल GPC3-एस-फैब; ठोस वर्ग, GPC3-एस-फैब + NK, NK कोशिकाओं (५०,००० प्रति well) और लक्ष्य कोशिकाओं (५,००० प्रति अच्छी तरह से). मिश्रण cytotoxicity माप से पहले ७२ ज के लिए मशीन थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम bsAbs, GPC3-एस-फैब, जो NK कोशिकाओं GPC3 सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं लक्ष्यीकरण की भर्ती कर सकते है के एक नए स्वरूप का निर्माण करने के लिए एक रणनीति पेश करते हैं । एस फैब एक विरोधी CD16 VHH11,12जोड़कर प्राकृतिक फैब प्रारूप पर आधारित है । bsAbs एफसी क्षेत्र के साथ तुलना में, GPC3-एस-फैब आसानी से एक बड़े पैमाने पर बैक्टीरिया की periplasm में उत्पादित किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल में वर्णित अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण रणनीति का उपयोग करके, हमने बड़ी मात्रा में घुलनशील और कार्यात्मक GPC3-एस-फैब प्राप्त किया । periplasmic अभिव्यक्ति की सुविधा के लिए, एक संकेत अनुक्रम pelB एन-टर्मिनस को ई. कोलाई17के periplasm करने के लिए प्रत्यक्ष स्राव करने के लिए जोड़ा गया था । कोशिका द्रव्य के विपरीत, cytoplasmic और बाहरी झिल्ली के बीच periplasmic अंतरिक्ष में अधिक ऑक्सीकरण वातावरण प्रोटीन तह और विधानसभा के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन की एक संख्या के साथ सुसज्जित है और इस तरह सही तह को बढ़ावा देता है और घुलनशीलता रिकॉमबिनेंट प्रोटीन्स16. हालांकि, प्रोटीन तह और ई. कोलाई में periplasm को निर्यात के लिए मशीनरी सीमित क्षमता है । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति अक्सर periplasm16में अघुलनशील उत्पाद के संचय में परिणाम । प्रोटीन की उच्च अभिव्यक्ति से बचने के लिए समय की एक छोटी अवधि में, कम IPTG (०.२ मिमी) और कम तापमान (16 डिग्री सेल्सियस) पौष्टिक माध्यम में लागू किया गया इस प्रोटोकॉल में अघुलनशील प्रोटीन के संचय से बचने के लिए । इस अध्ययन में, ~ १.२ मिलीग्राम प्रोटीन के माध्यम से 1 एल से प्राप्त किया गया था, पैदावार में सुधार कम 2 गुना पिछले काम करता है12के साथ तुलना में ।

प्रोटीन क्षरण से बचने के लिए, विभिन्न चरणों में GPC3-एस-फैब युक्त सभी अंशों को बर्फ पर रखना चाहिए । वीएल के सी-टर्मिनल पर उनके टैग के साथ-सीएल, नी-ंत्-agarose शुद्धि के लिए इस्तेमाल किया गया था । हालांकि, सिंगल नी-ंत्-agarose शुद्धि के लिए अवांछित प्रोटीन, जैसे कि ख़राब वीएल-सीएल प्रोटीन को दूर करने के लिए पर्याप्त नहीं है । समरूप heterodimeric GPC3-एस-फैब को शुद्ध करने के लिए दूसरा चरण, एंटी आईजीजी-CH1 संबध शुद्धिकरण, लागू किया गया । शुद्ध प्रोटीन उच्च शुद्धता और दो polypeptides के करीब था 1:1 (चित्रा 2a-बी) ।

जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी अपने आणविक आकार और आकार के आधार पर प्रोटीन की आणविक भार निर्धारित कर सकते हैं; शुद्धता की डिग्री का विश्लेषण; और निर्धारित करें कि क्या शुद्ध प्रोटीन एक मोनोमर, डिमर, या समुच्चय15से बना है । जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा, GPC3-एस-फैब लगभग ६३ केडीए की अपेक्षित आणविक आकार के साथ पहचाना गया था, जो GPC3-एस-फैब (चित्रा 2c) के heterodimerization के साथ एक मोनोमर के रूप में है ।

प्रवाह cytometry निर्धारित कर सकते है कि क्या एक एंटीबॉडी अपने प्रतिजन कोशिका झिल्ली पर बांध कर सकते हैं, पारंपरिक पश्चिमी सोख्ता और एलिसा, जो केवल प्रतिजन-एंटीबॉडी बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के साथ तुलना में । प्रवाह cytometry विश्लेषण के द्वारा, GPC3-एस-फैब कोशिका झिल्ली पर GPC3 को मांयता दी, GPC3 फैब moiety सुझाव कार्यात्मक था । प्रवाह cytometry विश्लेषण करते समय, यह एंटीबॉडी जोड़ने के बाद बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर कदम के सभी रखने के लिए महत्वपूर्ण है । एंटीबॉडी कक्ष सतह antigen करने के लिए बाइंड कर देता है, जब एंटीबॉडी-antigen जटिल internalization प्रारंभ होगा । इसे ठंडा रखने से internalization की प्रक्रिया काफी धीमी हो जाती है ।

PBMCs और NK कोशिकाओं कुशलता से मानव परिधीय रक्त लिम्फोसाइट पृथक्करण माध्यम का उपयोग कर, चुंबकीय-सक्रिय सेल छंटाई रणनीतियों द्वारा पीछा द्वारा अलग थे । GPC3-S-फैब GPC3 सकारात्मक कोशिकाओं के खिलाफ शक्तिशाली cytotoxicity दिखाया जब लक्ष्य कोशिकाओं (ट्यूमर कोशिकाओं) को NK कोशिकाओं का अनुपात 10:1 था, और लक्ष्य कोशिकाओं को NK कोशिकाओं का अनुपात 50:1 से 5:1 के लिए भिंन हो सकता है ।

सारांश में, GPC3-एस-फैब, जो एक सूक्ष्मजीवों अभिव्यक्ति प्रणाली में उत्पादित किया जा सकता है, ट्यूमर के खिलाफ bsAbs के कार्यात्मक स्वरूपों बनाने के लिए एक नया अवसर प्रदान करता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम गुआंग्डोंग प्रांत (पीआर चाइना) (2016A050503028) के अनुसंधान एवं विकास योजना द्वारा वित्तीय रूप से समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaking incubator Thermo Fisher MAXQ 4000
Shaking incubator Zhicheng ZWYR-D2402
Centrifuge Cence GL-10MD
Centrifuge Beckman coulter Avanti j-26S XPI
Centrifuge eppendorf 5810R
Ultraviolet spectrophotometer Thermo Fisher Nanodrop
Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus Mini-PROTEAN® Tetra Bio-rad
Trans-blot apparatus Criterion Bio-rad
Imaging system Bio-rad chemidoc tm XRS+
Fast Protein Liquid chromatogram GE Healthcare AKTA avant
GF column GE Healthcare 28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Flow Cytometer Beckman coulter FC500
Centrifuge eppendorf 5702R
Envision plate reader TECAN Infinite F50
Anti His-tag eBioscience 14-6657-82
anti-Flag-tag Sigma F1804
anti-human(H&L)-488 A11013 Invitrogen
Anti-mouse IgG HRP-linked antibody Cell Signaling 7076S
Ni-NTA-Agarose Tribioscience TBS9202-100
IgG-CH1 affinity resin Thermo Fisher 194320005
Ficoll-Plaque Plus GE Healthcare 17-1440-03
NK cell enrichment kit Stemcell 19055
Magnet Stemcell 18000
CCK8 kit Dojindo CK04
DMEM Gibco C11995500CP
RPMI-1640 Gibco C11875500CP
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F2442
Trypsin Gibco 15050-057
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Cell culture
Standard marker Sigma Aldrich MWGF200 Gel filtration
Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG) VWR chemicals VWRC0487-100G
Dialysis tubing Sigma Aldrich D0655-100FT
Knanamycine VWR VWRC0408-100G
Ampicillin VWR VWRC0339-100G
Tryptone Thermo Fisher LP0042B
Yeast Extract Thermo Fisher LP0021B
NaCl Sangon Biotech A100241
Trizma base Sigma Aldrich T6791-1KG
EDTA Sigma Aldrich V900106
Glycine aladdin A110752-500g
KCl aladdin P112134-500g
MgCl Sigma Aldrich V900020
Agar Sangon Biotech A505255-0250
Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4) VWR 7778-77-0
Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4) VWR 7558-79-4
2-Mercaptoethanol VWR 60-24-2
Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF) VWR 329-98-6
Lysozyme Sigma Aldrich L6876-25G
Coomassie Brilliant Blue R250 VWR VWRC0472-50G
Bromophenol blue Sangon Biotech A500922-25G
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR VWRC0332-100G
Glycerol Sigma Aldrich V900122
100mm x 20mm plastic dish Corning 430167
25cm2 flask Corning 430639
96 well cell culture cluster Corning 3599
Sucrose Sangon Biotech A610498-0005
CHO the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences GNHa 3
MHCC-97H the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences SCSP-528
HepG2 the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences TCHu 72
Huh7 the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences TCHu182
Hep3B the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences TCHu106
NK92 ATCC CRL2408

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References

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एक GPC3-लक्ष्यीकरण Bispecific एंटीबॉडी, GPC3-एस-फैब, शक्तिशाली Cytotoxicity के साथ
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Wang, Y., Liu, J., Pan, H., Xing, J., Wu, X., Li, Q., Wang, Z. A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (137), e57588, doi:10.3791/57588 (2018).

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